kl le thanh thuy 062323s

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG W W KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT VÙNG TRỒNG DIẾP CÁ (H cordata Thumb) Ở CÁC TỈNH LONG AN BÌNH DƯƠNG VÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DÙNG LÀM THUỐC CỦA DIẾP CÁ TẠI VÙNG KHẢO SÁT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH THÚY Niên khóa: 2006 -2011 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01 năm 2011 TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG W W KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT VÙNG TRỒNG DIẾP CÁ (H cordata Thumb) Ở CÁC TỈNH LONG AN BÌNH DƯƠNG VÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DÙNG LÀM THUỐC CỦA DIẾP CÁ TẠI VÙNG KHẢO SÁT Giảng Viên Hướng Dẫn Sinh viên thực PGS TS TRƯƠNG PHƯƠNG LÊ THANH THÚY TS HỒ THỊ KIM THẠCH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Qua tháng thực đề tài, em học hỏi nhiều điều việc làm người nghiên cứu khoa học, cách giao tiếp ứng xử hàng ngày, cách làm việc độc lập sinh hoạt tập thể Tuy tránh khỏi thành cơng thất bại điều giúp em trưởng thành nhiều Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc em xin gửi đến thầy PGS.TS Trương Phương, cô, TS Hồ Thị Kim Thạch, lịng nhiệt huyết với nghề tận tâm thầy cô giúp em hiểu công việc người làm nghiên cứu ngày hồn thiện để trở thành người có ích cho xã hội Em xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Xuân Ngọc, thầy PGS.TS Trương Phương dành thời gian đọc sửa chữa thiếu sót để khóa luận em hồn chỉnh tốt Em xin cám ơn thầy cô Bộ Mơn Hố Dược, Bộ Mơn Dược Liệu, thầy Khoa Dược giúp đỡ truyền đạt kinh nghiệm quý báu thời gian thực đề tài Cảm ơn anh chị Phịng Thí Nghiệm Hố Dược Dược Liệu ln nhiệt tình bảo giúp đỡ em có tình thực đề tài TP Hồ Chí Minh ngày 10 tháng 01 năm 2011 Lê Thanh Thúy i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ .v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 2.1.1 Tên gọi 2.1.2 Vị trí phân loại 2.1.3 Mô tả 2.1.4 Phân bố, sinh thái 2.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.2.1 Tinh dầu 2.2.2 Flavonoid 2.2.3 Alkaloid 2.2.4 Dẫn chất thơm đơn giản 2.2.5 Thành phần khác 2.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ, CÔNG DỤNG CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM 12 3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12 3.2.1 Đối tượng 12 3.2.2 Dụng cụ trang thiết bị 12 3.3.1 Bước đầu khảo sát vùng trồng diếp cá tỉnh Bình Dương, Long An, TP Hồ Chí Minh 13 3.3.1.1 Khảo sát hình thái học .13 3.3.1.2 Khảo sát vi học 13 ii 3.3.1.3 Soi bột 14 3.3.2 Đánh giá chất lượng diếp cá vùng khảo sát 14 3.3.3 Khảo sát tính kháng khuẩn tinh dầu 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .22 4.1 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT VÙNG TRỒNG DIẾP CÁ TẠI CÁC TỈNH BÌNH DƯƠNG, LONG AN, TP HỒ CHÍ MINH 22 4.1.1 Đặc điểm hình thái 22 4.1.2 Thu nguyên liệu xử lý nguyên liệu 27 4.1.3 Đặc điểm vi phẫu 28 4.1.3.1 Vi phẫu thân .28 4.1.3.2 Vi phẫu 29 4.1.3.3 Soi bột 30 4.2 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA DIẾP CÁ THU TỪ CÁC VÙNG KHẢO SÁT 31 4.3 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU DIẾP CÁ 40 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .43 5.1 KẾT LUẬN 43 5.2 ĐỀ NGHỊ .