Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng

Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng      Trường ĐH Nơng Lâm Hồ Chí Minh Bộ môn Công Nghệ Sinh Học -o0o - CHỦ ĐỀ SEMINAR: SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VŨ BẢO MSSV:06126009 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 Page 1    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    B/ ĐẶT VẤN ĐỀ: Ngày nay, với phát triển xã hội nói chung y học nói riêng đem lại nhiều phương pháp việc phòng ngừa, phát chữa trị bệnh người lẫn thú Có nhiều phương pháp nghiên cứu, thử nghiệm đem lại nhiều ứng dụng to lớn Một phương pháp xuất thời gian gần sử dụng kháng thể đơn dịng việc chuẩn đốn điều trị bệnh Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-mAb) sử dụng rộng rãi nghiên cứu y sinh học bản, chẩn đoán bệnh, điều trị bệnh bệnh nhiễm trùng ung thư Kháng thể đơn dịng cơng cụ quan trọng nhiều nhà nghiên cứu sử dụng nhiều nghiên cứu họ mang lại nhiều tiến mặt y tế Với vai trò quan trọng tiềm vô to lớn việc chuẩn đốn, điều trị bệnh Kháng thể đơn dịng cần phải nghiên cứu nhiều hơn, sâu để khai thác hết lợi ích mà đem lại Tuy nhiên, việc hiểu kháng thể đơn dòng cịn nhiều hạn chế lĩnh vực mẻ đặc biệt nước ta Trong viết này, hy vọng mang lại cho bạn vài thông tin kháng thể đơn dòng, mà cụ thể sản xuất thu nhận kháng thể đơn dịng Thơng qua viết này, tơi hy vọng đem lại cho bạn nhìn nhất, tổng quát kháng thể đơn dòng Hy vọng viết sở, tiền đề để từ thuận lợi bước tiếp việc tìm hiểu, nghiên cứu kháng thể đơn dòng bạn sau Page 2    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    C/TỔNG QUAN: C.I/Khái quát kháng thể đơn dòng: C.I.1/Kháng thể (antibody) : Kháng thể phân tử protein sản xuất những tế bào lympho B có kích ứng đáp ứng miễn dịch kháng nguyên thể vật chủ Có hai loại kháng thể : - Kháng thể đa dòng: Tập hợp kháng thể đặc hiệu với epitope khác kháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với epitope kháng nguyên :đáp ứng gọi đa dòng.  - Kháng thể đơn dòng : nhận biết epitope kháng nguyên cho sẵn Tất kháng thể đơn dịng dịng giống hệt sản xuất dòng tương bào.  Các kháng thể có tính kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên kích ứng tạo chúng Đây sở phản ứng bảo vệ thể chống lại tác nhân gây bệnh kỹ thuật chuẩn đoán miễn dịch Sự tạo thành kháng thể phụ thuộc vào chất kháng nguyên (protein, polysaccharide, … ), phương pháp gây miễn dịch (chất bổ trợ, đường xâm nhập, số lần xâm nhập,… ) phụ thuộc vào thể vật chủ (tình trạng sức khỏe, tình trạng miễn dịch, dinh dưỡng, tuổi,… ) Các tế bào lympho B tế bào sản xuất kháng thể Mỗi dòng tế bào lympho B sản xuất loại kháng thể tương ứng với yếu tố kháng Page 3    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    nguyên mà chúng nhận diện Do kháng nguyên có nhiều yếu tố kháng nguyên khác nên đáp ứng miễn dịch tạo thành nhiều loại kháng thể khác nhau, trường hợp ta có kháng thể đa dịng (polyclonal antibody) C.I.2/Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb ) kháng thể tạo thành từ tế bào lympho B có nguồn gốc từ dòng tế bào lympho B Kháng thể đơn dòng sử dụng rộng rãi nghiên cứu y sinh học bản, chẩn đoán bệnh, điều trị bệnh bệnh nhiễm trùng ung thư Sản xuất mAb yêu cầu phải tiến hành gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường chuột, sau thu nhận tế bào sản xuất kháng thể từ lách dung hợp tế bào với tế bào ung thư (như từ tế bào u tủy myeloma ) để làm cho chúng trở nên giống đặc điểm tế bào u tủy, điều có nghĩa chúng phát triển phân chia vô hạn định Một khối tế bào hợp gọi khối tế bào lai (hybridoma), tế bào sản xuất mAb Sự phát triển hybridoma đòi hỏi việc sử dụng động vật Việc thay không dùng động vật không phổ biến Một nhà nghiên cứu, người muốn nghiên cứu protein đặc biệt phân tử khác, chọn dòng tế bào hybridoma để sản xuất mAb mà phản ứng cách mạnh mẽ với protein phân tử Các tế bào phải phát triển nhân lên để tạo thành dòng tế bào mà sản xuất mAb mong muốn Có hai phương pháp để phát triển tế bào này: tiêm chúng vào khoang màng bụng chuột dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro Khi tiêm vào chuột, tế bào hybridoma nhân lên sản xuất dịch lỏng (bệnh cổ trướng) bụng Dịch lỏng có chứa nồng độ cao kháng thể Sản