kl nguyen anh tuan 062433s

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.NIGER VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA DÙNG CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực TS NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN ANH TUẤN CN ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, kính ghi ơn ơng bà, cha mẹ sinh thành nguồn động viên, khích lệ cho chúng trình học tập suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Em xin gởi lời lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Tôn Đức Thắng Viện Nghiên Cứu Sinh Học Nhiệt Đới Gởi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Tiến Thắng, CN Đỗ Thị Tuyến tận tình hướng dẫn em Trong suốt q trình thực hiện, thầy ln nhắc nhở, sửa chữa sai sót khơng ngừng động viên tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn thầy cô giáo Ngành Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Tơn Đức Thắng tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu bạn lớp 06Sh1D nhiệt tình giúp đỡ em suốt thời gian 4,5 năm học tập trường Mặc dù có nhiều cố gắng khóa luận chắn khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận góp ý từ thầy bạn để khóa luận hoàn thiện Cuối em xin chúc TS Nguyễn Tiến Thắng, CN Đỗ Thị Tuyến, quý Thầy Cô ngành Cơng Nghệ Sinh Học tồn thể bạn lớp Công Nghệ Sinh Học dồi sức khỏe thăng tiến đường nghiệp TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Sinh viên Nguyễn Anh Tuấn TÓM TẮT Tên đề tài: “THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.NIGER VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA DÙNG CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC” Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH TUẤN Đơn vị: 06SH1D, Bộ môn Công nghệ Sinh Học – ĐH Tôn Đức Thắng Thời gian thực hiện: học kỳ I, năm học 2010-2011 Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới Mục đích đề tài:  Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp Niger, khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến enzyme  Tìm điều kiện nồng độ, nhiệt độ, thời gian để tối ưu hố q trình thuỷ phân nội tạng cá Ba Sa enzyme Protease Phương pháp thực hiện:  Tìm hiểu tổng quan tài liệu đề tài  Tính thông số điều kiện cần thiết q trình thí nghiệm Kết  Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp Niger  Tìm điều kiện tối ưu trình thuỷ phân nội tạng cá Ba Sa  Sản xuất thử bột làm nguyên liệu phối trộn chế biến thức ăn cho gia súc ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC HÌNH .viii DANH MỤC CÁC BẢNG x Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung đề tài Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khát quát chung enzyme 2.1.1 Sơ lược lịch sử enzyme 2.1.2 Định nghĩa enzyme 2.1.3 Tính ưu việt enzyme 2.1.4 Nguồn vật liệu để thu nhận enzyme 2.1.5 Công nghệ sản xuất enzyme 2.2 Khát quát chung enzyme protease 2.2.1 Định nghĩa 2.2.2 Phân loại Protease 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân enzyme 2.2.3.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme 2.2.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất 2.2.3.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm chất hoạt hóa 2.2.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 2.2.3.5 Ảnh hưởng pH môi trường 2.2.3.6 Ảnh hưởng thời gian thủy phân 2.2.3.7 Ảnh hưởng lượng nước 10 iii 2.2.4 Ứng dụng Protease 10 2.3 Khát quát chung nấm Asp Niger 12 2.4 Phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh vật phương pháp lên men bề mặt 12 2.4.1 Định nghĩa 12 2.4.2 Ưu điểm 12 2.4.3 Nhược điểm 13 2.4.4 Phương pháp lên men bề mặt với môi trường bán rắn 13 2.5 Thu nhận enzyme 13 2.6 Cá Ba Sa phế liệu trình chế biến 13 2.6.1 Đặc điểm sinh học cá Ba Sa 13 2.6.1.1 Phân loại khoa học 13 2.6.1.2 Hình thái 14 2.6.1.3 Phân bố 15 2.6.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng 15 2.6.