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Vị trí phân loại chi Houttuynia giới thực vật Bảng 2.2 Một số chế phẩm chứa diếp cá thị trường 11 Bảng 4.1 Chiều dài thân diện tích vùng khảo sát 22 Bảng 4.2 Năng suất diếp cá vùng khảo sát 23 Bảng 4.3 Độ ẩm diếp cá vùng khảo sát 31 Bảng 4.4 Phân tích phương sai ANOVA cho độ ẩm mẫu 32 Bảng 4.5 Phân tích phương sai ANOVA cho độ ẩm mẫu thân 32 Bảng 4.6 Tỷ lệ tạp chất diếp cá 33 Bảng 4.7 Phân tích phương sai ANOVA cho tạp chất mẫu 33 Bảng 4.8 Phân tích phương sai ANOVA cho tạp chất mẫu thân 34 Bảng 4.9 Tỷ lệ vụn nát diếp cá 34 Bảng 4.10 Phân tích phương sai ANOVA cho tỷ lệ vụn nát mẫu 35 Bảng 4.11 Phân tích phương sai ANOVA cho tỷ lệ vụn nát mẫu thân 35 Bảng 4.12 Hàm lượng chất chiết diếp cá 36 Bảng 4.13 Độ tro toàn phần diếp cá 38 Bảng 4.14 Hàm lượng tinh dầu diếp cá 39 Bảng 4.15 Phân tích phương sai ANOVA cho tinh dầu mẫu 35 iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Biểu đồ 4.1 Năng suất diếp cá vùng khảo sát 23 Biểu đồ 4.2 Diện tích diếp cá vùng khảo sát 23 Biểu đồ 4.3 Chiều dài thân diếp cá vùng khảo sát 24 Biểu đồ 4.4 Hàm lượng chất chiết thân diếp cá 37 Biểu đồ 4.5 Độ tro toàn phần diếp cá 38 Biểu đồ 4.6 Hàm lượng tinh dầu diếp cá 40 Sơ đồ 3.1 Quy trình vi phẫu diếp cá tươi 14 Sơ đồ 3.2 Quy trình xác định chất chiết diếp cá 17 Sơ đồ 3.3 Quy trình xác định tro tồn phần 18 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây diếp cá Hình 2.2 Hoa Diếp cá Hình 3.1 Lá diếp cá khô 12 Hình 3.2 Mơ tả cách tính diện tích diếp cá 13 Hình 3.3 Mơ tả cách thu mẫu diếp cá 15 Hình 3.4 Thân diếp cá sau xử lý 16 Hình 3.5 Thiết bị chưng cất tinh dầu lôi nước 19 Hình 3.6 Vịng kháng khuẩn 21 Hình 3.7 Khuẩn lạc vi khuẩn thạch 21 Hình 4.1 Quả diếp cá 22 Hình 4.2 Diếp cá giai đoạn phát triển 26 Hình 4.3 Thu hoạch diếp cá 27 Hình 4.4 Lá diếp cá tươi 28 Hình 4.5 Lá diếp cá khô 28 Hình 4.6 Thân diếp cá tươi 28 Hình 4.7 Thân diếp cá khô 28 Hình 4.8 Hình chụp vi phẫu thân diếp cá 29 Hình 4.9 Hình chụp vi phẫu diếp cá tươi 30 Hình 4.10 Các cấu tử bột thân diếp cá 30 Hình 4.11 Các cấu tử bột diếp cá 31 Hình 4.12 Tinh dầu diếp cá 38 Hình 4.13 Định tính khả kháng khuẩn tinh dầu 40 Hình 4.14 Xác định MIC tinh dầu 41 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT MIC CHỮ NGUYÊN Ý NGHĨA Milimum inibitory Concentratio Nồng độ ức chế tối thiểu tinh dầu với vi khuẩn IC Nồng độc ức chế vi sinh vật DMSO Dimethyl sulfoxide DĐVN Dược điển Việt nam TSB Trypton soy broth TSA Trypton soy agar HC Houttuynia cordata Thumb TP Thành phần TB Trung bình HL Hàm lượng TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh Ptl Phân tử lượng DC Diếp cá EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetate vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước có truyền thống y học cổ truyền từ hàng nghìn năm với danh y tiếng Tuệ Tĩnh, Hải Thượng Lãn Ông Bên cạnh Việt Nam nước có tiềm lớn động thực vật mà nhiều sử dụng làm thuốc, góp phần tích cực vào cơng tác phịng chữa bệnh cho nhân dân Nắm bắt ưu từ lâu Đảng, nhà nước, Bộ Y tế khuyến khích sưu tầm, ni trồng phát triển nguyênliệu thuốc có nguồn gốc thiên nhiên Đây xu hướng chung y học giới: hướng tới nguồn nguyên liệu làm thuốc từ thiên nhiên ưu giá thành rẻ, độc Trong xu hướng chung trường Đại học Tôn Đức