Nghiên cứu tạo bộ chủng xạ khuẩn bản địa có khả năng phân giải lindane

Nghiên cứu khoa học Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa có khả phân giải lindane nhằm hướng tới tạo chế phẩm sinh học xử lý đất tồn dư thuốc trừ sâu để phục vụ sản xuất nơng nghiệp an tồn Lưu Trần Đơng1, Vũ Sơn Tùng1, Vũ Hà Phương1, Hoàng Quỳnh Anh1, Trần Thị Quỳnh Trang1, Nguyễn Thị Yến1, Nguyễn Hồng Minh2, Trần Thị Thanh Huyền3, Nguyễn Kim Nữ Thảo4, Phạm Thế Hải1,3* GREENLAB, Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống (CELIFE), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam Trung tâm nghiên cứu nguồn gen, Trường Đại học Phenikaa, Hà Nội, Việt Nam Bộ môn Vi sinh vật học 4Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 16/08/2022; Ngày chấp nhận đăng: 09/09/2022) Tóm tắt Lindane (ɤ-Hexachlorocyclohexan hay ɤ-HCH) loại thuốc trừ sâu sử dụng rộng rãi nông nghiệp sau năm 1945 Do tác hại với sức khỏe lindane, năm 2005, UNEP (United Nations Environment Programme - Chương trình mơi trường liên hợp quốc) định ngăn chặn ô nhiễm lindane toàn giới Tuy nhiên, với chu kỳ bán rã tương đối dài nên việc xử lý lượng lindane tồn dư đất nơng nghiệp gặp nhiều khó khăn Mục đích nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn địa có khả phân giải lindane nhằm phát triển chế phẩm sinh học có tác dụng loại phân giải lindane tồn dư đất nơng nghiệp cách an tồn thân thiện với môi trường Các phương pháp phân lập xạ khuẩn áp dụng kết hợp với số phương pháp phân lập định hướng đánh giá khả sinh trưởng xạ khuẩn môi trường có khơng có lindane Khả phân giải lindane chủng xạ khuẩn đánh giá dựa tốc độ loại ion clorua chất Các chủng xạ khuẩn đáng lưu ý sau nghiên cứu đặc điểm sinh học hình thái, đặc tính sinh lý sinh hóa, số hoạt tính chuyển hóa liên quan đến q trình phân giải lindane Kết thu chủng xạ khuẩn có khả phân giải lindane phân lập từ mẫu đất nơng trường Nghệ An có hàm lượng lindane cao Đặc biệt, 02 chủng xạ khuẩn A119 LD02 thuộc chi Streptomyces có hiệu suất phân giải lindane tốt dựa khả loại ion clorua nghiên cứu sâu đặc điểm sinh học định danh Từ khóa: Lindane, xạ khuẩn, nông nghiệp, ô nhiễm đất, Streptomyces * Điện thoại: 0943318978 Email: phamthehai@vnu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 183 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc trừ sâu hay thuốc bảo vệ thực vật chất hợp chất có khả ngăn chặn, tiêu diệt, xua đuổi giảm thiểu dịch hại (cơn trùng, ve, giun trịn, …) Lindane hay đồng phân ɤ- hexachlorocyclohexan gọi ɤ -HCH loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm clo hữu có phổ rộng, tổng hợp sau chiến tranh giới thứ năm 1990 [1-2] Theo định 1946/QĐ-TTG năm 2010 Thủ tướng Chính phủ, hàm lượng lindane tồn dư đất nông nghiệp mức cao, gấp hàng trăm lần quy định cho phép (1 - 3,8 mg/kg Bắc Giang, 5,2 mg/kg Lạng Sơn) Điều ảnh hưởng trực tiếp tới sản xuất lương thực, thực phẩm dành cho người động vật Cây trồng, rau hay trái canh tác đất có hàm lượng lindane cao có mùi vị khó chịu ảnh hưởng lindane [3] Lindane có độ hịa tan thấp nước lại có tính thấm, chúng thấm vào đất, gây nhiễm đất nguồn nước ngầm phần nước mặt nước uống Lindane tồn mơi trường tính hịa tan lipid cao có tính ổn định hóa học, chu kỳ bán rã lindane đất 708 ngày 2292 ngày nước [4-5] Khi người, động vật sử dụng nước hay thực phẩm canh tác đất nhiễm lindane, lindane vào, tích lũy sinh học thể gây ung thư, bệnh nội tiết tác động tới hệ thần kinh động vật [6-7], lindane dẫn đến tê liệt, co giật chí tử vong [8-9] Do đó, vào năm 2005, UNEP (United Nations Environment Programme - Chương trình môi trường Liên Hợp Quốc) định ngăn chặn nhiễm lindane tồn giới Ở nước ta, năm 2006, lindane bị cấm sử dụng theo định số 31/2006/QĐBNN ngày 27 tháng năm 2006 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Để xử lý lindane, áp dụng số phương pháp hóa lý, phổ biến đốt [10] Tuy