xuất kháng thể phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột rẻ tiền, dễ thực hiện, quen thuộc Tuy nhiên, tích tụ nhiều dịch lỏng hybridoma bệnh ung thư độc, chuột trải qua đau đớn nguy hiểm Nếu quy trình sản xuất gây đau đớn nguy hiểm với động vật, nên điều chỉnh để tìm kiếm lựa chọn thay Một giải pháp thay gia tăng số lượng tế bào hybridoma môi trường nuôi cấy tế bào Kĩ thuật yêu cầu số kiến thức chuyên môn, phương tiện, thiết bị đặc biệt, tốn mặt tiền bạc nhiều thời gian Hiện Page 4    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    có số nghiên cứu đáng kể kĩ thuật nuôi cấy tế bào in vitro cho phát triển hybridoma, phương pháp tốn hơn, nhanh hơn, sản xuất kháng thể nồng độ cao so với phương pháp trước C.II/ Quá trình sản xuất kháng thể đơn dịng: Quy trình sản xuất kháng thể tóm tắt sơ đồ bên : C.II.1/ Sự hình thành tế bào lai hybridoma: ( Dòng tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng ) Sự sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm: phương pháp in vivo, in vitro kết hợp hai phương pháp Trước sản xuất kháng thể phương pháp in vivo in vitro, tế bào lai mà làm nhiệm vụ sản xuất kháng thể tạo Các bước sản xuất tế bào lai mô tả sơ đồ bên Sản xuất kháng thể đơn dòng-những tế bào sản xuất sử dụng động vật, thường sử dụng chuột Phương pháp cung cấp dịng tế bào có khả sản xuất loại kháng thể giai đoạn dài Một khối u từ dòng tế bào”bất tử” gọi hybridoma Khơng có phương pháp sản xuất tế bào lai hybridima mà không sử dụng động vật Gần đây, kỹ thuật in vitro cho phép sản xuất phần kháng thể gắn Page 5    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    kháng nguyên bên tế bào, kỹ thuật thử nghiệm kết quả, chức chưa chắn (Frenken cộng 1998) Nó thay đổi nhiều mặt di truyền kháng thể đơn dịng chuột sản xuất với trình tự gen người, giảm tính sinh miễn dịch kháng thể đơn dòng định trước cho việc điều trị bệnh người Trước đến phương pháp hybridoma, nhà nghiên cứu sản xuất huyết kháng thể đa dòng Một số lương lớn nhu cầu động vật chủng ngừa không làm tế bào sản xuất kháng thể, u cầu phải lặp lặp lại động vật dùng để thu nhiều kháng thể Phát triển kỹ thuật tế bào lai hybridoma làm giảm số lượng lớn động vật (chuột, thỏ, …) cần thiết để sản suất kháng thể Bước 1: gây miễn dịch chuột lựa chọn chuột hiến để sản xuất tế bào lai hybridoma Chuột gây miễn dịch với kháng nguyên chuẩn bị cho việc tiêm nhũ hóa kháng nguyên với tá chất Freund tá chất khác miếng mỏng dạng gel đồng có chứa kháng nguyên Những tế bào nguyên vẹn, bao gồm màng vi sinh vật thường dùng kháng nguyên Ở hầu hết tất phịng thí nghiệm, chuột sử dụng để sản xuất kháng thể mong muốn Thường thì, chuột gây miễn dịch 2-3 tuần lần phương pháp gây miễn dịch biến đổi nhà nghiên cứu Khi hàm lượng kháng thể tạo đủ lớn Chuột có đáp ứng miễn dịch mạnh gây mê thu lấy lách để chọn lọc dòng tế bào lympho chuyên biệt dùng cho việc lai với tế bào ung thư myeloma Bước 2: lựa chọn chuột để sản xuất kháng thể Sau vài tuần gây miễn dịch, mẫu máu thu từ chuột để đo lượng kháng thể huyết Một vài kỹ thuật nhân đạo phát triển để thu tập thể tích nhỏ máu từ chuột (Loeb and Quimby 1999) Độ chuẩn kháng thể huyết xác định nhiều kỹ thuật khác nhau, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) phép chẩn đoán số lượng DNA tế bào( flow cytometry) Nếu độ chuẩn kháng thể cao, hợp thực Nếu độ chuẩn kháng thể thấp, chuột tăng lên phản ứng đủ được, việc xác định mẫu máu lặp lặp lại nhiều lần Khi độ chuẩn kháng thể đủ cao, chuột thường tăng cách tiêm kháng nguyên khơng có tá dược màng bụng tĩnh mạch (theo tĩnh mạch đuôi) ngày trước hợp tuần sau lần gây miễn dịch Sau đó, chuột bị giết lách chúng lấy để sản xuất tế bào lai hybridoma phương pháp in vitro Bước 3: Chuẩn bị tế bào ung thư tủy xương Myeloma Sự dung hợp tế bào lách sản xuất kháng thể, mà có thời gian tồn giới hạn, với tế bào ung thư tủy (myeloma), kết tế bào lai hybridoma có khả phát khơng giới han Page 6    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    Tế bào ung thư tủy xương myeloma tế bào mà nuôi cấy với 8azaguanine để đảm bảo tính nhạy cảm chúng với hypoxanthine-aminopterinthymidine (HAT) môi trường chọn lọc dùng sau dung hợp tế bào Một tuần trước dung hợp tế bào, tế bào ung thư tủy xương