Thắng kết hợp với Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM nghiên cứu số thuốc Việt Nam Sự kết hợp đề tài nghiên cứu phát huy mạnh trường lĩnh vực nuôi trồng phát triển dược liệu nghiên cứu đánh giá khả sử dụng làm thuốc dược liệu Trong trình nghiên cứu số thuốc nước ta, chúng tơi nhận thấy diếp cá ngồi việc sử dụng làm rau sống từ lâu phổ biến thuốc dân gian sử dụng nhiều để điều trị bệnh: trĩ, mụn nhọt, áp xe phổi… Một số nghiên cứu gần phát thêm nhiều tác dụng quí diếp cá như: tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống viên tuyến vú [10], có tác dụng kháng viêm [21,28] Diếp cá đưa Dược điển Việt Nam IV Đây dược liệu q cần có quan tâm quan việc quy hoạch vùng trồng, đầu biện pháp kỹ thuật giúp nâng cao chất lượng Tuy nhiên Việt Nam mà cụ thể tỉnh phía Nam việc trồng diếp cá mang tính tự phát, gia đình chủ yếu phục vụ làm gia vị Chưa có nghiên cứu nhằm qui hoạch phát triển theo hướng làm thuốc Chưa có nghiên cứu chi tiết đầy đủ điều kiện nuôi trồng dược liệu Về phương pháp kiểm nghiệm, Dược điển Việt Nam IV đưa tiêu đánh giá chất lượng diếp cá Tuy nhiên tiêu chủ yếu dựa diếp cá trồng phía Bắc Chưa có đánh giá chất lượng diếp cá mọc vùng phía Nam Ngay tác dụng dược lý diếp cá Việt Nam dựa kinh Bảng 4.8 Phân tích phương sai ANOVA cho tỷ lệ tạp chất mẫu thân Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Column 4,4130 1,4710 0,1172 Column 3,9900 1,3300 0,2368 Column 3 4,1513 1,3837 0,0266 Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 0,0303 0,0151 0,1196 0,8892 5,1432 Within Groups 0,7615 0,1269 Total 0,7919 ANOVA Source of Tỷ lệ tạp chất nguyên liệu thu từ vùng khảo sát thuộc giới hạn cho phép quy định DĐVN IV tạp chất nguyên liệu dùng làm dược liệu (không 2%) Như kết phân tích ANOVA mẫu thân cho thấy giá trị FA (=0,11968) nhỏ so với F0,05 tra bảng (=5,143253) hay P tính 0,889267 lớn tất nhiều so với 0,05; giả thiết đồng giá trị trung bình yếu tố A chấp nhận được, tức tỷ lệ tạp chất diếp cá vùng không khác thật sự, nhận giả thuyết H0 4.2.3 Tỷ lệ vụn nát Cân 200g nguyên liệu (lá thân) loại tạp chất Rây qua rây có 3,15mm Cân tồn ngun liệu lọt qua rây (a gam) Bảng 4.9 Tỷ lệ vụn nát diếp cá Bình Dương Long An TP HCM Lá Thân Lá Thân Lá Thân 3,2195 2,1349 3,5892 2,1331 2,7514 2,0885 3,312 2,1468 3,4831 2,135 2,2863 2,159 3,259 1,9616 3,097 2,2139 3,0311 2,0314 X%tb 3,2635 2,0811 3,3898 2,1607 2,6896 2,093 34 Bảng 4.10 Phân tích phương sai ANOVA cho tỷ lệ mẫu Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Column 4,4130 1,4710 0,1172 Column 3,9900 1,3300 0,2368 Column 3 4,1513 1,3837 0,0266 Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 0,0303 0,0151 0,1196 0,8892 5,1432 Within Groups 0,7615 0,1269 Total 0,7919 ANOVA Bảng 4.11 Phân tích phương sai ANOVA cho tỷ lệ vụn nát mẫu thân Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Column 6,2433 2,0811 0,0107 Column 6,4820 2,1606 0,0021 Column 3 6,2789 2,0927 0,0040 Source of Variation SS df MS F Between Groups 0,0110 0,0055 Within Groups 0,0339 0,0056 Total 0,0449 ANOVA P-value F crit 0,4289 Tỷ lệ vụn nát theo quy định dược điển ≤ 5%, diếp cá vùng khảo sát đạt yêu cầu để dùng làm thuốc (PL 4) Kết luận: Như kết phân tích ANOVA cho thấy giá trị FA (=0,977898) nhỏ so với F0,05 tra bảng (=5,143253) hay