nhiên, cách làm để lại số ảnh hưởng độc hại với môi trường không hiệu mặt kinh tế Trong đó, giải pháp sinh học để xử lý chất (bioremediation) tỏ thân thiện với môi trường, mà hứa hẹn khả xử lý chỗ (in situ) xử lý triệt để với chi phí hợp lý Vì vậy, giải pháp ưa chuộng Vi sinh vật với vai trị phân hủy sinh học lindane nghiên cứu ngày nhiều, tương tác hóa sinh đa dạng chúng làm thay đổi phá hủy hồn tồn cấu trúc lindane Đã có nghiên cứu trước vi sinh vật có khả phân giải lindane Staphylococcus sp [11], Pseudomonas sp [12], Sphingomonas sp [13], … Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu tập trung vào đối tượng vi khuẩn xạ khuẩn nguồn sinh enzyme đa dạng hexachlorocyclohexane dehydrochlorinase (LinA), haloalkane dehalogenase (LinB), alcohol dehydrogenase (LinC) [14] Do đó, việc sàng lọc, tìm kiếm phân lập chủng xạ khuẩn có khả phân giải lindane mục tiêu nghiên cứu Bài báo trình bày kết phân lập tạo chủng xạ khuẩn có tiềm phân giải lindane từ 13 mẫu đất Nghệ An, Việt Nam Đồng thời, kết đánh giá đặc điểm sinh học số hoạt tính chuyển hóa liên quan đến khả phân hủy lindane chủng báo cáo 184 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Lưu Trần Đông, Vũ Sơn Tùng, Vũ Hà Phương, … Phạm Thế Hải VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 13 mẫu đất có nồng độ lindane cao (> 0,1 mg/kg) nhiều địa điểm khác Nghệ An, Việt Nam, theo Quyết định 1946/QĐ-TTg Thủ tướng Chính Phủ ban hành, thu thập túi zip bạc vô trùng phương pháp lấy mẫu thường quy Các mẫu đất làm khô, lưu trữ 4oC sử dụng để phân lập xạ khuẩn Linadne (ɤ -HCH 99.4%) mua từ hãng Dr Ehrenstorfer (Đức) hóa chất khác mua từ hãng uy tín Merck (Hoa Kỳ), Xilong (Trung Quốc), … 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập định hướng xạ khuẩn từ mẫu đất Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất dựa theo phương pháp Aslvarez [15] Các mẫu đất cân 10 g cho vào 100 mL nước muối sinh lý 0,85%, lắc với vận tốc 150 vòng/phút 30°C 30 phút Sau dịch huyền phù thu trải đĩa chứa môi trường SC agar (g/L: tinh bột - 10, casein - 1, K2HPO4 - 0,5, Cycloheximine - 1, pH 7,0) Theo dõi liên tục 14 ngày, khuẩn lạc xạ khuẩn đĩa phân lập nhặt để tinh cách cấy ria pha đĩa petri có chứa mơi trường thạch MM (g/L: Lasparagine - 0,5; K2HP4 - 0,5; 0,2 - MgSO4.7H2O; FeSO4.7H2O - 0,01; pH 7,0, mL chuẩn gốc lindane 1.000 ppm) Đĩa giữ 30°C, sau 14 ngày quan sát hình thái khuẩn lạc, nhặt chủng có hình thái khác tiếp tục tinh cách ria pha đĩa YS agar (g/L: cao nấm men - 2; tinh bột tan - 10; thạch - 18; pH 7,0) 2.2.2 Phương pháp xác định khả sinh trưởng xạ khuẩn môi trường bổ sung lindane Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn khảo sát môi trường thạch MSM bổ sung 10 ppm lindane (MSM agarose + 10 ppm lindane), thạch MSM bổ sung 50 ppm lindane (MSM agarose + 50 ppm lindane) thạch MSM không bổ sung lindane (MSM agarose) Thành phần môi trường thạch MSM sau (g/L): MgSO4.7 H2O - 0,4; FeSO4.7H2O - 0,002 ; K2HPO4 - 0,2; (NH4)2SO4 - 0,2; CaSO4 - 0,08; H2O - 1.000 mL; pH 7,0 - 7,2, bổ sung 0,01% vi lượng TE, agarose - 15 Bộ chủng xạ khuẩn phân lập ni lắc mơi trường YS Sau đó, thu rửa sinh khối nước muối sinh lý Sinh khối hòa nước muối sinh lý theo tỉ lệ : (v/v) để tạo dịch huyền phù Sử dụng tăm khử trùng để cấy vạch dịch huyền phù lên đĩa chứa môi trường MSM agarose, MSM agarose + 10 ppm lindane MSM agarose + 50 ppm lindane Sau ngày ủ đĩa 30oC, tiến hành quan sát khác biệt khả sinh trưởng chủng đĩa 2.2.3 Phương pháp xác định trình tự 16S rDNA Để xác định trình tự 16S rDNA, đoạn 16S rDNA nhân lên phản ứng PCR sử dụng mồi 27F 1492R theo phương pháp Vingataramin cộng [16] Các chủng quan tâm nuôi cấy qua đêm mơi trường YS lỏng Sau đó, mL dịch nuôi chủng thu, ly tâm tốc độ 8.000 vòng/phút 10 phút để thu cặn tế bào Cặn tế bào được rửa - lần dung dịch PBS (đệm phôt-phat chứa NaCl 0,9%) Cặn tế