KHOA HỌC CƠNG NGHỆ MỘT 50 ĐẶC TÍIMH CỦA TYROSINASE TỬ VỎ BAO NÁM ROM VIỆT NAM Đỗ Biên Cương1’ *, Nguyễn Thế Duyệt1 TĨM TẮT Tyrosinase có vai trị quan trọng biến màu sản phẩm nấm, đặc tính enzym mơ bề mặt, noi định tính chất cảm quan nấm rom (Volvariella volvacea) sau thu hoạch chưa dược biết đến Trong nghiên cứu này, tyrosinase từ vỏ bao giống nấm rom trồng phổ biến Việt Nam, thường gọi giống Thần Nông, giai đoạn hình trứng tính chế quy trình kết hợf kết tủa ammonium sulfat 60-80% độ bão hòa, sắc ký kỵ nước Butyl Sepharose Fast Flow sắc ký lọc ge Sephadex G -50, với độ tăng gấp 16,4 lần so với ban đầu Từ kết phân tích zymogram SE S-PAGE, enzym oligomer có khối lượng phân tử khoảng 110 kDa, với đon vị có khI ấi lượng xấp xỉ 22 kDa Tyrosinase từ vỏ bao nấm rom hoạt động tối ưu nhiệt độ 45°c pH 6,8, bền khoảng pH hẹp từ 6,8 đến 8,0 nhiệt độ 30°C Km Vmáxcủa enzym vói chất L-DOPA 0,82 mM 0,056 pM/s Ở nồng độ mM, ion sắt (II), đồng (II) hoạt hóa mạnh, natri benz< at i kali sorbat hoạt hóa nhẹ tyrosinase Trái lại, EDTA, nisin đặc biệt canxi ức chế mạnh enzym nồI ng độ mM Từ khóa: Tyrosinase, vỏ bao nấm, đặc tính, chống biến màu, nấm rom ĐẶT VÁN ĐỀ Nấm rơm - Volva'riella volvacea (Bull Ex Fr.) Si Iger loại nấmi ăn ngon, bổ dưỡng, nuôi trổng nhiều Việt Niun giới [1] Tuy nhiên, nâ m rơm có thời gian 1aảo quản ngắn [2], thể nl anh chuyển sang miàu sậm hơn, gây khó cho việc lưu thông, tiêu thụ i địa xuất sản phẩm tưoi Do đó, hạn chế biến màu nấm cách đình trì hỗn phản ứng chuyển hóa tyrosine tạc melamin Xhie tác tyrosinase (EC 1.14.18.1), mono:iygenase vốn có nấm, nh i tác nhân hóa lý, có chất kim hãm enzym troiIg giải pháp quan tâm ý nhiều 1năm qua [2] Để sàng lọc tac chất kìm hâm tyrosinase từ nguồn tự nhiên tổng hợp, đa phần nghiên cứu sử dụng che phẩm tyrosinase thương mại thu nhận từ nấm mỡ, cỏ độ tinh khiết khác nhau, cịn chứa số enzym phụ laccase (có thể sử dụng chất tương tự tyrosinase) glycosidase (có thể chuyển hóa họp chất vốn khơng có thành chất cólhoạt tính ức chế tyrosinase) [3], dân tói việc áp dụng chất coi kìm hãm tyrosinase thực tệ bảo quản nấm tươi khơ Ig đạt moịng đọi Ngoài ra, enzym từ nguồn khác nhau, chí isozyme từ Trư- mg Đại học Bách khoa Hà Nội ’Email: cuong.dobien@hust.edu.vn nguồn thu có tính chất khác yếu tố ảnh hưởng đến kết sàng lọc tác nhân chống biến màu nấm Vì vậy, việc thu nhận tyrosinase tinh từ đối tượng nấm ăn cần bảo quản xác định đặc tính hóa lý enzym cần thiết để chọn tác nhân chống biến màu hiệu Bài báo trinh bày kết tinh đặc tính tyrosinase từ vỏ bao nấm rơm mà màu sắc phần mơ định tính chất cảm quan nấm rơm giai đoạn hình trứng (là giai đoạn mà thể nấm có hương vị thơm ngon người tiêu dùng ưa thích [2]) NGUYÊN UỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cúu 2.1 Nguyên liệu, hóa chất Nấm rơm Thần Nông - Volvariella volvacea (Bull Ex Fr.) Singer (ở giai đoạn hình trứng) thu mua từ sở trồng nấm Hà Nội 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), Tyrosine, Butyl Sepharose Fast Flow, Sephadex G75 superfine Sigma-Aldrich (Mỹ), hỗn họp protein chuẩn GangNam-STAINÀ Prestained Protein Ladder iNtRON Biotechnology (Hàn Quốc) Các hóa chất tinh khiết khác Trung Quốc 2.2 Phương pháp nghiên cứu Chiết enzym từ vỏ bao nấm: phần phía thể nấm tươi sau cắt tách bỏ phần mũ cuống phía trong, xay