P tính 0,977898 lớn tất nhiều so với 0,05; giả thiết đồng giá trị trung bình yếu tố A 35 chấp nhận được, tức tỷ lệ vụn nát diếp cá vùng không khác thật sự, nhận giả thuyết H0 Kết luận: Từ kết cho thấy độ ẩm (bảng 4.1), tỷ lệ vụn nát (bảng 4.4), tỷ lệ tạp chất (bảng 4.7) nguyên liệu thu vùng khảo sát không khác đạt tiêu chuẩn DĐVN IV (phụ lục 4) Các số mẫu ổn định vùng Các kết đạt giúp khẳng định quy trình xử lý nguyên liệu nghiên cứu áp dụng quy mô sản xuất lớn 4.2.4 Hàm lượng chất chiết nguyên liệu Cân 4g bột nguyên liệu (lá thân) cho vào bình nón 250ml Thêm 100ml cồn, đậy kín, cân, để n 1h, sau đun nhẹ hồi lưu 1h, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, dùng cồn bổ sung vào khối lượng bị giảm, lọc qua phễu khơ vào bình hứng khơ thích hợp Lấy xác 25ml dịch lọc vào cốc thủy tinh cân trừ bì trước, bếp cách thủy đến cắn khô, cắn thu sấy 1050C 3h, lấy để nguội bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn thu kết sau: Bảng 4.12 Mẫu Hàm lượng chất chiết diếp cá Bình Dương Long An TP HCM Lá cọng Lá cọng cọng a1(g) 4,016 4,0161 4,0163 4,0164 4,0166 a2(g) 4,0122 4,0162 4,0144 4,0146 4,0169 a3(g) 4, 0119 4,0162 4,0159 4,0149 4,0172 b1(g) 0,5449 0,232 0,5685 0,3448 0,4638 b2(g) 0,5342 0,3158 0,5663 0,3543 0,5342 b3(g) 0,5619 0,2142 0,4453 0,4234 0,6353 X1% 30,3234 12,9118 31,2866 19,1882 25,8642 X2% 29,1033 17,7522 31,5304 19,7257 24,2117 X3% 31,3014 11,9208 24,7841 23,5711 35,4227 Xtb% 20,2427 14,1949 24,2004 20,8283 28,4995 36 HLchất chiết trongDC(% ) 45 40 35 30 25 20 15 10 Bình Dương Long An TP HCM Vùng khảo sát HL chất chiết DC Biểu đồ 4.4 HL chất chiết thân DC Hàm lượng chất chiết thân diếp cá Hàm lượng chất chiết hoạt chất có tác dụng hay khơng có tác dụng dược lý chứa nguyên liệu Hàm lượng chất chiết diếp cá cao thân, hàm lượng vùng TP HCM cao (28,4995%) (bảng 4.12) Hàm lượng chất chiết thu vùng đạt tiêu chuẩn quy định Dược điển Việt Nam IV (>11%) (bảng phụ lục 4) 4.2.5 Độ tro toàn phần Cân khoảng 1g bột nguyên liệu (lá thân) trải vào chén sứ nung nóng cân trừ bì sẵn, sấy chén 1050C 1h Sau đem nung chén 6000C ±250C khơng cịn carbon Đợi lò nung giảm nhiệt độ, lấy mẫu làm nguội bình hút ẩm, cân nhanh khối lượng Bảng 4.13 Mẫu Độ tro toàn phần diếp cá Bình Dương Long An TP HCM Lá cọng Lá cọng Lá cọng p1(g) 1,0113 1,0111 1,0094 1,0311 1,0161 1,0161 p2(g) 1,0128 1,0166 1,0115 1,0219 1,0133 1,0143 p3(g) 1,0201 1,0113 1,0139 1,0119 1,0129 1,0122 a1(g) 0,023 0,0675 0,0363 0,0737 0,0455 0,0381 a2(g) 0,0432 0,0679 0,0338 0,0748 0,023 0,0378 a3(g) 0,0348 0,0531 0,0241 0,0785 0,0037 0,0437 X1% 2,2743 6,6759 3,5962 7,14771 4,4779 3,7496 X2% 4,2654 6,6791 3,3416 7,3197 2,2698 3,7267 X3% 3,4114 5,2507 2,377 7,75768 0,3653 4,3173 Xtb% 3,317 6,2019 3,1049 37 7,40836 2,771 4,9312 Đ ộtrotoànphần(% ) Bình Dương Long An Vùng khả o sát TP HCM Độ tro toàn phần diếp cá Độ tro toàn phần thân diếp cá Biểu đồ 4.5 Độ tro toàn phần diếp cá Độ tro theo quy định ≤ 14%, diếp cá vùng khảo sát không vượt tiêu quy định dược điển Độ tro cao Long An chứng tỏ hàm lượng muối vô cao vùng khác Độ tro toàn phần chất khống ngun liệu, hay chất vơ từ đất bám vào nguyên liệu trình thu hoạch 4.2.6 Định lượng tinh dầu diếp cá Cho 500g nguyên liệu (lá thân) vào bình cất chứa sẵn lít nước Nâng nhiệt độ lên 