bào Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 185 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa sau rửa thêm vào 455 µL dung dịch EtNa (NaOH - 240 mM, Ethanol - 74%, EDTA - 2,7 mM) lắc nhẹ Hỗn dịch thu ly tâm 8.000 vòng/phút để thu lấy phần dịch Dịch thu được ly tâm tốc độ 14.000 vòng/phút 10 phút để DNA kết tủa phần dịch phía loại bỏ Thêm 100 µL dung dịch hịa tan DNA (elution buffer Qiagen cung cấp) Sau đó, phản ứng PCR thực máy PCR Thermocycler (Hoa Kỳ) với thành phần hỗn hợp phản ứng sau: (µL) Taq PCR mas ter mix - 12,5, mồi P27F - 1, mồi P1492R - 1, DNA - 1, nước PCR - PCR thực theo chu trình nhiệt sau: 96˚C - phút, 35 chu kỳ (95˚C - 45 giây, 55˚C - 45 giây, 68˚C - phút), 68˚C - phút Đoạn 16S rDNA giải trình tự sử dụng để tìm lồi gần gũi cơng cụ TruebacID 2.2.4 Khả sinh enzyme loại gốc clo chủng xạ khuẩn Khả sinh enzyme loại clorua chủng xạ khuẩn đánh giá dựa vào phương pháp Bergmann, J G [17] Các chủng xạ khuẩn ni lắc mơi trường MSM lỏng có nồng độ lindane 50 ppm, 30°C, 150 rpm Sau ngày, hút 200 µL dịch ni lắc vào giếng đĩa 96 giếng Bổ sung 20 µL dung dịch Fe(NH4)(SO4)2.12H2O 0,25 M acid nitric M với 20 µL dung dịch bão hịa thủy ngân thiocyanate ethanol Trộn hỗn hợp sau quan sát thay đổi màu sắc giếng (vàng dần có ion clorua tự do) Sau 10 phút, đo độ hấp thu quang phức Cl tạo bước sóng 460 nm máy quang phổ ELISA - microplate reader Plus384 (Hoa Kỳ) Kết xử lý phần mềm Microsoft Excel máy tính 2.2.5 Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn Khảo sát sử dụng nguồn carbon khác nhau: khả sinh trưởng xạ khuẩn đánh giá cách cấy vạch môi trường có thành phần: (g/L: Bacto yeast nitrogen base w/o amino acid - 6,7; Bacto casamino acid - 0,01; K2HPO4 - 10 1% loại carbon hydrat khác nhau, pH 7,0) Môi trường bổ sung 1% D-glucose dùng làm đối chứng dương mơi trường khơng có nguồn carbon đối chứng âm Mức độ sinh trưởng đánh giá sau ngày Xác định ảnh hưởng nhiệt độ tới mức độ sinh trưởng xạ khuẩn: Khả sinh trưởng xạ khuẩn đánh giá cách cấy vạch môi trường YS ủ nhiệt độ khác (25, 30, 37, 45°C) Mức độ sinh trưởng đánh giá sau ngày Xác định ảnh hưởng nồng độ muối tới mức độ sinh trưởng: Khả sinh trưởng xạ khuẩn đánh giá cách cấy vạch môi trường YS có nồng độ NaCl khác (0, 3, 5, 7%) Mức độ sinh trưởng đánh giá sau ngày Xác định khả sinh enzyme ngoại bào: thỏi thạch chứa chủng xạ khuẩn đặt lên môi trường thạch bổ sung 1% chất: tinh bột, casein CMC, ủ 30oC ngày Các đĩa thạch nhuộm với thuốc thử Lugol 1% để kiểm tra hoạt tính amylase, thuốc thử Congo Red 0,1% để xác định hoạt tính cellulase protease Xác định ảnh hưởng nồng độ pH đến khả sinh trưởng: Khả sinh trưởng xạ khuẩn đánh giá cách cấy vạch môi trường YG (g/L: Cao nấm men 186 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Lưu Trần Đông, Vũ Sơn Tùng, Vũ Hà Phương, … Phạm Thế Hải 10; D-glucose - 10; agar - 20) chỉnh pH đến giá trị khác (5,0; 7,0; 9,0) Mức độ sinh trưởng đánh giá sau ngày Hình thái chuỗi bào tử chủng xạ khuẩn xác định cách nuôi cấy xạ khuẩn giọt thạch 15% lam kính ngày quan sát kính hiển vi quang học Olympus CX23 (Nhật Bản) độ phóng đại 100x KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết phân lập đánh giá khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn mơi trường có lindane Từ 13 mẫu đất Nghệ An, 78 chủng xạ khuẩn phân lập môi trường SC Các chủng lựa chọn dựa đặc điểm hình thái màu sắc khuẩn lạc khác Hình Phân bố số lượng chủng xạ khuẩn phân lập theo khả sinh trưởng mơi trường MSM có bổ sung lindane Khả sinh trưởng 78 chủng xạ khuẩn đánh giá môi trường tối thiểu MSM rắn có bổ sung khơng bổ sung lindane dựa việc so sánh mức độ phát triển chủng xạ khuẩn mơi trường Kết (Hình 1) cho thấy, số lượng chủng sinh trưởng tốt mơi trường có lindane (so với mơi trường khơng có lindane) 34 chủng, chiếm 44% tổng số chủng Trong số đó, chủng (12%) thể khả sinh trưởng tốt, chủng (6%) tốt 