nhuyễn máy xay sinh tố vói dung dịch đệm phosphate NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 5/2022 91 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 50 mM pH 6,8 (theo tỉ lệ 1: w/v) Hỗn dịch lọc sơ qua vải đem ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút 4°c, thu dịch enzyme thô Kết tủa tyrosinase: dịch enzym thô (được đặt cốc để đá) bổ sung từ ethanol lạnh ammonium sulfate cho đạt nồng độ định Sau đó, hỗn dịch ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút 4°c Kết tủa thu hòa tan đệm phosphate 50 1Ĩ1M, pH 6,8 theo tỉ lệ 1: (w/v) Dịch hòa tan đem ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút Ở4°c, thu dịch Làm tyrosinase sắc ký cột: 500 pl dịch hòa tan kết tủa muối ammonium sulfate cấp lên cột Butyl Sepharose Fast Flow (kích thước cm X 50 cm, ổn định trước dung dịch muối ammonium sulfate 80% độ bão hòa), cột Sephadex G-50 (1 cm X 50 cm, ổn định đệm phosphate 50 1Ĩ1M, pH 6,8) Mẫu rửa giải khỏi cột dung dịch đệm phosphate 50 mM, pH 6,8 với tốc độ mL/phút, phân đoạn thu 1,5 mL Các phân đoạn đem đo OD280 xác định hoạt độ tyrosinase vói chất L-DOPA Xác định hoạt độ tyrosinase [4]: 200 pL enzym bổ sung vào cuvet có chứa sẵn 200 pL L-DOPA 10 mM 400 pL dung dịch đệm phosphat pH 6,8 Đo mật độ quang bước sóng 475 nm (sau 30 giây ghi giá trị OD lần, phút thứ thi dừng đo) Một đơn vị hoạt độ tyrosinase định nghĩa lượng enzyme cần thiết xúc tác chuyển hóa LDOPA tạo pmol sản phẩm dopachrome thịi gian phút Hoạt độ tính theo cơng thức: Hoạt độ tyrosinase (U/L) = AOD.106.Vt/(e.1 At.Vp) Trong đó: AOD trung bình hiệu số mật độ quang đo 10 giây phản ứng; VT tổng thể tích phản ứng (pL); VE thể tích tyrosinase phản ứng (pL), £ độ hấp phụ phàn tử dopachrome (Edopachrome = 3600 MTcrn'1); độ dày cuvet (1 = cm), At thời gian phản ứng enzyme hai lần đo liên tiếp, tính theo phút Xác định hàm lượng protein theo Lowry cs (1951) [5], Điện di protein theo Laemmli (1970) [6]: mẫu (sau cô đặc qua màng cut-off ly tâm kDa, ngoại trừ dịch chiết thô) phân tách gel polyacrylamid 12%, 16 mA 1,5 Pro tem nhuộm Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma, Mỹ) 92 Kiểm tra hoạt tính gel (zymogram): gel thu sau chạy điện di SDS-PAGE loại bỏ SDS Triton X100 2,5%, ủ dung dịch L-DOPA10 mM qua đêm Các băng có hoạt tính tyrosinase có màu đen gel Ánh hưởng nhiệt độ, pH hóa chất đến hoạt tính tyrosinase: tiến hành tương tự phần xác định hoạt tính tyrosinase, phản ứng tiến hành nhiệt độ khác (và pH 6,8), pH khác (và nhiệt độ 45°C), có mặt hóa chất khác (ở pH 6,8 45°C) Để xác định độ bền, enzym ủ vói nhiệt độ, pH khảo sát thòi gian khác xác định hoạt độ lại so với ban đầu Khi xác định thông số động học, phản ứng tiến hành vói nồng độ chất khác (ở pH 6,8 45°C) KÉT QUẢ NGHIÊN Clỉu VÀ THÀO LUẬN 3.1 Làm tyrosinase Kết khảo sát tác nhân kết tủa nồng độ tác nhân kết tủa tyrosinase từ dịch chiết phần vỏ bao phía đỉnh búp (vị trí có hoạt độ tyrosinase cao thể nấm giai đoạn hình trứng, 168 u/mg mơ) trình bày bảng cho thấy, kết tủa ethanol nồng độ từ 20-80% cho hiệu suất thu hồi tyrosinase đạt 4-6%, kết tủa ammonium sulfate 60% 80% độ bão hòa cho hiệu suất thu hồi đạt 67,9% 79,7% Do đó, nghiên cứu này, kết tủa phân đoạn 60-80% độ bão hịa ammonium sulfate lựa chọn để đặc phân đoạn tyrosinase từ dịch chiết thô Bảng Kết tủa