myeloma cho phát triển 8-azaguanine Các tế bào phải có khả sống cao phát triển nhanh chóng Mơi trường HAT cho phép tế dung hợp tồn thời gian dài môi trường nuôi cấy Bước 4: Sự hợp tế bào ung thư tủy xương myeloma với tế bào lách chuột gây miễn dịch: tế bào lách đơn từ chuột gây miễn dịch hợp với tế bào ung thư tủy xương myeloma chuẩn bị trước Sự dung hợp hoàn thành polyethylene glycol, chất có khả làm tan màng tế bào, tạo điều kiện cho tế bào lympho sản xuất kháng thể với tế bào myolema kết hợp lại với tạo thành tế bào lai hybridoma Một ý bước thứ có tế bào dung hợp phát triển môi trường chọn lọc đặc biệt Những tế bào sau phân phối tới đĩa có 96 giếng chứa đựng tế bào tiếp liệu thu từ việc rửa màng bụng chuột nước muối Tế bào tiếp liệu tin để cung cấp yếu tố phát triển để đẩy mạnh phát triển tế bào lai hybridoma (Quinlan and Kennedy 1994) Việc chuẩn bị thương mại kết từ việc thu gom môi trường giúp cho phát triển nuôi cấy tế bào chứa đựng yếu tố phát triển có sẵn để sử dụng thay cho tế bào tiếp liệu thu từ chuột Nó sử dụng cho đại thực bào xuất phát từ tủy xương chuột tế bào tiếp liệu (Hoffman and others 1996) Bước 5: Tạo dòng dòng tế bào lai hybridoma “pha lỗng có giới hạn” phát triển ổn định dòng sản xuất dịch tràn ổ bụng Điểm bước này, nhóm nhỏ tế bào lai hybridoma từ đĩa 96 giếng phát triển nuôi cấy mô theo sau lựa chọn cho việc gắn kết kháng nguyên phát triển phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột với việc tạo dòng thời gian trễ Tạo dòng “ pha lỗng có giới hạn” thời điểm đảm bảo phần lớn giếng chứa tối đa dòng đơn Phần lớn đánh giá cần thiết giai đoạn lựa chọn tế bào lai hybridoma có khả phát triển chống lại tất tế bào dung hợp không thành công nhờ vào thưa thớt không phù hợp nuôi cấy in vitro nồng độ pha loãng cao Trong vài trường hợp, kháng thể tiết độc tố để tế bào yếu ớt trì mơi trường in vitro Việc tối ưu hóa phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột giai đoạn cứu vãn tế bào Ngồi , trải qua nhiều giai đoạn ngắn trình phát triển phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột sản xuất dòng tế bào trễ in vitro giai đoạn phương pháp in vivo chứng tỏ sức mạnh gia tăng (enhanced hardiness) tối ưu sản xuất kháng thể (Ishaque and AlPage 7    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    Rubeai 1998) Theo nguyên tắc đề công bố đến cộng nghiên cứu việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột cách (Jackson anh Fox 1995) Việc lựa chọn mơi trường phát triển có chứa chất ức chế aminopterin, trở ngại đường tổng hợp nhân tạo Vì vậy, tế bào phải sử dụng đường vòng để tổng hợp acid nucleic, đường mà có khuyết điểm dịng tế bào ung thư tủy xương để tế bào sản xuất kháng thể đơn dịng bình thường dung hợp Bởi tế bào ung thư tủy xương myeloma tế bào sản xuất kháng thể không phát triển mình, có tế bào lai phát triển Sơ đồ quy trình tạo tế bào lai hybridoma Page 8    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    C.II.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vitro: Một thuận lợi việc sử dụng kháng thể đơn dòng huyết miễn dịch đa dòng tiềm sẵn có gồm: hầu hết số lượng lớn kháng thể đơn dòng đặc hiệu epitope riêng biệt (một phần phân tử antigen mà có nhiệm vụ tương tác đặc hiệu kháng nguyên kháng thể) Thơng thường, kháng thể đơn dịng tìm thấy môi trường phát triển nuôi cấy tế bào lai hybridoma phương pháp in vitro dịch tràn ổ bụng từ chuột tiêm tế bào lai hybridoma Kháng thể đơn dịng làm tinh khiết từ hai nguồn thường sử dụng môi trường dịch tràn ổ bụng Trong phương pháp in vitro nên sử dụng cho mục đích sản xuất kháng thể đơn dịng việc có lý thiết thực Nhiều dụng cụ sẵn có thị trường làm phát triển cho nuôi cấy in vitro Những dụng cụ cần thiết phải thay đổi để tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động chúng, số lượng người trực tiếp sử dụng máy cần thiết phải đào tạo, phức tạp quy trình hoạt động, nồng độ cuối kháng thể đạt được, chi phí, điều tiết thể tích dịch Chi phí trang thiết bị nên xem xét giá thành phương pháp sản xuất in vitro Mỗi dòng tế bào lai hybridoma phản ứng khác môi trường sản xuất in vitro Trong phần mô tả phương pháp sản xuất in vitro có sẵn thảo luận lợi ích hạn chế phương pháp Sơ đồ tóm tắt bước sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vitro: Page 9    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    C.II.2.1/Phương pháp nuôi cấy khối mô: Phương pháp đơn giản để tiếp cận sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vitro gia tăng nuôi cấy tế bào lai hybridoma thành khối làm kháng thể đơn dịng từ mơi trường ni cấy Huyết bò mang thai đươc sử dụng hầu hết mơi trường ni cấy mơ có chứa khoảng 50 µg/ml globulin miễn dịch bị Việc sử dụng huyết môi trường nuôi cấy tế bào lai hybridoma giải thích cho lượng lớn globulin miễn dịch diện dịch nuôi cấy (Darby and cộng tác viên 1993) Để tránh gây bẩn với globulin miễn dịch bị, vài cơng ty phát triển cơng thức mơi trường khơng có huyết để làm nguồn phát triển dòng tế bào lai hybridoma (Federspiel cộng tác viên 1991, Tarleton Beyer 1991, Velez cộng tác viên 1986) Trong hầu hết trường hợp, tế bào lai hybridoma phát triển 10% huyết thai bê (FCS) thích nghi khooảng thời gian bốn giai đoạn ( 8-12 ngày) để phát triển 1% FCS mơi trường khơng có FCS Tuy nhiên, thích nghi kéo dài 3-5% trường hợp tế bào lai hybrydoma khơng thích nghi với mơi trường FCS thấp Sau thích nghi, việc nuôi cấy tế bào cho phép nuôi theo thông thường, sử dụng bình thót cổ ni cấy mơ điều kiện phát triển chuẩn khoảng 10 ngày Page 10    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    Kháng thể đơn dịng sau thu hoạch từ mơi trường Phương pháp đề cập sản xuất kháng thể đơn dòng nồng độ đặc thù 20 µg/ml Những phương pháp mà làm tăng nồng độ cách loại bỏ oxy môi trường gia tăng khả phát triển tế bào mật độ phát triển tế bào gia tăng nồng độ kháng thể đơn dòng (Boraston cộng tác viên 1984, Miller cộng tác viên 1987) Một số phương pháp sử dụng spinner flasks roller bottles để giữ môi trường nuôi cấy lưu thơng khơng đổi cho phép chất dinh dưỡng chất khí phân phối mơi trường ni cấy thể tích lớn (Reuveny cộng 1986, Tarleton Beyer 1991) Túi mà khơng khí qua được, phát triển gần đây, gia tăng độ loại bỏ khơng khí cách cho phép khơng khí xun qua vách vật chứa mơi trường Tất phương pháp gia tăng khả sản xuất, nồng độ kháng thể giữ nguyên tầm vài micrograms mililit ( Heidel 1997, Peterson Peavey 1998, Vachula cộng 1995) Hầu hết ứng dụng nghiên cứu yêu cầu nồng độ kháng thể đơn dòng từ 0,1-10 mg/ml, cao nhiều so với nồng độ kháng thể đơn dịng mơi trường ni cấy khối mô (Coligan cộng sự) Nếu kháng thể không tinh đủ cho ứng dụng nghiên cứu, phương pháp lọc theo ngưỡng trọng lượng phân tử thấp dựa vào ly tâm ép khơng khí dùng để gia tăng nồng độ kháng thể đơn dịng Như lựa chọn, ni cấy mơ bề mặt tinh khiết cách cho qua cột lực protein A protein G, kháng thể đơn dịng sau tách rửa từ cột nồng độ thích hợp cho hầu hết ứng dụng (Akerstrom cộng 1985, Peterson Peavey 1998) Tuy nhiên, globulin bò hay globulin miễn dịch khác diện môi trường ni cấy làm bẩn kháng thể đơn dịng chuẩn bị Cả hai bước đặc thực ngày với thời gian thực tối thiểu Tóm lại, phương pháp ni cấy khối mô công nghệ tương đối đơn giản để thực hiện, có giá thành đầu tư thực tương đối thấp, có thời gian từ lúc bắt đầu đến kết thúc khoảng tuần, điều gần giống với phương pháp dịch tràn ổ bụng, làm cho sản xuất số lượng kháng thể đơn dịng so sánh với việc sản xuất phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột Điều bất lợi phương pháp thể tích lớn mơi trường ni cấy mơ phải xử lý, nồng độ kháng thể đơn dòng thu thấp ( khoảng vài microgam mililit) vài kháng thể đơn dòng bị biến đổi suốt q trình đặc tinh (Lullau cộng 1996) Trên thực tế, chọn lọc kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt động bị giảm sút 42% một nồng độ chuẩn Page 11    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    khác quy trình tinh khiết khác (Underwood Bean 1985) Trên hình ảnh về: spinner flasks Trên hình ảnh : roller bottles Trên hình ảnh flasks C.II.2.2/ Những hệ thống màng bán thấm: Như đề cập trên, phát triển tế bào lai hybridoma với mật độ cao q trình ni cấy, kết tạo lượng lớn kháng thể đơn dịng thu từ mơi trường ni cấy việc sử dụng rào cản, hollow fiber (tạm dịch màng sợi rỗng) màng với ngưỡng trọng lượng phân tử thấp (10.000-30.000 kD), thực vài thiết bị cho Page 12    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    phép tế bào phát triển mật độ cao (Evans