20 chủng (26%) mức Như vậy, từ kết trên, chủng xạ khuẩn có khả sinh trưởng mơi trường có lindane tốt lựa chọn để tiếp tục tiến hành thí nghiệm sau 3.2 Hoạt tính enzyme loại chlorua liên quan đến khả phân giải lindane chủng xạ khuẩn tuyển chọn Trong thí nghiệm này, chúng tơi khảo sát khả sinh enzyme loại bỏ gốc halogen chất Quá trình khử halogen bước quan trọng trình phân giải hợp chất halogen Với chất lindane có chứa gốc Clo phân tử, loại Clo khâu tối quan trọng phân giải lindane [15] Khi gốc Clo bị loại, ion clorua giải phóng ngồi mơi trường ni cấy Do đó, cách so sánh nồng độ ion clorua Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 187 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa giải phóng mơi trường chủng xạ khuẩn, khả phân giải lindane chủng đánh giá Kết (Bảng Hình 2) cho thấy có chủng xạ khuẩn A119 LD02 có tốc độ loại clorua vào mơi trường ≥ 0,4 mMol/tuần; cịn lại chủng khác có khả loại clorua mức khoảng 0,2 mMol/tuần - 0,3 mMol/tuần chủng mức < 0,1 mMol/tuần Như vậy, từ kết khảo sát hoạt tính enzyme, chủng xạ khuẩn A119 LD02 lựa chọn cho nghiên cứu Bảng Kết khảo sát tốc độ loại ion clorua chủng xạ khuẩn Tốc độ loại ion clorua (mMol/tuần) Chủng xạ Khả khuẩn phân giải MSM (lindane 50ppm) Đối chứng Chênh lệch A78 0,965 0,943 0,021 + A93 1,227 0,841 0,386 + A118 0,933 0,902 0,030 + A119 1,256 0,857 0,399 + LD1 1,273 0,886 0,387 + LD2 1,336 0,880 0,456 + LD3 1,140 0,910 0,231 + LD4 1,004 0,806 0,198 + T071 0,984 0,863 0,120 + Ghi chú: (-): khơng có hoạt tính; (+): có hoạt tính Hình Hình ảnh khuẩn lạc khả sinh trưởng khác biệt môi trường chứa lindane hai chủng xạ khuẩn đại diện Chú thích: hình ảnh khuẩn lạc đĩa thạch YS chủng A119 (A) chủng LD02 (B); hình ảnh cấy vạch so sánh chủng A119 đĩa thạch MSM có lindane (C) đĩa thạch MSM khơng có lindane (D); hình ảnh cấy vạch so sánh chủng LD02 đĩa thạch MSM có lindane (E) đĩa thạch MSM khơng có lindane (F) 188 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Lưu Trần Đông, Vũ Sơn Tùng, Vũ Hà Phương, … Phạm Thế Hải 3.3 Các đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn A119 LD02 có hiệu phân giải tốt Đoạn gene 16S rDNA 02 chủng xạ khuẩn A119, LD02 nhân lên phương pháp PCR giải trình tự Trình tự 02 chủng có độ tương đồng 98% (Bảng 2) với loài thuộc chi Streptomyces so sánh công cụ TruebacID Bảng Tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn gene 16S rDNA 02 chủng xạ khuẩn A119, LD02 với chủng xạ khuẩn khác sở liệu GenBank A119 LD02 Loài tương đồng Tỉ lệ tương đồng Loài tương đồng Tỉ lệ tương đồng S polychromogenes 100% S wuyuanensis 100% S racemochromogenes 99,92% S marianii 99,85% S yangpuensis 99,75% S tirandamycinicus 99,32% S flavotricini 99,66% S spongiicola 98,71% S amritsarensis 99,66% S lichenis 98,48% S globosus 99,32% S griseoincarnatus 98,17% S katrae 99,32% S labedae 98,17% S toxytricini 99,32% S althioticus 98,17% Từ kết trên, khẳng định chủng A119 gần gũi với lồi Streptomyces polychromogenes Khuẩn lạc chủng A119 mơi trường YS có màu trắng chuyển dần sang hồng sau ngày, dạng trịn, có thùy (Hình 2A) Chủng xạ khuẩn Streptomyces polychromogenes công bố ngân hàng liệu DNA American Type Culture Collection (ATCC) vỡi ký hiệu ATCC 12595 ATCC 25484 Theo mô tả Shirling, E.B năm 1969, chủng xạ khuẩn có khuẩn lạc màu hồng nhiều môi trường khảo sát [18] Loài S polychromogenes chưa nghiên cứu khả phân giải lindane hay chất hữu vịng thơm, mà chứng minh có khả kháng nấm gây hại thực vật [19] Kết nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng A119 (Bảng 3) cho thấy: chủng A119 có khả sinh trưởng tốt nguồn carbonhydrat D-galactose, DMannose, D-xylose; sinh trưởng D-Sorbitol, Sephrose, L-Rhamnose Lactose Khả sinh trưởng chủng A119 điều kiện pH 5,0 - 9,0 tương đối tốt tối ưu pH 7,0 Về nồng độ muối, chủng A119 chịu nồng độ muối 3%, tốt 0% không sinh trưởng nồng độ muối 5%, 7% Chủng