Tiểu luậnthu nhận và tinh chế enzyme

Trường ĐH Nông Lâm Tp HCM Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH CHỦ ĐỀ: GVHD: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM MSSV: 06126031 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 MỤC LỤC Y Z I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME Định nghĩa .2 Tính chất enzyme II THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ Một số lưu ý tách chiết tinh chế enzyme .3 Thu nhận enzyme thô .5 III TINH SẠCH ENZYME Các phương pháp tủa protein/enzyme Sự thẩm tách Sắc ký Phương pháp dùng chất hấp phụ 14 IV KẾT TINH PROTEIN ENZYEM 15 V ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME 15 1.Xây dựng đường biểu diễn độ hòa tan 15 Phân tách protein/enzyme điện di gel .16 Phương pháp siêu ly tâm 17 Kỹ thuật khối phổ 18 VI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 18 VII TỔNG KẾT 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 ĐẶT VẤN ĐỀ Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng q trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi sinh vật Ðó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men Cho đến đầu kỷ XIX nhà khoa học khái quát trình lên men tượng phổ biến sống vai trò qua trọng enzyme chuyển hố chất q trình lên men Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triển mạnh mẽ qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD Thực tế có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp ứng dụng Đến việc nghiên cứu enzyme bước vào giai đoạn với kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng phân tử enzyme ưu việt dạng tự nhiên Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, nông nghiệp, hóa học… Do vậy, q trình thu nhận tinh protein/enzyme giữ vai trò quan trọng không ngừng cải tiến để đạt độ tinh cao để phụ vụ cho người TÓM TẮT Enzyme chất protein thu nhận từ ba nguồn: động vật , thực vật, vi sinh vật Do đa dạng cấu trúc, tính chất, chức năng…Nên việc thu nhận tinh chế enzyme phức tạp trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất loại enzyme mục tiêu, phải trải qua nhiều công đoạn khác tùy loại enzyme Tuy vậy, trình tinh enzyme ứng dụng phương pháp sau: thu dịch chiết (cơ học, lý , hố), tủa ( muối, dung mơi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, bước tinh sắc ký ( sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết tinh kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn độ hồ tan, điện di (điện di chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm, khối phổ, I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME Định nghĩa Enzyme (E) protein có khả xúc tác cho phản ứng hoá học với mức đặc hiệu khác nhiệt độ tương đối thấp E có tất tế bào sống, chất xúc tác sinh học (CNSH Enzyme Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã) Trong phản ứng E xúc tác phân tử lúc bắt đầu trình gọi chất (substrate), E biến đổi chúng thành phân tử khác E có hiệu suất xúc tác lớn tất chất xúc tác hữu vơ khác E khơng xúc tác phản ứng thể sống , mà sau tách khỏi hệ thống sống chúng giữ hoạt tính xúc tác điều kiện định.Có 4000 phản ứng sinh hóa xúc tác enzym [1] E có tính đặc hiệu cao, nghĩa E tác dụng hay số S (cơ chất ) định nhiệt độ áp suất bình thường LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 Tính chất enzyme Enzym có chất protein nên có tất thuộc tính lý hóa protein Đa số E có dạng hình cầu khơng qua màng bán thấm có kích thước lớn Tan nước dung môi hữu phân cực, không tan ete dung môi không phân cực Không bền tác dụng nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính Mơi trường axít hay bazơ làm E khả hoạt động Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH mơi trường mà tồn dạng: cation, anion hay trung hòa điện Enzym chia làm hai nhóm: E cấu tử (chỉ chứa protein) pepsin, amylase E hai cấu tử (trong phân tử cịn có nhóm khơng phải protein) ™ Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác E, định tính đặc hiệu • Coenzym: Phần protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, chất hợp chất hữu phức tạp II THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ Một số lưu ý tách chiết tinh chế E Như nói trên, E chất xúc tác sinh học có chất protein khơng ổn