tyrosinase từ dịch chiết vỏ bao nấm rơm Nồng Ethanol Ammonium sulfate độ Hoạt độ Hiệu suất Hiệu suất Hoạt độ tác tyrosinase thu hồi tyrosinase thu hồi nhân (U/L) tyrosinase (U/L) tyrosinase kết (%) (%) tủa (%) 20 13 4,91 0 40 16 6,04 4,44 60 12 242 67,94 4,41 80 10 3,78 287 79,72 90 17 38 28,15 6,42 Dịch hòa tan kết tủa tyrosinase muối ammonium sulfate 60-80% độ bão hòa chứa lượng muối lớn tiếp tục làm qua cột sắc ký kỵ nước sắc ký lọc gel Kết NÒNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN nồng thôn - KỲ - THÁNG 5/2022 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ rình bày bảng Qua cột sắc ký kỵ nước, lyrosinase bị đẩy phân đoạn 11-15 có hoạt độ cao phân ũoạn 13 (trùng vói đỉnh protein thứ đỉnh protein thu được, kết không (tược trinh bày) Các phân đoạn 11-15 gộp lại đưa tiếp lên cột Sephadex G50, kết thu tyrosinase phân đoạn 10-24 (trùng vói đỉnh protein cao nhất) vói hoạt độ cao phân đoạn 14, độ tăng 16,4 lần so với dịch thô, hiệu suất thu hồi đạt 0,83% (Bảng 2) Bảng Tóm tắt q trình làm tyrosinase tử vỏ bao nấm rơm Bước làrr Protein Hoạt độ Độ Hoạt độ (mg/L) tyrosinase riêng (lần) (U/L) (U/mg) ỉnzym thô 677 84 0,124 cết tủa ammonium ìulíate 60-80% độ 202 281 1,392 11,2 tâo hòa iắc ký Butyl Sepharo se Fast Flow 42 76 1,773 14,3 ắc ký Sephadex G-7 i 10 21 2,039 16,4 Để kiểm tra độ tyrosinase sau trình tinh chế, tiến hàn.1 điện di SDS-PAGE Kết thu đưọc cho thấy didh tyrosinase thu sau sắc ky lọc gel sạch, chủ yếu băng protein có trọng lượng phân tử khoảng 22 kDa (Hình 1) IQOkDa 75 kDa 63 kDa 48 kDa 35 kDa 25 kDa 20 kDa 17 kDa 11 kDa Hihh Điện di đồ tyrosinase qua bước làm Dịch chiết thô; Phân đoạn 60-80% ammonium sulfate; Phân đoạn sau sắc ký kỵ nước; 4.1 ■’hàn đoạn sau sắc k_' lọc gel; M Hỗn họp protein chu.ẩn GangNam- STAI V™; z Zymogram dịch chiết thô Kết chạy zymo ?ram với mẫu dịch chiết thô cho thấy, ủ gel (sau chạy SDS-PAGE loại SDS với Triton X100) dung dịch chất ngày thấy xuất vạch màu đen tương ứng protein khối lượng khoảng 110 kDa vạch mờ ỷ vị trí tương ứng vói protein có khối lưọng 22 kDaI (Hình - giếng Z) Tyrosinase từ vỏ bao nấm rơm có khối lượng phân tử khoảng 110 kDa, gồm đơn vị có khối lượng khoảng 22 kDa Kết phù họp vói dự đốn T Suen (199) k lối lượng phân tử oligomer đơn vị polyphenol oxidase thu tì’ nấm rơm [7] Hiệu suất thu hồi (%) 100 22,3 2,99 0,83 3.2 Xác định tính chất tyrosinase từ vỏ bao nấm rơm 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính độ bền tyrosinase Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính tyrosinase trình bày hình cho thấy, enzym từ vỏ bao nấm rơm hoạt động khoảng nhiệt độ rộng từ 20°C - 80°C, với nhiệt độ tối ưu 45°c (thời gian phản ứng phút), tương tự nhiệt độ tối ưu tyrosinase tách thu từ mẫu nấm tồn phần cơng bố Suen T (1999) [7] cao nhiệt độ tối ưu tyrosinase từ Agaricus bisporus (35°C), Bacillus megaterium Lentinula boryana (40°C) [8], Ở nhiệt độ 4°c - 30°C, hoạt tính tyrosinase từ vỏ bao nấm rơm bền, bền nhiệt độ cao (Hình 2B) Thời gian bán hủy enzym 50“C khoảng 21 phút, thòi gian bán hủy 40°C 30°C 116 228 phút XhiệtđộCC) Thửigũn(phút) Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính (A) độ bền tyrosinase (B) NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ - THÁNG 5/2022 93 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 3.2.4 Xác định thông sô' động học phản ứng (A) J 150 ỉ 125 I 100 I 75 Đặn acetate pH 4,4-5.