xạ khuẩn A119 có khả sinh enzyme Protease phân giải Casein Trong nghiên cứu Hagemann (1955), đặc điểm sinh lý sinh hóa lồi S polychromogenes nghiên cứu Theo đó, S polychromogenes có khả sử dụng I-inositol, D-mannitol, L-Rhamnose Raffinose tốt [18] Như vậy, chủng A119 tương đồng hình thái khuẩn lạc với S polychromogenes khả sử dụng nguồn carbon hydrat khơng hồn tồn tương đồng Chủng LD02 có độ tương đồng trình tự 16S rRNA với lồi Streptomyces wuyuanensis tới 100% Chủng LD02 có khuẩn lạc trắng xám, dạng trịn có viền (Hình 2B) Lồi xạ khuẩn Streptomyces wuyuanensis công bố năm 2013 Zhang Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 189 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa cộng thông tin công bố China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) [20] S wuyuanensis có khuẩn lạc xám tráng môi trường ISP 2-5 chưa nghiên cứu khả phân giải chất hữu có vịng thơm Kết (Bảng 3) cho thấy, chủng LD02 có khả sinh trưởng tốt nguồn carbonhydrat D-galactose, D-Mannose, D-xylose; sinh trưởng D-sorbitol, L-sorbose, đặc biệt không sinh trưởng mơi trường có L-Rhamnose Khả sinh trưởng chủng LD02 điều kiện pH 5,0 - 9,0 tương đối tốt tối ưu pH 7,0 Về nồng độ muối, chủng LD02 chịu nồng độ muối 3%, tốt 0% Ngoài ra, chủng xạ khuẩn LD02 có khả phân giải Cellulose, Casein Trong báo cáo loài S wuyuanensis Zhang, chủng S wuyuanensis đại diện sinh trưởng tối ưu pH 6,0 đến pH 8,0 nồng độ muối từ - 9% Đồng thời, S wuyuanensis có khả sử dụng L-Arabinose, fructose, D-xylose, myoinositol, D-Galactose, D-glucose, Mannitol, L-Rhamnose sucrose Bên cạnh đó, S wuyuanensis có khả sinh enzyme Amylase không sinh Cellulase So sánh đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng LD02 với đặc điểm S wuyuanensis, thấy có tương đồng lớn khả sinh trưởng, điều kiện pH khả sử dụng nguồn carbonhydrat Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng A119, LD02 A119 LD02 Ký hiệu chủng Đối chứng âm + + D-galactose ++++ ++++ D-mantose ++++ ++++ Xylose ++++ ++++ D-sobitol + + Nguồn Carbon Sepharose + ++ L-sorbose +++ + L-Rhamnose + D-glucose ++++ ++++ Lactose + ++ Fructose +++ ++ 5,0 +++ +++ pH 7,0 ++++ ++++ 9,0 +++ +++ Cellulase + Enzyme Protease + + Amylase 0% ++++ ++++ 3% + +++ %NaCl 5% 7% Ghi chú: (-) không sinh trưởng; (+) sinh trưởng yếu; (++) sịnh trưởng yếu; (+++) sinh trưởng tốt;( ++++) sinh trưởng tốt 190 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Lưu Trần Đông, Vũ Sơn Tùng, Vũ Hà Phương, … Phạm Thế Hải 3.4 Bàn luận Các vi sinh vật phân giải thuốc trừ sâu tự nhiên tương đối môi trường đất Việc sử dụng xạ khuẩn xử lý ô nhiễm đất nông nghiệp nghiên cứu nhiều nơi giới Trong mẫu đất nhiễm thuốc trừ sâu Argentina, Fuentes cộng phân lập 12 chủng xạ khuẩn có khả phân giải thuốc trừ sâu clo hữu [21] Các vi sinh vật phân giải thuốc trừ sâu hữu tìm trước đây, đa số thuộc chi Arthrobacter, Brevibacterium, Clavibacter, Corynebacterium, Micromonospora, Mycobacterium Streptomyces, báo cáo, tiền đề cho nghiên cứu sâu để ứng dụng thực tế [22] Tại Việt Nam, nghiên cứu xử lý lindane môi trường chủ yếu phương pháp vật lý nhờ vật liệu nano alpha nhơm hydroxit [23] hay phương pháp hóa học nhờ nano-Fe3O4 [24] mà chưa có nghiên cứu sử dung tác nhân vi sinh vật cụ thể xạ khuẩn Trong nghiên cứu này, lần Việt Nam phân lập chủng xạ khuẩn có tiềm phân giải lindane từ mẫu đất nông nghiệp ô nhiễm thuốc trừ sâu Từ làm sở cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm xử lý đất nông nghiệp tồn dư lindane Việt Nam Một đường phân giải thuốc trừ sâu hữu chứa gốc Clo loại bỏ gốc halogen khỏi phân tử Loại bỏ halogen khỏi xenobiotics halogen hóa bước quan trọng trình phân hủy lindane liên kết carbon-halogen tương đối bền [25] Vì xác định lượng ion clorua mơi trường đánh giá khả phân hủy lindane vi sinh vật Trong nghiên cứu Manickam cộng sự, thông qua hoạt tính enzyme dehalogenase loại