Miller 1988, Falkenberg cộng 1995, Jackson cộng 1996) Những thiết bị gọi hệ thống màng bán thấm Mục đích hệ thống cô lập tế bào kháng thể đơn dòng ngăn nhỏ phân cách rào cản từ ngăn lớn có chứa mơi trường ni cấy Sự ni cấy bổ sung nhiều yếu tố để làm tối ưu hóa phát triển tế bào lai hybridoma (Jaspert cộng 1995 ) Chất dinh dưỡng phế phẩm tế bào khuếch tán dễ dàng từ bên sang bên rào cản đạt trạng thái cân với thể tích lớn, tế bào kháng thể đơn dòng giữ lại thể tích nhỏ (1-15 ml hệ thống màng đặc thù cuộn sợi rỗng nhỏ (small hollow-fiber cartridge) Việc sử dụng cạn kiệt môi trường bể chứa lớn lớn thay mà khơng làm hư hại đến tế bào kháng thể đơn dòng, vậy, tế bào kháng thể đơn dịng thu hoạch độc lập môi trường phát triển Sự phân tách tế bào thành ngăn nhỏ phân cách màng khiến cho đạt nồng độ kháng thể đơn dịng so sánh với nơng độ kháng thể đơn dòng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột Hai hệ thống màng bán thấm sẵn có là: mini- PERM (Unisyn Technologies, Hopkinton, MA) CELLine (Integra Bioscience, Ijamsville, MD) Celline có hình dạng sử dụng tương tự T Flask chuẩn phân tách thành hai ngăn màng bán thấm màng mà chất khí thấm qua với mặt sát bên đến ngăn tế bào Mini-PERM có dạng tương tự có hình trụ trở thành đơn vị vận động mà chức làm lăn fermentor liên tục phép phân phối chất khí chất dinh dưỡng Gía bắt đầu cho việc khởi cơng đơn vị khoảng 300$-800$ đòi hỏi phải có tủ ấm CO2 Thuận lợi hệ thống màng bán thấm thu nồng độ cao kháng thể sản xuất thể tích tương đối thấp huyết thai bê diện môi trường cung cấp trao đổi chéo khơng quan trọng globulin miễn dịch bị ngăn tế bào Một điểm bất lợi kháng thể đơn dịng bị nhiểm bẩn sản phẩm tế bào chết Điều cản trở kĩ thuật nhỏ phương pháp nuôi cấy khối mô khơng có vấn đề phịng thí nghiệm mà làm ni cấy mơ Tồn kháng thể đơn dòng sản xuất từ hệ thống màng nằm tầm từ 10-160 mg theo tài liệu Unisyn Trong bioreactor có màng sợi rỗng, mơi trường tiếp tục bơm qua vòng bao gồm cuộn sợi rỗng (a hollow-fiber cartridge), hệ thống ống mà chất khí thấm qua để thêm oxy vào môi trường, nguồn cung cấp môi trường Cuộn sợi rỗng (The hollow-fiber cartridge) bao gồm nhiều thớ sợi chạy xuyên suốt buồng mà có chứa tế bào lai hybridoma phát triển mật độ cao Những sợi có tính bán thấm có vai trị tương tự hệ thống màng bioreactor với sợi rỗng (the hollow-fiber bioreactor) tạo để mang lại kết tống số lên tới 500 mg kháng thể đơn dòng nhiều Page 13    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    Việc khởi công kiểu hệ thống thường tiêu tốn 1200 $ Vì lý đó, bioreactor với hệ thống sợi rỗng (hollow-fiber bioreactor ), dùng người ta cần số lượng lớn kháng thể đơn dòng Reactor với hệ sợi rỗng (The hollow-fiber reactor) sử dụng thành cơng nhiều phịng thí nghiệm độc lập ( Jackson cộng 1996, Knazek cộng 1972, Peterson Peavey 1998) Nếu nhà nghiên cứu đầu tư thời gian chi phí lớn, vài quan nịng cót thiết bị chức năng, phủ, phịng thí nghiệm có hợp đồng thương mại sản xuất kháng thể đơn dịng từ tế bào lai hybridoma Ví dụ như: phịng thí nghiệm có hợp đồng thương mại điển hình tiêu tốn 11$/mg để sản xuất 1.000 mg với reactor với hệ sợi rỗng(hollow-fiber reactors) (Chandler, 1998) Gần đây, vài hội thảo, diễn đàn, số công bố thảo luận việc sử dụng số phương pháp thay để thay chuột để sản xuất kháng thể đơn dòng (Center for Alternatives to Animal Testing OPRR/NIH 1997, Marx cộng 1997, de Geus Hendriksen, eds 1998) Những kết luận họ cho phương pháp thay cung cấp cách đầy đủ việc tạo hầu hết kháng thể đơn dòng cần thiết tổ chức nghiên cứu Những phương pháp in vitro sản xuất kháng thể đơn dịng thích hợp nhiều tình huống, đáp ứng cho nhà nghiên cứu để đưa biện hộ có tính khoa học cho việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột Nó sỏ IACUC để đánh giá biện hộ nhà nghiên cứu để tán thành phản đối việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột Trên hình ảnh hollow fiber C.II.3/ Sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vivo: (phương pháp dịch tràn ổ bụng) Page 14    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    C.II.3.1/Lý sử dụng phương pháp in vivo: Mặc dù kĩ thuật in vitro sử dụng nhiều 90% sản xuất kháng thể đơn dòng, phải thừa nhận số trường hợp phương pháp in