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 15 2.6.1.6 Đặc điểm sinh sản 15 2.6.2 Tình hình sản xuất cá Ba Sa Việt Nam 16 2.6.3 Phế liệu cá 16 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 3.1 Đối tượng nguyên cứu 17 3.1.1 Vật liệu 17 3.1.2 Hóa chất 17 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 17 3.2 Phương pháp nguyên cứu thu nhận enzyme Protease 18 3.2.1 Thu nhận enzyme từ Vi sinh vật phương pháp lên men bề mặt sử dụng chất bán rắn 19 3.2.1.1 Nấm mốc Asp Niger 19 3.2.1.2 Hóa chất 19 iv 3.2.1.3 Thiết bị 19 3.2.1.4 Chuẩn bị môi trường 19 3.2.1.5 Nuôi cấy nấm mốc Asp Niger 19 3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme Protease 20 3.2.3 Xác định protein phương pháp Bradford 21 3.2.3.1 Nguyên tắc 21 3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm 21 3.2.3.3 Tính kết 22 3.2.4 Xác định hoạt độ enzyme protease 22 3.2.4.1 Nguyên tắc 22 3.2.4.2 Tiến hành thí nghiệm 23 3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme 25 3.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 26 3.2.4.5 Độ bền nhiệt enzyme theo thời gian 27 3.2.5 Tinh enzyme protease sắc khí lọc gel (sắc ký rây phân tử) 27 3.2.5.1 Bản chất phương pháp 27 3.2.5.2 Nguyên tắc 27 3.2.5.3 Hóa chất thiết bị 28 3.2.5.4 Tiến hành chạy sắc ký 28 3.3 Các phương pháp phân tích hóa học từ nội tạng cá Ba Sa 30 3.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 30 3.3.2 Phương pháp xác định khoáng tổng số 31 3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi 33 3.3.4 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (Định lượng nitơ tổng số) 34 3.3.5 Phương pháp định lượng Phospho tổng số quang phổ kế 35 3.3.6 Xác định lượng đạm amin theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thủy phân protein 38 3.3.7 Xác định protein hòa tan phương pháp biuret 39 3.3.8 Xác định NH3 cách chưng cất theo nước 40 v 3.4 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân cá Ba Sa 41 3.5 Thí nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa 43 3.6 Thí nghiệm sản xuất thử bột nguyên liệu thô dùng phối trộn chế biến thức ăn gia súc 45 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 4.1 Một số tiêu nấm mốc Asp Niger 46 4.1.1 Chiết xuất thô enzyme protein từ nấm mốc Asp Niger kết tủa enzyme cồn lạnh 46 4.1.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt enzyme protease 46 4.1.2.1 pH tối ưu 46 4.1.2.2 Nhiệt độ tối ưu 47 4.1.2.3 Độ bền nhiệt enzyme protease 49 4.2 Tiến hành tinh enzyme protease từ nấm mốc Niger phương pháp lọc gel 50 4.3 Khảo sát ảnh hưởng trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa enzyme protease 54 4.3.1 Một số tiêu sinh học hoá học nội tạng cá Ba Sa 54 4.3.2 Sự biến động protein 54 4.3.3 Sự biến động đạm amin 56 4.3.4 Sự biến động NH3 58 4.4 Điều kiện tối ưu hóa hàm lượng protein 60 4.5 Điều kiện tối ưu hóa hàm lượng đạm amin 64 4.6 Thí nghiệm sản xuất thử thức ăn gia súc 69 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 5.1 Kết luận 71 5.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT EDTA : Etilendiamin tetraaxetic axit TCA: Trichloaxetic axit UV-Vis: Ultraviolet-visible spectroscopy OD: Optical Density (trị số mật độ quang) ĐVHT: Đơn vị hoạt tính HT Hoạt tính enzyme HTR: : Hoạt tính riêng vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Quan sát nấm Asp Niger qua kính hiển vi 12  Hình 2.2: Cá Ba Sa 14  Hình 3.1 Sơ đồ ni cấy nấm mốc thu nhận enzyme thô 18  Hình 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme 26  Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 26  Hình 3.4 Độ bền nhiệt enzyme theo thời gian 27  Hình 3.5 Sơ đồ trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa 42  Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease 47  Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease 48  Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt enzyme protease 