bỏ ion clorua phân tử lindane, chủng vi khuẩn Sphingomonas phân lập [26] Tương tự, Benimeli cộng báo cáo diện ion clorua môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces sp M7 [27] Trong nghiên cứu này, xuất ion clorua đo thông qua phức hợp Fe với ion clorua môi trường nuôi cấy lỏng chủng xạ khuẩn Kết cho thấy chủng xạ khuẩn có tiềm lớn khả phân hủy lindane giải phóng ion clorua mơi trường Điều chứng tỏ chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme dehalogenase ngoại bào để khử ion clorua từ lindane Đây kết quan trọng chứng minh tiềm phân giải lindane chủng xạ khuẩn lớn cần nghiên cứu sâu Trong công bố trước đây, xạ khuẩn biết đến nguồn sịnh chất kháng sinh chất có hoạt tính sinh học đa dạng Trong đó, chi Streptomyces ý chúng đóng góp tới 70% số 5.000 hoạt chất sinh học tìm thấy [27] Kết định danh cho thấy chủng có tiềm phân giải lindane tốt thuộc chi Streptomyces Điều chứng tỏ tiềm to lớn chủng xạ khuẩn sản xuất chế phẩm vừa có khả xử lý tồn dư lindane đất vừa có khả đối kháng mầm bệnh tự nhiên KẾT LUẬN 78 chủng xạ khuẩn tiềm phân lập từ mẫu đất Nghệ An, Việt Nam chủng xạ khuẩn tốt lựa chọn dựa vào kết sàng lọc khả sinh trưởng Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 191 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa mơi trường có lindane đạt 10% tổng số chủng để tiến hành nghiên cứu đánh giá khả phân giải lindane chúng Như vậy, lần Việt Nam, sưu tập xạ khuẩn địa có khả phân giải lindane tạo lập Hai chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces tuyển chọn định danh có khả sinh enzyme loại bỏ ion clorua từ chất mạnh Hai chủng xạ khuẩn lựa chọn chứng minh có khả sinh trưởng tốt điều kiện môi trường đa dạng Kết mở tiềm thực tiễn sản xuất chế phẩm xử lý tồn dư lindane đất nông nghiệp, nhằm hướng tới phục vụ nơng nghiệp an tồn LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ Bộ Khoa học Công nghệ nhiệm vụ khoa học công nghệ Quỹ gen cấp quốc gia mã số NVQG-2021/ĐT.02 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] C M Dominguez, N Oturan, A Romero, A Santos, and M A Oturan, "Removal of lindane wastes by advanced electrochemical oxidation," Chemosphere, vol 202, pp 400-409, 2018 [2] J M Saez, J D Aparicio, M J Amoroso, and C S Benimeli, "Effect of the acclimation of a Streptomyces consortium on lindane biodegradation by free and immobilized cells," Process Biochemistry, vol 50, no 11, pp 1923-1933, 2015 [3] J Vijgen, B de Borst, R Weber, T Stobiecki, and M Forter, "HCH and lindane contaminated sites: European and global need for a permanent solution for a long-time neglected issue," Environmental Pollution, vol 248, pp 696-705, 2019 [4] C S Benimeli, M S Fuentes, C M Abate, and M J Amoroso, "Bioremediation of lindane-contaminated soil by Streptomyces sp M7 and its effects on Zea mays growth," International Biodeterioration & Biodegradation, vol 61, no 3, pp 233-239, 2008 [5] A Beyer and M Matthies, "Long-range transport potential of semivolatile organic chemicals in coupled air-water systems," Environmental Science and Pollution Research, vol 8, no 3, pp 173-179, 2001 [6] K Nolan, J Kamrath, and J Levitt, "Lindane toxicity: a comprehensive review of the medical literature," Pediatric Dermatology, vol 29, no 2, pp 141-146, 2012 [7] P Sharma, S Shankar, A Agarwal, and R Singh, "Variation in serum lipids and liver function markers in lindane exposed female wistar rats: attenuating effect of curcumin, vitamin C and vitamin E," Asian Journal of Expẻimental Biological Science, vol 1, no 2, pp 440-444, 2010 [8] A Agrahari, A Singh, A Srivastava, R R Jha, D K Patel, S Yadav, V Srivastava, and D Parmar, "Overexpression of cerebral cytochrome P450s in prenatally exposed offspring modify the toxicity of lindane in rechallenged offspring," Toxicology and Applied Pharmacology, vol 371, pp 20-37, 2019 [9] D Mladenović, D