vitro khơng có hiệu Bởi đặc điểm tế bào lai hybridoma thay đổi nhu cầu sản xuất kháng thể đơn dịng đa dạng, kỹ thuật in vitro khơng thích hợp hầu hết trường hợp, việc sử dụng chúng trở ngại nghiên cứu, đặc biệt số lượng lớn kháng thể đơn dòng tách hiệu đặc biệt điều trị bệnh Trong số trường hợp, sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vitro khơng đáp ứng mục đích khoa học cơng trình nghiên cứu Cụ thể sau: * Một số dịng tế bào lai hybridoma khơng thích ứng tốt điều kiện in vitro * Kháng thể đơn dòng từ dịch tràn ổ bụng chuột cần thiết cho thí nghiệm mà kháng thể đơn dịng sử dụng chuột * Dòng tế bào lai hybridoma chuột cống không tạo bệnh cổ trướng cách có hiệu chuột cống, thường thích ứng điều kiện in vitro, thường tạo bệnh cổ trướng chuột nhắt khơng có khả miễn dịch * Giai đoạn làm tinh khiết gây biến tính protein làm suy giảm hoạt động kháng thể * Những điều kiện huyết có huyết nồng độ thấp cung cấp đủ lượng kháng thể đơn dịng cho số mục đích , đánh giá vacxin việc chống lại sinh vật lây nhiễm * Phương pháp nuôi cấy mang lại tập hợp mAb IgG mà glycozyl vị trí khác từ thu hoạch từ dịch tràn ổ bụng chuột, ảnh hưởng đến khả kháng nguyên – ràng buộc chức sinh học quan trọng * Khi tế bào lai hybridoma sản xuất mAb có chứa tác nhân lây nhiễm, nấm men hay nấm, tế bào thường phải thông qua chuột C.II.3.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vivo: Để sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp dịch tràn bụng, chuột tiêm dòng tế bào lympho chuyên biệt vào thể chúng Tuy nhiên, để gia tăng đáp ứng sản xuất kháng thể, chuột kích hoạt hai mũi tiêm có chứa pristane vào xoang bụng, cách tuần Pristane có tác dụng gây nên phản ứng viêm hạt tác động đến q trình tích dịch ổ bụng Liều thích hợp pristane khoảng từ 0,1-0,5 ml Hai tuần sau chuột tiêm pristane, tiếp tục tiêm vào xoang bụng chuột khoảng 106 tế bào lai hybridoma Việc tiêm tế bào lai hybridoma vào xoang bụng chuột gây nên cục bướu kích thích tiết dịch tràn ổ bụng làm cho bụng chuột phình to lên Sau bị tiêm tế bào lai hybridoma, chuột sống nhiều 20 ngày Page 15    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    Dịch tràn ổ bụng thu phương pháp chọc dò vào khoảng tuần sau chuột tiêm tế bào lai hybridoma Lượng dịch tràn ổ bụng thu chuột vào khoảng 10 ml Hàm lương kháng thể thu phương pháp dịch tràn ổ bụng cao, khoảng từ 2-10 mg kháng thể / ml dich tràn Sơ đồ tóm tắt sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột: Một số hình ảnh phương pháp chọc dị: C.III/Sự thuận lợi khó khăn phương pháp in vitro in vivo: Page 16    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dịng    Những thuận lợi khó khăn phương pháp in vitro phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột việc sản xuất mAb nêu bật phần Cần lưu ý có khả phương pháp in vitro đáp ứng 90% tổng nhu cầu cho mAb Một số thuận lợi bất lợi có liên quan tới vấn đề bảo vệ động vật người khác đề cập đến kinh tế sản xuất mAb Như lưu ý thuộc phần có tiêu đề “ phương pháp in vivo in vitro cho việc sản xuất thương mại mAb”, phương pháp in vitro chi phí từ ½ đến lần phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột Một số yếu tố nguyên nhân việc sản xuất in vitro trở nên tốn phí lao động thiết bị mà thường tế bào lai hybridoma sản xuất mAb phương pháp in vitro Nếu nhà nghiên cứu phải sử dụng vài loại môi trường dụng cụ khác nhau, diễn ra, chi phí lao động tăng nghiên cứu bị trì hỗn (Moro cộng 1994; Stoll cộng 1996; Butler Huzel 1995) C.III.1/Những thuận lợi khó khăn phương pháp in vitro: C.III.1.1/Những thuận lợi phương pháp in vitro: - Phương pháp in vitro giảm việc sử dụng chuột giai đoạn sản xuất kháng thể (như sử dụng chuột nguồn tế bào tiếp liệu việc sản xuất kháng thể tiến hành) - Những phương pháp in vitro thường phương pháp lựa chọn cho cho sản xuất quy mô lớn nghành cơng nghiệp dược phẩm dễ dàng nuôi cấy tạo sản phẩm so với việc sử dụng động vật cân nhắc kinh tế - Phương pháp in vitro tránh nhu cầu để trải qua quy trình động vật để sản xuất kháng thể đơn dòng - Phương pháp in vitro tránh làm giảm cần thiết kinh nghiệm nhân viên phịng thí nghiệm việc thao tác với động vật - Phương pháp in vitro sử dụng hệ thống màng bán thấm sản xuất mAb có nồng độ thường cao phương