Ố —— Đẹmphosphate pH 5,6-8,0 * Đệm barat pH 8,0-92 tyrosinase Thời gian (phứt) Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt tính (A) độ bền tyrosinase (B) Vói chất L-DOPA, sử dụng đồ thị Hanes phần mềm Microsoft Excel xác định tốc độ cực đại phản ứng Nmax 0,056 pM/s số Miachelis Menten K„; enzym 0,82 mM, thấp hon so với K„, vói L-DOPA nấm mỡ (0,933 mM) [8] Giá trị Km nhỏ chứng tỏ lực lớn enzym với chất mà có liên quan đến khả gây biến màu nhanh nấm rom 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính độ bền tyrosinase Hình cho thấy, tyrosinase từ vỏ bao nấm rom hoạt động khoảng pH rộng từ pH 4,4 - pH 9,2 hoạt động tốt bền môi trường pH 6,8 - pH 8,0 Trong khoảng pH từ trung tính đến hoi kiềm, sau 180 phút, enzyme giữ 70% hoạt tính Tưong tự, tyrosinase từ nấm Pleurotus djamor bền khoảng pH từ 6-8 [9] Tyrosinase có pH tối ưu 6,8 (Hình 3A) 3.2.3 Ảnh hưởng hóa chất đến hoạt tính tyrosinase Kết khảo sát ảnh hưởng ion kim loại số hóa chất khác (thường dùng bảo quản thực phẩm chống biến nâu số loại nấm) đến hoạt tính tyrosinase trình bày hình cho thấy, tưong tự tyrosinase thu nhận từ nguồn khác, Cu2+ chất hoạt hóa EDTA, Ca2+ chất kim hãm tyrosinase nấm [7, 8] Tuy nhiên, với tyrosinase vỏ bao nấm, Ca2+ ức chế mạnh (hoạt tính cịn lại có mặt ion nồng độ mM 49%) Đáng ý, mM, nisin làm giảm mạnh hoạt tính tyrosinase vỏ bao nấm (hoạt tính cịn 60%), Fe2+ natri benzoate làm tãng mạnh hoạt tính tyrosinase (hoạt độ tưong ứng 194% 125% so vói đối chứng) Kali sorbat mM có ảnh hưởng hoạt hóa khơng nhiều Kết gợi ý sử dụng Ca2+ phối họp với nisin kali sorbat để bảo Hình Biểu đồ Hanes biểu diễn phương trình Michaelis-Menten dạng [S]/v = Km/VmaA + [S]/VmaA để xác định Km Nmax tyrosinase nấm rơm KẾT LUẬN Kết họp kết tủa 60-80% độ bão hòa ammonium sulfate, sắc ký qua cột Butyl Sepharose Fast Flow Sephadex G-50, tyrosinase phần vỏ bao nấm rom giai đoạn hình trứng tinh với độ gấp 16,4 lần, hiệu suất thu hồi đạt 0,8% Tyrosinase từ vỏ bao nấm rom có khối lượng phân tử 110 kDa, với đơn vị có khối lượng 22 kDa; có K,„ Vmax vói chất L-Dopa 0,82 mM 0,056 ụM/s; hoạt động tối ưu nhiệt độ 45°c, pH 6,8, bền khoảng nhiệt độ từ 4-30°C bền khoảng pH từ 6,8 đến 8,0; bị ức chế EDTA, nisin Ca2+; hoạt hóa Fe2+, Cu2+, kali sorbate natri benzoat nồng độ mM LOI CẢM 0N Nghiên cứu thực với tài trợ kinh phí đề tài T2020-PC-005 (Trường Đại học Bách khoa Hà Nội) TÁI LIỆU THAM KHÁO Hình Ảnh hưởng số hóa chất đến hoạt tính tyrosinase vỏ bao nấm rom 94 Dulay R (2015) Nutrient composition and functional activity of different stages in the fruiting body development of Philippine paddy straw NÒNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ - THÁNG 5/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ mushroom, Volvar'ella volvacea (Bull.’