Djuric, N Petronijević, T Radosavljević, N Radonjić, D Matić, D Hrnčić, A Rašić-Marković, D Vučević, and D Dekanski, "The correlation 192 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Lưu Trần Đông, Vũ Sơn Tùng, Vũ Hà Phương, … Phạm Thế Hải [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] between lipid peroxidation in different brain regions and the severity of lindaneinduced seizures in rats," Molecular and Cellular Biochemistry, vol 333, no 1, pp 243-250, 2010 D Kumar and R Pannu, "Perspectives of lindane (γ-hexachlorocyclohexane) biodegradation from the environment: a review," Bioresources and Bioprocessing, vol 5, no 1, pp 1-18, 2018 D Kumar, A Kumar, and J Sharma, "Degradation study of lindane by novel strains Kocuria sp DAB-1Y and Staphylococcus sp DAB-1W," Bioresources and Bioprocessing, vol 3, no 1, pp 1-16, 2016 M Kumar, S K Gupta, S K Garg, and A Kumar, "Biodegradation of hexachlorocyclohexane-isomers in contaminated soils," Soil Biology and Biochemistry, vol 38, no 8, pp 2318-2327, 2006 N Manickam, M K Reddy, H S Saini, and R Shanker, "Isolation of hexachlorocyclohexane‐degrading Sphingomonas sp by dehalogenase assay and characterization of genes involved in γ‐HCH degradation," Journal of Applied Microbiology, vol 104, no 4, pp 952-960, 2008 S A Cuozzo, P E Sineli, J Davila Costa, and G Tortella, "Streptomyces sp is a powerful biotechnological tool for the biodegradation of HCH isomers: biochemical and molecular basis," Critical Reviews in Biotechnology, vol 38, no 5, pp 719-728, 2018 A Alvarez, C S Benimeli, J M Sáez, A Giuliano, and M J Amoroso, "Lindane removal using Streptomyces strains and maize plants: a biological system for reducing pesticides in soils," Plant and Soil, vol 395, no 1, pp 401-413, 2015 L Vingataramin and E H Frost, "A single protocol for extraction of gDNA from bacteria and yeast," Biotechniques, vol 58, no 3, pp 120-125, 2015 [17] D Kumar and R Pannu, "Perspectives of lindane (γ-hexachlorocyclohexane) biodegradation from the environment: a review," Bioresources and Bioprocessing, vol 5, no 1, pp 1-18, 2018 J G Bergmann and J Sanik, "Determination of trace amounts of chlorine in naphtha," Analytical Chemistry, vol 29, no 2, pp 241-243, 1957 E B Shirling and D Gottlieb, "Cooperative description of type cultures of Streptomyces IV Species descriptions from the second, third and fourth studies," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol 19, no 4, pp 391-512, 1969 A A Alblooshi, G P Purayil, E E Saeed, G A Ramadan, S Tariq, A S Altaee, K A El-Tarabily, and S F AbuQamar, "Biocontrol potential of endophytic actinobacteria against Fusarium solani, the causal agent of sudden decline syndrome on date palm in the UAE," Journal of Fungi, vol 8, no 1, p 8, 2021 X Zhang, J Zhang, J Zheng, D Xin, Y Xin, and H Pang, "Streptomyceswuyuanensis sp nov., an actinomycete from soil," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol 63, no Pt_8, pp 2945-2950, 2013 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 193 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa [21] M S Fuentes, C S Benimeli, S A Cuozzo, and M J Amoroso, "Isolation of pesticide-degrading actinomycetes from a contaminated site: bacterial growth, removal and dechlorination of organochlorine pesticides," International Biodeterioration & Biodegradation, vol 64, no 6, pp 434-441, 2010 [22] A D Schrijver and R D Mot, "Degradation of pesticides by actinomycetes," Critical Reviews in Microbiology, vol 25, no 2, pp 85-119, 1999 [23] T H Nguyen, T T L Nguyen, T D Pham, and T S Le, "Removal of lindane from aqueous solution using aluminum hydroxide nanoparticles with surface modification by anionic surfactant," Polymers, vol 12, no 4, p 960, 2020 [24] T D Tran, N T Dao, R Sasaki, M B Tu, G H M Dang, H G Nguyen, H M Dang, C H Vo, Y Inigaki, and N Van