49  Hình 4.4 Sắc kí enzyme protease chuẩn hãng AMANO 51  Hình 4.5 Sắc kí tủa enzyme protease cồn tỉ lệ 1:4 52  Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn độ tinh enzyme trước sắc ký, sau sắc ký hãng Amano 53  Hình 4.7 Khảo sát hàm lượng protein 400C 54 Hình 4.8 Khảo sát hàm lượng protein 500C…………………………………….54 Hình 4.9 Khảo sát hàm lượng protein 600C 55  Hình 4.10 Khảo sát hàm lượng đạm amin 400C 56  Hình 4.11 Khảo sát hàm lượng đạm amin 500C 57  Hình 4.12 Khảo sát hàm lượng đạm amin 600C 57  Hình 4.13 Khảo sát hàm lượng NH3 400C 58  Hình 4.14 Khảo sát hàm lượng NH3 500C 59  Hình 4.15 Khảo sát hàm lượng NH3 600C 59  Hình 4.16 Mơ hình thể tương thích yếu tố tác động lên hàm lượng protein 61  Hình 4.17 Mơ hình bề mặt đáp ứng yếu tố lên hàm lượng protein 62  Hình 4.18 Ảnh hưởng yếu tố lên hàm lượng protein 63  Hình 4.19 Tương tác yếu tố lên hàm lượng protein 63  viii Hình 4.20 Mơ hình thể tương thích yếu tố tác động lên hàm lượng đạm amin 64  Hình 4.21 Mơ hình bề mặt đáp ứng yếu tố lên hàm lượng đạm amin 66  Hình 4.22 Ảnh hưởng yếu tố lên hàm lượng đạm amin 67  Hình 4.23 Tương tác yếu tố lên hàm lượng đạm amin 67  Hình 4.24 Sơ đồ quy trình sản xuất bột nội tạng 70  ix Luận Văn Tốt Nghiệp 5.2 Kiến nghị Nhu cầu xử lý nội tạng cá Ba Sa lớn cấp bách phát triển enzyme Tơi có số kiến nghị: - Cần mở rộng quy mô sản xuất thức ăn gia súc tận dụng nội tạng cá Ba Sa, giải vấn đề ô nhiễm môi trường - Trang bị nhiều thiết bị nghiên cứu enzyme trình thủy phân nội tạng cá loài động vật thủy sinh khác - Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất chế phẩm protein thương mại đáp ứng yêu cầu enzyme protein sở sản xuất thay nguồn enzyme nhập - Tiếp tục nghiên cứu phát triển ứng dụng chế phẩm protease ngành chế biến thủy sản, công nghiệp thực phẩm lĩnh vực khác sản xuất đời sống tạo đầu cho ngành sản xuất enzyme SV : Nguyễn Anh Tuấn 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Theo sách [1] GS Nguyễn Văn Thưởng, G.S, TS Lê Hồng Mận, PTS Bùi Đức Lũng, KS Nguyễn Đức Trân,Thành phần giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc gia cầm Việt nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội (2000) [2] Nguyễn Cảnh Qui hoạch thực nghiệm trường Đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh [3] Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, Thực hành hóa sinh học [4] Nguyễn Tiến Thắng Một số kỹ thuật phịng thí nghiệm sinh học Viện Sinh Học Nhiệt Đới, 2003 [5] Đỗ Văn Ninh, Một số tính chất enzyme protease nội tạng cá thu, Tạp chí thủy sản số 3, trang 20-22, (2003) [6] Trần Quốc Hiền, Lê VănViệt Mẫn, Nghiên Cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Ba Sa, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số 11-2006 [7] Hội thảo chương trình Card 026/VIT05 “điều tra kiểm soát nứt hạt lúa đồng ruộng sau thu hoạch đồng sông Cửu Long Việt Nam” [8] Hồng Kim Anh, Hóa học Thực phẩm [9] Rodney F B, Modern experimental biochemistry, The Benjamin/ Cummings Publishin Company, Inc, 555p (1993) [10] Roe S, Protein purification techniques, Oxford University press, 262p ( 2001) Theo web [11] http://www.vietlinh.com.vn/kithuat/ca/basantra/basa.htm [12] http://community.h2vn.com/index.php?topic=13888.0 [13] http://longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=3582&catID=2 [14]http://laithieu.com.vn/index.php?Module=Product&Action=view&catId=242&id= 55&Itemid=418 [15] http://www.cp.com.vn/tags/petfoodc.aspx# [16]http://www.hua.edu.vn:85/cnts/index.php?option=com_content&task=view&id=5 67&Itemid=310 [17]http://www.congnghehoahoc.org/forum/archive/index.php?t-2051.html [18] http://nguyenanhvn.com/?mod=about&file=about_des&cat_id=40&id=64 [19]http://www.molecularstation.com/sds-page-gel-electrophoresis/ [20]http://www.google.com.vn/images?hl=vi&q=SDS-PAGE&um=1&ie=UTF8&source=univ&ei=JPhxTOi1JIf0swOxyc3FCw&sa=X&oi=image_result_group&ct= title&resnum=4&ved=0CEEQsAQwAw&biw=1016&bih=510 [21] http://opac.lrc.ctu.edu.vn/pdoc/61/caTra.pdf [22] http://agriviet.com/nd/573-%C3%90ac-%C3%90iem-sinh-hoc-ca-tra-va-ca-ba-sa/ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn đo tiêu sinh hóa Phụ lục 1.1: Đường chuẩn Biuret Phụ lục 1.2: Đường chuẩn Protein Phụ lục 1.3: Đường chuẩn Phospho Phụ lục 2: Khảo sát biến động Protein, đạm amin NH3 Phụ lục 2.1: Số liệu thể biến động Protein a Sự biến động protein 40oC Thời Nồng độ enzyme gian 0h 0,5% 0,7% 0,9% 1,679 1,785 1,806 2h 3,698 4,438 4,730 4h 4,101 4,863 5,244 6h 4,593 5,229 5,732 8h 5,435 5,502 5,756 10h 5,498 5,956 5,947 b.Sự biến động protein 50oC Thời Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% gian 0h 1,968 2,44 2,225 2h 4,854 5,775 5,947 4h 5,552 6,374 6,218 6h 5,862 6,697 6,461 8h 10h 6,644 7,026 6,845 7,335 6,982 7,337 c Sự biến động protein 60oC gian 0h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 1,864 2,599 2,912 2h 4h 6h 8h 10h 2,766 3,544 3,981 4,396 4,403 Thời 5,275 5,578 6,524 6,900 7,112 5,553 6,264 6,902 7,102 7,216 Phụ lục 2.2: Số liệu thể biến động đạm amin a Sự biến động đạm amin 400C Thời gian 0h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 9,247 11,120 11,298 2h 4h 6h 8h 10h 9,893 10,982 11,461 11,855 12,244 12,858 13,667 14,936 15,496 15,716 13,653 14,986 15,815 16,100 16,314 b Sự biến động đạm amin 50oC Thời gian 0h 2h 4h 6h 8h 10h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 12,019 14,620 14,800 12,897 15,638 15,813 13,488 16,461 17,123 14,153 17,758 17,903 14,468 18,494 18,595 14,476 18,530 18,640 b.Sự biến động đạm amin 60oC Thời Nồng độ enzyme gian 0h 0,5% 0,7% 0,9% 5,318 5,504 5,450 2h 6,892 8,041 8,066 4h 7,320 8,298 8,735 6h 7,908 8,928 9,650 8h 8,180 9,800 9,850 10h 8,450 10,102 10,122 Phụ lục 2.3: Số liệu thể biến động NH3 a Sự biến động NH3 400C Thời gian 0h 2h 4h 6h 8h 10h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 0,698 0,678 0,504 0,893 0,756 0,554 1,035 0,872 0,638 1,135 0,999 0,691 1,39 1,196 0,756 1,506 1,306 0,913 b Sự biến động NH3 500C Thời gian 0h 2h 4h 6h 8h 10h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 0,623 0,634 0,646 0,661 0,691 0,669 0,713 0,723 0,692 0,764 0,756 0,726 0,901 0,842 0,836 1,001 0,99 0,986 c Sự biến động NH3 600C Thời Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% gian 0h 0,696 0,647 0,695 2h 0,719 0,664 0,718 4h 0,847 0,731 0,783 6h 0,999 0,826 0,923 8h 1,171 1,035 1,001 10h 1,358 1,263 1,266 Phụ lục 3: Số liệu hàm lượng protein đạm amin để tối ưu hố chương trình JMP 4.0 STN 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X2 X3 Đạm Amin Protein Pattern X1 -++ -1 1 8.456 4.403 +++ 1 10.12 7.216 000 0 17.789 6.692 000 0 17.811 6.698 00A 0 1.681793 18.553 7.339 -1 -1 -1 9.893 3.684 000 0 17.799 6.691 A00 1.681793 0 18.011 6.652 -+-1 -1 7.123 2.719 0a0 -1.68179 14.362 4.911 0A0 1.681793 8.793 6.401 000 0 17.823 6.721 +-1 -1 -1 13.653 4.721 00a 0 -1.68179 14.691 2.449 ++1 -1 8.566 6.791 a00 -1.68179 0 13.526 5.423 + -1 -1 12.245 5.498 000 0 17.801 6.722 000 0 17.836 6.712 +-+ -1 16.311 Phụ lục 4: Kết xử lý số liệu JMP 4.0 Phụ lục 4.1: Response protein Y Actual 2 Y Predicted P=0.0003 RSq=0.88 RMSE=0.6682 5.926 Summary of Fit RSquare 0.878869 RSquare Adj 0.801786 Root Mean Square Error 0.668189 Mean of Response 5.707526 Observations (or Sum Wgts) 19 Analysis of Variance Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Model 35.633780 5.09054 11.4016 Error 11 4.911246 0.44648 Prob > F C Total 18 40.545027 0.0003 Lack Of Fit Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Lack Of Fit 4.9102444 0.818374 4083.703 Pure Error 0.0010020 0.000200 Prob > F Total Error 11 4.9112464 Max RSq 1.0000 Parameter Estimates Term Estimate Std Error t Ratio Prob>|t| Intercept 6.7219459 0.273324 24.59 F Total Error 12 47.381741