.Fr.) Sing Advances in Environmental Biology, 9, 54-56 phenol reagent Journal of Biological Chemistry 193 (l):265-275? Jamjumroon s., Wongs-Aree c., McGlasson w B., Srilaong V., Chalermklin p., Kanlayanarat s (2012) Extending tie shelf-life of straw mushroom with high carbon dioxide treatment Journal of Food Agriculture and Environment, 10(l):78-84 Laemmli u K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(5259) :680-685 Neeley E, Fritch G, Fuller A, Wolfe J, Wright , [, Flurkey w (2009) Variantions in IC50 values with lurity of mushroom tyrosinase InternationalJournal )f Molecular Sciences, 20,3811-3823 Do Bien C iong, Ha Ngoe Linh (2015) Selection of hydrolysis conditions of soybean by jUcalase to produce tyrosinase inhibitors Journal of Science and Technology Technical University 105 03-107 Lowry 0., Rosebrrough N J., Farr Al, Randall IL J (1951) Proteir measurement with the Folin Suen T (1999) Enzymatic browning of straw mushroom, Volvariella volvacea Master Thesis The Chinese University of Hong Kong Zaidi K u„ All A s„ All s A (2014) Purification and characterization of melanogenic enzyme tyrosinase from button mushroom Enzyme Research; 2014:120739 Sharma J., Sharma D., Sharma A, Bansal s (2021) Thermo stable tyrosinase purified from Pleurotus djamor grown in biomimetic calcium carbonate: A biological strategy to industrial waste remediation Environmental Technology & Innovation, 21, 2021:101294 CHARACTERISTICS OF TYROSINASE FROM THE VULVA TISSUE OF VIETNAM PADDYSTRAW MUSHROOM Do Bien Cuong, Nguyen The Duyet Summary Tyrosinase plays in important role in browning of mushroom products, but characteristics of this enzyme in surface tissue wl ere its color determines sensory quality of harvested Volvariella volvacea still have not admittedly knowi In this study, a tyrosinase from volva of a Vietnam paddy straw mushroom strain, more called Than-Nong, at the egg stage, was isolated by 60-80% saturated ammonium sulfate precipitation, following hydropl lobic chromatography on Butyl Sepharose Fast Flow and gel filtration chromatography on Sephadex G-jO with a purification fold of 16.4 Judged from zymogram analysis and sodium dodecyl sulfate-po lyacrylamide gel electrophoresis, the volva tyrosinase was an oligomer that had a native molecular size of 410 kDa and contained a single subunit with a size of ~22 kDa The purified enzyme was optimally active al temperature of 45°c and pH 6.8 and stable in a narrow range of pH from 6.8 to 8.0 and below 30°C Km and Vmax of the enzym for LrDOPA were 0.82 1Ĩ1M and 0.056 pM/s, respectively At the same concentration of mM, ferrous and cupric strongly activated tyrosinase, and potassium sorbate and sodium benzoate slightly promoted the enzyme activity By contrast, EDTA, nisin, and especially calcium inhibited the tyros inase severely at mM Keywords: Tyrosinase, volva, characterization, anti-browning, paddystraw mushroom Người phản biện TS Trần Thị Mai Ngày nhận bài: 15/12/2021 Ngày thông qua phản biện: 17/01/2022 Ngày duyệt đăng 24/01/2022 NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 5/2022 95 ... hãm tyrosinase nấm [7, 8] Tuy nhiên, với tyrosinase vỏ bao nấm, Ca2+ ức chế mạnh (hoạt tính cịn lại có mặt ion nồng độ mM 49%) Đáng ý, mM, nisin làm giảm mạnh hoạt tính tyrosinase vỏ bao nấm. .. polyphenol oxidase thu tì’ nấm rơm [7] Hiệu suất thu hồi (%) 100 22,3 2,99 0,83 3.2 Xác định tính chất tyrosinase từ vỏ bao nấm rơm 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính độ bền tyrosinase Kết khảo... cô đặc phân đoạn tyrosinase từ dịch chiết thô Bảng Kết tủa tyrosinase từ dịch chiết vỏ bao nấm rơm Nồng Ethanol Ammonium sulfate độ Hoạt độ Hiệu suất Hiệu suất Hoạt độ tác tyrosinase thu hồi tyrosinase