Nguyen, "Accelerated remediation of organochlorine pesticide-contaminated soils with phyto-Fenton approach: a field study," Environmental Geochemistry and Health, vol 42, no 11, pp 3597-3608, 2020 [25] S Fetzner and F Lingens, "Bacterial dehalogenases: biochemistry, genetics, and biotechnological applications," Microbiological Reviews, vol 58, no 4, pp 641-685, 1994 [26] C S Benimeli, G R Castro, A P Chaile, and M J Amoroso, "Lindane removal induction by Streptomyces sp M7," Journal of Basic Microbiology, vol 46, no 5, pp 348-357, 2006 [27] J Berdy, "Bioactive microbial metabolites," The Journal of Antibiotics, vol 58, no 1, pp 1-26, 2005 194 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Lưu Trần Đông, Vũ Sơn Tùng, Vũ Hà Phương, … Phạm Thế Hải Collection of endemic actinomycetes capable of degrading lindane in order to produce biological products for the treatment of pesticide pollution toward safe agricultural production Luu Tran Dong1, Vu Son Tung1, Vu Ha Phuong1, Hoang Quynh Anh1, Tran Thi Quynh Trang1, Nguyen Thi Yen1, Nguyen Hong Minh2, Tran Thi Thanh Huyen3, Nguyen Kim Nu Thao4, Pham The Hai1,3* GREENLAB, Center for Life Science Research (CELIFE), University of Science, Vietnam National University, Ha Noi, Viet Nam Bioresource Research Center, Phenikaa University, Ha Noi, Viet Nam Department of Microbiology and 4Department of Cell Biology, Faculty of Biology, University of Science, Vietnam National University, Ha Noi, Viet Nam Abstract Pesticide residues in the soil are a huge threat to agriculture ɤ- hexachlorocyclohexan (lindane or isomer ɤ -HCH) is one of the pesticides widely used in agriculture after 1945 Due to the harmful effects on health of lindane, UNEP (United Nations Environment) Program - United Nations Environment Program) decided to stop the pollution of lindane worldwide in 2005 However, with a long half-life, it is very difficult to control residual lindane in soils The purpose of this study is to isolate and select actinomycete strains capable of degrading lindane in order to develop a biological product that can remove residual lindane in agricultural soil in a safe and environmental-friendly manner Basic actinomycete isolation methods have been applied in combination with a number of oriented isolation methods to evaluate the growth ability of actinomycetes on media with and without lindane The ability to degrade lindane of actinomycetes was also evaluated based on the rate of chloride ion removal in the substrate The remarkable actinomycetes were then studied for biological characteristics such as morphology, biochemical and physiological properties, and some metabolic activities related to the degradation of lindane We obtained actinomycetes capable of decomposing lindane isolated from soil samples in farms in Nghe An Among them, the two strains A119 and LD02 belonging to the genus Streptomyces displayed the best lindane degradation performance based on their chloride ion removals They were further studied for their biological characteristics and eventually identified Keywords: Lindane, actinomycetes, agriculture, soil pollution, Streptomyces Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 195 ... số 2, 2022 187 Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa giải phóng mơi trường chủng xạ khuẩn, khả phân giải lindane chủng đánh giá Kết (Bảng Hình 2) cho thấy có chủng xạ khuẩn A119 LD02 có tốc độ loại... Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn địa mơi trường có lindane đạt 10% tổng số chủng để tiến hành nghiên cứu đánh giá khả phân giải lindane chúng Như vậy, lần Việt Nam, sưu tập xạ khuẩn địa có khả phân giải. .. Do đó, việc sàng lọc, tìm kiếm phân lập chủng xạ khuẩn có khả phân giải lindane mục tiêu nghiên cứu Bài báo trình bày kết phân lập tạo chủng xạ khuẩn có tiềm phân giải lindane từ 13 mẫu đất Nghệ