600C, nước bình cất bốc kéo theo tinh dầu, dịch cất hứng vào ống chia độ có chứa sẵn nước để giữ lại tinh dầu, pha nước chảy tự động trở lại bình cất Ngưng cất sau 3h, đọc thể tích hỗn hợp tinh dầu ống hứng nhiệt độ ống hứng trở nhiệt độ phòng Kết thu biểu thị theo số ml kg mẫu Hình 4.12 Tinh dầu diếp cá 38 Bảng 4.14 Hàm lượng tinh dầu diếp cá Lần Bình Dương Long An TP HCM Lá(ml) Thân(ml) Lá(ml) Thân(ml) Lá(ml) Thân(ml) 0,8 0,1 0,9 0,15 0,15 0,85 0,1 0,9 0,15 1,5 0,2 0,75 0,15 0,85 0,15 1,6 0,2 TB 0,8 0,116 0,883 0,15 1,366 0,183 Bảng 4.15 Phân tích phương sai ANOVA cho mẫu Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Column 2,4 0,8 0,0025 Column 2,65 0,8833 0,0008 Column 3 4,1 1,3666 0,1033 Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 0,5616 0,2808 7,8984 0,0208 5,1432 Within Groups 0,2133 0,0355 Total 0,775 ANOVA Như kết phân tích ANOVA cho thấy giá trị FA (= 7,11117) lớn nhiều so với F0,05 tra bảng (=5,143) hay P tính 0,0033 nhỏ tất nhiều so với 0,05, giả thiết đồng giá trị trung bình nhân tố A không chấp nhận được, tức hàm lượng tinh dầu diếp cá vùng khác thật sự, bác bỏ giả thuyết H0 Trong điều kiện nhau: nhiệt độ chưng cất 60-700C trì 3h áp dụng cho hỗn hợp gồm ngun liệu diếp cá khơ có khối lượng 0,5kg hịa 3lít nước, vùng TP Hồ Chí Minh có kết 1,3ml tinh dầu/kg nguyên liệu khô, tiếp đến vùng Long An với hàm lượng 0,883ml/kg ngun liệu khơ, thấp vùng Bình Dương 0,8ml/kg nguyên liệu khô Vậy diếp cá trồng vùng TP Hồ Chí Minh vùng có hàm lượng tinh dầu cao vùng Long An Bình Dương 39 Hàm lượng tinh dầu diếp cá theo quy định Dược điển Việt Nam IV 0,08% 1kg nguyên liệu khô Như vậy, hàm lượng tinh dầu diếp cá vùng khảo sát dù có khác đạt tiêu chuẩn để dùng làm thuốc Còn hàm lượng tinh dầu thân diếp cá thấp (chỉ đạt 0,02%/kg dược liệu khô) không đạt tiêu chuẩn Đây sở để chọn làm nguyên liệu chiết suất tinh dầu HLtinhdầutrongDC(ml) 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 Bình Dương Long An TP HCM Vùng khảo sát HL tinh dầu DC Biểu đồ 4.6 HL tinh dầu thân DC Hàm lượng tinh Dầu diếp cá 4.3 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU DIẾP CÁ 4.3.1 Định tính khả kháng khuẩn tinh dầu diếp cá Khả kháng khuẩn định tính phương pháp khuếch tán thạch Kết sau: PSEU E C C MRS STAP 2 C Hình 4.13 STRE C C Định tính khả kháng khuẩn tinh dầu Tinh dầu diếp cá có khả kháng E.coli, Pseudomonas aeruginosa, khơng có khả kháng Staphylococcus, MRSA Streptococus 4.3.2 Xác định MIC tinh dầu Tiến hành xác định MIC tinh dầu chủng vi khuẩn 40 Sử dụng phương pháp khuếch tán thạch [11, 27] Môi trường MHA phân chia vào ống nghiệm với thể tích xác, để đảm bảo đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng 121oC, 15 phút Chất thử nghiệm tinh dầu pha loãng ¼ DMSO 10% sau pha lỗng 1/3 DMSO 10% thu dung dịch mẹ có nồng độ 50 µl/ml Khi sử dụng pha lỗng mơi trường thử nghiệm pha trực tiếp với môi trường thử nghiệm cho tạo thành dãy nồng độ mơi trường thử nghiệm (có nồng độ sau ½ nồng độ trước) sau: µl/ml; 2,5 µl/ml; 1,25 µl/ml; 0,6 µl/ml; 0,3 µl/ml; 0,16µl/ml; 0,08 µl/ml Khi pha chất thử vào môi trường phải đảm bảo nồng độ DMSO 10 % nhằm tránh việc nồng độ DMSO cao ức chế phát triển vi khuẩn thử nghiệm Cho chất thử vào môi trường để nguội 45 – 50oC, lắc để đạt nồng độ cuối cần thử