pháp dich tràn ổ bụng tránh tạp nhiễm từ thể chuột C.III.1.2/ Khó khăn phương pháp in vitro: - Một số tế bào lai hybridoma không phát triển tốt môi trường nuôi cấy bị môi trường nuôi cấy - Phương pháp in vitro thường yêu cầu việc sử dụng FCS (huyết thai bê) Việc sử dụng phương pháp in vitro để sản xuất kháng thể đơn dòng thường yêu cầu sử dụng FCS, mối quan tâm từ quan điểm chăm sóc động vật - Giảm lực miễn dịch, thay đổi chức sinh học kháng thể - Nói chung, ni cấy bề mặt chứa đựng mAb ( 0,002-0.01) mililit môi trường so với phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột Lưu ý hệ thống màng bán thấm phát triển để sản xuất nồng độ kháng thể đơn dịng so sánh với nồng độ quan sát dịch tràn ổ bụng chuột Page 17    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    - Trong phương pháp nuôi cấy khối mô, nồng độ mAb có xu hướng thấp bề mặt Những bước đặc cần thiế làm thay đổi lực kháng thể, làm biến tính kháng thể , tăng thời gian chi phí Nồng độ thích hợp mAb thu hệ thống màng bán thấm - Hầu hết lô mAb sản xuất phương pháp in vitro có sử dụng màng bị ô nhiễm với tế bào lai hybridoma chết sản phẩm tế bào lai hybridoma chết Vì vậy, yêu cầu phải làm sớm - mAb sản xuất phương pháp in vitro sản xuất kháng thể có ràng buộc lực so vói kháng thể thu phương pháp dịch tràn ổ bụng - Phương pháp nuôi cấy in vitro thường tốn phương pháp dịch tràn ổ bụng quy mô sản xuất mAb nhỏ trung bình ( Hendriksen de Leeuw 1998; Jackson cộng 1996; Peterson Peavey 1998; Marx 1998; Lipman 1997) - Số lượng mAb sản xuất phương pháp in vitro bị giới hạn số lượng thiết bị mà thực có sẵn - The Food and Drug Administration (FDA) ước tính để chứng minh tương đương mAb sản xuất phương pháp in vitro mAb trước sản xuất phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột tốn khoảng bảo trợ 2-10 triệu đô la (Stein 1998; Maxim 1998) - Yêu cầu cao trang thiết bị trình độ chun mơn, khó triển khai rộng rãi C.III.2/ Thuận lợi khó khăn phương pháp in vivo: C.III.2.1/ Thuân lợi phương pháp in vivo: - Phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột thường sản xuất mAb nồng độ cao mà thường không yêu cầu thủ tục đặc thêm mà gây biến tính kháng thể làm giảm hiệu - Nồng độ cao mAb mong muốn dịch tràn ổ bụng chuột tránh ảnh hưởng chất gây ô nhiễm dịch nuôi cấy in vitro số lượng tương đương mAb sử dụng - Phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột tránh cần thiết phải hóa kháng thể sản xuất phương pháp nuôi cấy mô - Đơn giản, dễ triển khai rộng rãi C.III.2.2/ Khó khăn phương pháp in vivo: - Phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột kéo theo việc tiếp tục sử dụng chuột yêu cầu phải theo dõi ngày - mAb sản xuất phương pháp in vivo chứa nhiều protein chuột nhựng chất gây ô nhiễm khác mà yêu cầu phải làm - Phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột tốn đòi hỏi sử dụng chuột suy giảm miễn dịch Page 18    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng    - Phương pháp in vivo nguyên nhân gây đau đớn nguy hại đến chuột C.IV./ Thu nhận kháng thể đơn dòng: Việc thu hoạch kháng thể đơn dịng thực theo nhiều kỹ thuật khác tùy thuộc vào mục đích sử dụng chất kháng thể Một số kỹ thuật sau thường sử dụng thu hoạch kháng thể đơn dòng : - Ngưng tụ ammonium sulfat nồng độ 50% - Sắc ký trao đổi ion - Sắc ký lọc gel - Sắc ký lực Tùy theo yêu cầu sử dụng, kháng thể đơn dịng thu nhận tình trạng khơng cần tinh khiết phương pháp ly tâm phân đoạn Trong trường hợp cần kháng thể tinh khiết sử dụng phương pháp sắc ký cột lực với protein A, protein G Tuy nhiên trường hợp khó tránh khỏi tạp nhiễm kháng thể bò kháng thể khác diện môi trường nuôi cấy Cần lưu ý kháng thể đơn dòng dễ bị biến tính nên sử dụng phương pháp ảnh hưởng đến chất lượng kháng thể đơn dịng Khi nghiên cứu khơng u cầu cao tinh khiết kháng thể đơn dịng mà u cầu tính lực hoạt tính sinh học quan trọng phương pháp dịch tràn ổ bụng sản xuất kháng thể đơn dòng có nhiều ưu điểm C.V/Sản xuất kháng thể đơn dịng quy mơ lớn: Khoảng 25,000 mAb liệt kê danh ba Linscott (1998-1999) Hầu hết sản xuất số lượng nhỏ (ít 0.1g) cho mục đích nghiên cứu liên quan (de Geus Hendriksen 1998) Tuy nhiên, số thu cơng thương mại địi hỏi quy mô sản xuất khác Về mặt thương mại xem xét quy mô sản