định Trong điều kiện bất lợi không bền, dễ bị biến tính (denaturation) bị hoạt độ Do đó, làm việc với E phải ý tránh làm hoạt tính Thông thường phần lớn E hoạt động vùng pH trung tính gần trung tính (pH = 7+ 2) Vì yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính E Nhiệt độ cao chất oxy hoá chất khử, …cũng số nguyên nhân gây biến tính E Tuy nhiên E khác nhạy cảm với tác nhân gây biến tính khác Vì thế, tách tinh E cần tiến hành nhiệt độ thấp từ 0oC đến 5oC Đối với E khơng bền q trình tinh tiến hành nhiệt độ thấp từ -5oC đến -20oC Trong trường hợp người ta sử dụng hỗn hợp lạnh nước đá với CO2 nước đá với muối NaCl, chí dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc… Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3oC Nước đá : H2SO4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 oC Tiến hành tinh nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E tác dụng phân giải E proteolytic có mặt dịch chiết Đối với nhiều E bổ sung chất ức chế E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế thủy phân E quan tâm Các E LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 proteolytic phân thành lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease chứa kim loại Trên sở lớp protease này, người ta chia chất ức chế E thành lớp tương ứng chất ức chế hai E protease serine protease cystein sử dụng nhiều phổ biến hai E Đối với số E nhạy cảm với phân cắt proteolytic, loại chất ức chế sử dụng Bảng 2: Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng tách chiết, tinh protein/E Chất ức chế Nồng độ thời gian hiệu Dung môi pha dung dịch gốc nồng độ chất ức chế 0,1-1mM Leupeptin 10-100μM Iodoacetic acid hay iodoacetate (IAA) 10-100μM 100mM vài H2O Ethylene diamine 1-2mM, tetra acetic acid lâu dài (EDTA) Pepstain A E proteolytic bị ức chế 100mM Phenyle methyl sulphonyl fluoride (PMSF) vài Điều kiện thời gian bảo quản dạng dung dịch gốc 2-3 tháng nhiệt độ Protease serine ethanol phòng isopropanol 10mM H2O 500mM pH 8,0 1μM 1mM vài tanol Protease kiểu trypsin tuần 4oC số kiểu o tháng -20 C protease cystein Chỉ chuẩn bị trước Protease cystein dùng Protease chứa kim 6-12 tháng nhiệt loại (trừ loại chứa độ phịng Ca2+ phải dùng EGTA) 3-4 tháng -20oC Một số protease acid Bổ sung yếu tố làm bền (như CaCl2 hay MgCl2 với nồng độ 2-5mM, glycerol 1020% ), chất chống oxy hoá (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…) Xây dựng quy trình đơn giản cách để bảo tồn hoạt tính E Đối với số E bền nhiệt dùng bước xử lý nhiệt (70-80oC, vòng 15-30 phút) xử lý acid (pH 3-4) E bền acid nhằm hạn chế tác dụng phân cắt proteolytic, vừa loại bỏ số protein không mong muốn Tránh tạo bọt khí nhiều E biến tính mặt phân cách hai pha nước khí Để tránh bọt khí Chỉ sử dụng gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng kim loại nặng làm hoạt tính E LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 Thu nhận enzyme a Chọn nguồn nguyên liệu Việc điều chế chúng phương pháp hố học khó khăn tốn kém, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học Có nguồn nguyên liệu sinh học: ™ Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dày, tim…dùng để tách E thuận lợi Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, số E khác Ví dụ: Renin tách từ dày bê nghé làm đông sữa sản xuất fomat ™ Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều quan dự trữ hạt, củ, Cơ quan dự trữ giàu chất nhiều E chuyển hố chất Ví dụ: hạt thầu dầu có nhiều lipase, hạt đậu nành có nhiều E urease, papain thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ phận dứa, fixin tách từ dịch ép thân Ficus… Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật sản xuất chế phẩm E với quy công nghiệp nhược điểm: - Chu kỳ sinh trưởng chúng dài - Nguồn nguyên liệu không cải tạo - Đây nguồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm dùng để sản xuất sản phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực ™ Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E có nhiều ưu điểm bật, nguồn nguyên liệu vô tận, chủ động tạo được.Chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn (16-100 giờ) Hệ E vi sinh vật vô phong phú Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm rẻ E vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vịng 24 vi sinh vật chuyển hố lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng thể chúng b Thu dịch chiết E thô Các E nội bào khơng có khả qua màng tế bào màng cấu trúc tế bào chứa chúng Do đó, để chiết rút E nội bào điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa E chuyển chúng dung dịch Biện pháp học nghiền tế bào với cát thuỷ tinh hay cát thạch anh, làm đồng hoá thiết bị đồng hố (homogenizator) Đối với mơ thực vật ta thường thái nhỏ mẫu cho trương nước để tăng hiệu phá vỡ tế bào Cịn mơ động vật chiết E người ta cần cắt bỏ mô liên kết Đối với E cấu tử ( nhân, microsome, ty thể, lyosome…) tế bào, để thu nhận dịch chiết E ta dùng yếu tố vật lý hố học khác sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt, dùng E (lyoyme, mutanolizin), dung môi hữu (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…), chất detergent Các chất có tác dụng tốt phá vỡ cấu tử tế bào bào quan thường có chứa nhiều mỡ Sau phá vỡ cấu trúc tế bào, E chiết nước cất, dung dịch đệm muối trung tính * Một số lưu ý chiết rút E + Chiết rút kết tủa E nhiệt độ thấp ( - 5oC ) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 + Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly thêm vào để tăng hiệu chiết rút E NaCl, ZnCl2, CaCl2… * Lưu ý: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt chất có màu làm ảnh hưởng đến việc làm xác định hoạt lực E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu Dịch chiết cô đặc nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, bổ sung tác nhân gây kết tủa protein/E để loại số chất không mong muốn, sau hồ tan E thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp III TINH SẠCH ENZYME Thu nhận E dựa độ hồ tan, kích thước, điện tích liên kết lực Hỗn hợp chứa E phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, giai đoạn dựa đặc tính định để thu E tinh Sau bước thu nhận ta phải tiến hành xác định hoạt tính nồng độ E để đảm bảo hiệu tinh Các kỹ thuật tinh thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký Các phương pháp tủa protein enzyme Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa muối, tủa dung môi hữu thay đổi pH dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt Trong tủa muối sử dụng nhiều a Tủa muối Khả hòa tan protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên protein, pH, nhiệt độ, nồng độ muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan protein tăng nhẹ (salting in) Tuy nhiên, nồng độ muối cao, tính tan protein giảm mạnh (salting out), loại protein kết tủa nồng độ định Lượng muối loại bỏ thơng qua bước thẩm tách Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau Cohn: log S = B - KI Trong S: độ hịa tan protein B: số (tùy thuộc vào chức protein, pH nhiệt độ) K: số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp lượng muối có dung dịch) I: cường độ ion muối Hình1 Độ tan theo nồng độ muối (http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html) Khả tủa protein phụ thuộc vào chức protein nồng độ muối, khơng phụ thuộc vào nhiệt độ độ pH Ngồi ra, trọng lượng phân tử protein tăng lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống Hiệu tủa protein/E anion muối khác khác nhau, xếp theo thứ tự giảm dần sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 Để tủa E từ dịch chiết thơ ta dùng số muối trung tính, thường dùng ammonium sulfatese (NH4)2SO4, có độ hồ tan cao nước (720g/l,nhiệt độ 25oC), làm tác dụng E chí cịn có tác dụng làm bền E Ngồi ammonium sulfatese có khả tủa chọn lọc protein, giúp loại số protein không mong muốn khỏi dịch chiết Thường dùng hai dạng bột bão hòa + Dạng bột: Người ta cho vào dịch chiết E Cách cho ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu E Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo hịa tan muối X: khối lượng (NH4)2SO4 0,515 x V (S2-S1) S1: độ bão hoà cho trước X(g) = S2: độ bão hồ cần thiết 1-0,272S2 + Dịch bão hịa: Cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết E độ (NH4)2 SO4 không tăng dột ngột Sau kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích tạo kết tủa hồn tồn (ở phương pháp dùng dung mơi hữu khơng cần để lâu) Kết lấy cách ly tâm lọc qua phễu Buckner Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca làm bền (CaCl2 Ca(COOH)2) Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích Thời gian thẩm tích thường 24 - 28h, nước thay nhiều nhanh tốt Có thể loại muối cách lọc qua gel sephadex G25 dẫn suất dextran Ưu phương pháp tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm hoạt độ E Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, E có trọng lượng phân tử lớn xuống trước Giai đoạn làm đông khô thành bột trắng Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà khơng qua trạng thái lỏng Ví dụ: Protease nấm mốc dễ bị kết tủa 70% (NH4)2 SO4 bão hịa hồn tồn, cịn amylase mầm lúa bị kết tủa 50% độ bão hòa dung dịch muối Ðiều nói lên tính kết tủa lựa chọn (NH4)2SO4 cao muối khác ++ 100 ( S1-S2 ) V (ml) = 1-S2 V: thể tích (NH4)2SO4 S1: độ bão hồ cho trước S2: độ bão hoà cần thiết * Lưu ý sử dụng muối ammonium sulfatese + Cho muối vào dung dịch E cách từ từ, đồng thời khuấy để tránh tăng nhanh cục nồng độ muối dẫn đến tính kết tủa chọn lọc, chí làm hoạt tính E + Sử dụng muối ammonium sulfatese nhiều thời gian cần phải ly tâm tốc độ cao nhiệt độ thấp để tách protein tủa b Tủa dung môi hữu Khi thêm dung môi hữu vào môi trường, số điện mơi tăng lên, khả hịa tan protein giảm, tạo kết tủa Tuy nhiên, dung mơi hữu lại có lực với bề mặt kỵ nước phân tử protein Kết chúng làm biến tính protein suốt q trình tủa Do đó, tủa, nên sử dụng dung môi hữu nồng độ thấp, trừ số dung môi như: – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) ethanol sử dụng nồng độ cao Ethanol hay aceton thường dùng để tủa protein cho mục đích tinh Sự kết tủa có tính chọn lọc phần, nghĩa protein khác tủa nồng độ khác dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80% (v/v) trở lên) Sau LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 dung môi loại cách cho bay chân khơng hay chí khơng khí Phương pháp tiến hành nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống) Dùng dung mơi hữu tiến hành tách phân đoạn 0oC đến – 20 oC, có tác dụng tốt đến độ ổn định protein E Khi có kết tủa, ý lấy nhanh kết tủa khỏi dung môi tách dùng máy ly tâm Phương pháp có lợi khơng cần loại muối, có nhược điểm hay có màu Ví dụ: Hình 2: Mức tinh hiệu suất thu hồi protease có dịch trích từ ruột cá Basa sử dụng tác nhân kết tủa khác (Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM) c Tủa phương pháp điểm đẳng điện Khi pH môi trường thay đổi, mức độ tủa protein thay đổi + pH thấp, protein tích điện dương nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton) + pH cao, protein tích điện âm nhóm carbocyl phân tử protein bị proton (mất H+) + Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein khơng tích điện Điều làm giảm tính tan protein protein khơng cịn khả tương tác với mơi trường, đó, phân tử protein tách khỏi môi trường Hiện tượng giải thích phương trình Cohn Đồ thị biểu diễn độ hòa tan protein khác thay đổi theo pH Hình 3: Tỷ lệ protein tủa theo pH (http://sosnick.uchicago.edu/precpph.html ) Phương pháp thường dùng cho protein LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 đậu nành (có pI= 4.6) d Dùng nhiệt Ngồi dùng nhiệt để loại bỏ protein E tạp khỏi dịch chiết E Tuy nhiên phương pháp đuợc dùng E bền với nhiệt Sự thẩm tách Để loại bỏ muối khoáng loại đường tạp chất cóphân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel sephadex Cách làm thẩm tích sau: cho dung dịch E vào túi colodion cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đặt túi vào nước cất dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn) Màng cellophane màng bán thấm, có kích thước lỗ cho chất có phân tử nhỏ xuyên qua vào dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Còn lại màng chất protein có phân tử lớn Hình 4: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 kết tủa protein Đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M Túi cellophane Sắc ký Sắc ký phương pháp phân tách quan trọng sinh học phân tử thích hợp với nhiều loại hợp chất sản phẩm tinh sử dụng định lượng định tính Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động mẫu cần phân tách Tùy vào loại mẫu cần phân tách ta lựa chọn loại sắc ký nguyên liệu cho pha tĩnh pha