xuất từ 0.1-10 g nhỏ, 10-100 g vừa, 100g lớn Sự sản xuất quy mơ thương mại nói chung thực sản xuất mAb cho ba muc đích: chuẩn đoán, điều trị , nghiên cứu, phát triển tác nhân điều trị bệnh *Sản xuất kháng thể đơn dịng cho mục đích chuẩn đốn điều trị: Một lượng kháng thể đơn dòng cần thiết tầm quan trọng vài yếu tố chi phí, thời gian quay vịng, tn thủ quy định phụ thuộc vào mục đích Nghành cơng nghiệp chuẩn đốn đầy cạnh tranh liên quan tới chi phí, thời gian quay vòng, yêu cầu quản lý Sự sản xuất mAb nghành công nghiệp chuẩn đốn thường quy mơ nhỏ trung bình quy mô lớn Nghành công nghiệp điều trị liên quan nhiều nghành cơng nghiệp chuẩn đốn với chi phí thời gian quay vịng, quy mơ sản xuất từ trung bình lớn Nghành cơng nghiệp điều trị quy định cao nhạy cảm với cấu trúc quy định chi phí pháp lý cao vài thay đổi Page 19    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dịng    thủ tục Nghành cơng nghiệp công nghệ sinh học mà phát triển tác nhân trị bệnh sản xuất mAb quy mô nhỏ đến trung bình Nó liên quan với chi phí sản xuất so với nghành cơng nghiệp chuẩn đốn liên quan nhiều đến nghành công nghiệp điều trị, thời gian quay vịng quan trọng Vì vậy, địi hỏi phải quay vịng nhanh chóng Việc sản xuất mAb thương mại yêu cầu nhiều mẻ nuôi cấy lớn sản xuất số lượng lớn chuột Nó địi hỏi nỗ lực đáng kể giai đoạn chuẩn bị sản xuất để đảm bảo dòng tế bào ổn định, sản xuất thương mại số lượng thích hợp kháng thể ổn định, sản xuất sản phẩm không bị nhiễm bẩn Sản xuất thương mại bao gồm việc xây dựng sở chất lượng cao cho việc sản xuất in vivo in vitro chế biến kháng thể Có nhu cầu cho việc kiểm soát chất lượng phận đảm bảo chất lượng để đáp ứng yêu cầu thực tiễn sản xuất tốt để yêu cầu cho sản xuất thương mại Việc sản xuất lô thử nghiệm cần thiết để đảm bảo sản phẩm trước sản xuất D/ KẾT LUẬN: Kháng thể đơn dòng (mAb) thuốc thử quan trọng sử dụng nghiên cứu y sinh, chẩn đoán bệnh điều trị số bệnh bệnh nhiễm trùng ung thư Kháng thể đơn dòng sản xuất dịng tế bào dịng vơ tính thu từ động vật gây kích ứng miễn dịch với yếu tố kháng nguyên nghiên cứu Để sản xuất kháng thể đơn dòng mong muốn, tế bào phải phát triển hai cách sau: Bằng cách tiêm vào xoang bụng chuột thích hợp chuẩn bị ni cấy mơ tế bào bình cổ Xa xử lý dịch tràn ổ bụng chuột ni cấy mơ bề mặt cần thiết để thu kháng thể đơn dòng độ tinh khiết nồng độ theo yêu cầu Phương pháp sử dụng chuột thường quen thuộc, hiểu rõ, phổ biến rộng rãi nhiều phịng thí nghiệm; Nhưng chuột yêu cầu giám sát cẩn thận để giảm đến mức tối thiểu tổn thương nguy hại đến chuột số dòng tế bào gây cách tích tụ mức dịch lỏng (dịch tràn ổ bụng ) ổ bụng xâm phạm nội tạng Phương pháp nuôi cấy mô chấp nhận rộng rãi quen thuộc phổ biến rộng rãi phương pháp sử dụng chuột sản xuất lượng kháng thể cần thiết với dòng tế bào, phương pháp nuôi cấy đắt, tốn thời gian, thường khơng có khả sản xuất lượng kháng thể cần thiết mà khơng có kĩ đáng kể thao tác Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy trở nên rẻ hơn, quen thuộc hơn, rộng rãi E/TÀI LIỆU THAM KHẢO: - Công nghệ sinh học thú y – PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải – Nhà xuất Nông Nghiệp Page 20    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dịng    - Cơng nghệ sinh học chăn nuôi gia súc – PGS.TS Trần Thị Dân – Nhà xuất Nông Nghiệp - Monoclonal antibody production – A report of the committee on methods of producing monoclonal antibodies Institute for Laboratory Animal Research Natinal Research Council - www.google.com.vn Page 21    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... trình sản xuất kháng thể đơn dịng: Quy trình sản xuất kháng thể tóm tắt sơ đồ bên : C.II.1/ Sự hình thành tế bào lai hybridoma: ( Dòng tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng ) Sự sản xuất kháng thể đơn. .. luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng? ?   C.II.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng phương pháp in vitro: Một thu? ??n lợi việc sử dụng kháng thể đơn dòng huyết miễn dịch đa dòng tiềm sẵn... luanvanchat@agmail.com Sản xuất thu nhận kháng thể đơn dòng? ?   - Phương pháp in vivo nguyên nhân gây đau đớn nguy hại đến chuột C.IV./ Thu nhận kháng thể đơn dòng: Việc thu hoạch kháng thể đơn dịng thực