động.Bốn phương pháp ứng dụng nhiều tinh E là: o Sắc ký lọc gel dựa vào kích thước phân tử (size exclusion chromagraphy) o Sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích phân tử (ion exchange chromagraphy) o Sắc ký lực dựa vào lực phân tử với loại phân tử khác (affinity chromagraphy) o Sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước phân tử có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy) Hình5: Hai phương pháp sắc ký A: Sắc ký trao đổi ion, dựa vào tích điện protein B: Sắc ký phân loại kích thước, dựa vào kích thước protein LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 a Sắc ký trao đổi ion Nguyên tắc: dựa vào điện tích thực E điểm pH định (trừ điểm đẳng điện) ta phân tách hỗn hợp protein Pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử mục tiêu mang điện tích trái dấu với chúng Gel trao đổi ion tổng hợp cách gắn nhóm chức tích điện lên chất cellulose, sephadex, sepharose, molselect…có loại gel trao đổi ion: Trao đổi anion (anionit) trao đổi cation (cationit) Một số nhóm chức tích điện dương DEAE (diethyaminoethyl), QAE (quaternary aminoethy)…Hoặc tích điện âm CM (carboxyl methyl), SP (sulphoropyl)…Tuỳ theo nhóm chức tích điện mà chúng trao đổi ion trái dấu với nhóm chức, ví dụ: DEAE trao đổi ion tích điện âm (-), CM hay SP ion trao đổi tích điện dương (+) Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ái lực liên kết giứ protein/E phụ thuộc vào mức độ tích điện phân tử mẫu chúng đẩy rửa chiết (eluted) khỏi gel nhờ thay đổi muối hay pH mơi trường Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích ngồi cột theo độ lớn điện tích Sắc ký trao đổi ion thường dùng bước tinh để sơ phân tách protein khác nhằm thu nhỏ thể tích mẫu việc tủa protein dung mơi hữu hay ammonium sulfate cịn nhiều bất tiện Hình6: Minh họa sắc ký trao đổi ion Ví Hình 7: Minh họa chế protein hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm ion dương tương tác với (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay ion âm tương tác với hạt hạt thay ion dương tương tác với protein dụ: Mẫu E 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 urease đậu nành sau tinh phương pháp tủa phân đoạn sunfatamon qua thẩm tích đối nước qua cột trao dổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH7 1/15M, gradient muối NaCl nồng độ từ – 1M Hình7: Sắc ký đồ DEAE-Cellullose Hình 8: kết điện di sau bước tinh Kết điện di cho thấy, hiệu tinh kết tách phân đoạn qua cột sắc ký cao, loại bỏ gần tồn protein tạp, có vạch sau chạy sắc ký urease đậu nành (theo tài liệu nghiên cứu) Kết luận thí nghiệm: urease đậu rựa (jackbean) loại enzymheterogeneous, urease dậu nành (Glycine max) homogeneous.(Nghiên cứu thu nhận, tinh urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán cơng Tơn Ðức Thắng-Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7-2006) b Sắc ký lọc gel Nguyên tắc: dựa vào khác kích thước hình dạng phân tử lượng E có hỗn hợp để tách chúng ra, dựa mức độ di chuyển khác phân tử hệ thống lưới phân tử gel sắc ký Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide Sephadex, Sepharose, molselect Bio-gel loại gel phổ biến thị trường có sẵn hạt có lỗ với đường kính chuẩn 100µm (0.1mm) Những phân tử nhỏ bên lẫn hạt, phân tử lớn bên ngồi hạt Vì vậy, phân tử có kích thước lớn cột chảy nhanh trước Phân tử có kích thước trung bình, vào bên hạt rời khỏi cột vị trí giữa; cịn phân tử nhỏ phải qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sau Hình 9: Hình minh hoạ sắc ký lọc gel 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [Thu nhận tinh chế enzyme] October 24, 2009 Các sephadex có ký hiệu khác từ G10 dến G200 phục vụ trongviệc lọc phân tử cho phép chất có trọng luợng phân tử khác lọtvào nguỡng sau đây: Các loại sephadex G 10 G 15 G 25 hạt tinh (F) hạt thô (C) G 50 hạt tinh (F) hạt thô (C) G 75 G 100 G 150 G 200 Trọng luợng phân tử - 700 - 1.500 100 - 5000 1500 - 30.000 3.000 - 70.000 4.000 - 150.000 5.000 - 400.000 5.000 - 800.000 Các Molselect có ký hiệu từ G10 dến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng luợng phân tử khác lọt vào nguỡng sau đây: Các loại Molselect G - 10 G - 15 G - 25 G - 50 G - 75 G - 100 G - 200 Trọng luợng phân tử