nghiệm Đổ vào đĩa petri, độ dày thạch khoảng – 4mm Tiến hành Đĩa thạch đánh số cho vị trí chủng vi khuẩn Làm khơ mặt đĩa thạch có chất thử đĩa chứng khơng có chất thử Cho – μl huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt mật độ vi khuẩn thạch 104 CFU/ml Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô Lật ngược đĩa thạch cấy ủ tủ ấm 37oC 16-18 Đối với MRSA phải ủ 24 h Kết thu sau: 5µl/ml 2,5µl/ml 1: Pseudomonas aeruginosa 2: E.coli MHA MHMH Hình 4.14 Chứng DMS DMSO O Xác định MIC tinh dầu 41 Bảng 4.16 Kết MIC tinh dầu diếp cá MIC (μl/ml) Tinh dầu E.coli Pseudomonas aeruginosa 50 Dựa vào bảng kết nhận thấy: Đối với E coli cho MIC nồng độ 5µl/ml [24] Đối với Pseudomonas cho MIC nồng độ 50µl/ml [24] 42 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu học tập, thu kết sau: Sau trình khảo sát vùng tỉnh: Kỹ thuật canh tác diếp cá nơng dân mang tính thời cơ, manh mún, không chuyên nghiệp, suất không cao cần có quan tâm quan nhà nước việc đầu tư quy hoạch vùng trồng diếp cá Đã xây dựng qui trình xử lý nguyên liệu thu từ vùng khảo sát Quy trình ổn định áp dụng quy mô sản xuất lớn Chất lượng tất mẫu diếp cá thu từ vùng đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV để dùng thuốc: Độ ẩm ≤ 13% Tỷ lệ tạp chất ≤ 2% Tỷ lệ vụn nát ≤ 5% Độ tro toàn phần ≤ 13% Hàm lượng chất chiết ≥ 11% Hàm lượng tinh dầu ≥ 0,08% Tinh dầu diếp cá thu kháng E.coli, Pseudomonas aeruginosa 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiến hành nghiên cứu khảo sát thêm vùng trồng diếp cá tỉnh, thành cách toàn diện từ biện pháp canh tác đến biện pháp kỹ thuật để thu kết tốt Cần có liên kết nhà sản xuất hộ nông dân nhà khoa học để việc trồng thu hoạch đạt hiệu kinh tế cao Nghiên cứu, khảo sát, so sánh thành phần hóa học diếp cá vùng khác Nghiên cứu sâu tác dụng dược lý công dụng diếp cá, nhằm đưa diếp cá vào phục vụ công tác phòng chữa bệnh cách rộng rãi 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hà Việt Bảo, Trần Quỳnh Hoa, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Danh Thục (2002), Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ Diếp cá-Houttuynia cordata Thunb Việt nam, Tạp chí dược học, (9), tr 9-10 Bộ mơn Dược Liệu,(2004), Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Bài giảng Dược liệu, tập 1, tr 279-288 Bộ mơn Dược Liệu,(2004), Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh,Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr 30-31 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr 740 – 741 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, tr 1386-1387 Võ Văn Chi, (2004), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 13861387 Võ văn Chi,(2002), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo dục, tr 430-431 Trần Cát Đông Nguyễn Văn Thanh, (2002), Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn, Y Học TP Hồ Chí Minh, tr 309 - 313 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, tr 288 10 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 4041 11 Trần Khắc Thi, Phạm Mỹ Linh (2008), Rau ăn an toàn, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 26-28 12 Đỗ Hải Yến (2009), Tự chữa bệnh thuốc nam, NXB Văn Hố Thơng Tin, tr 37-38 13 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật, tr 672-673 TIẾNG ANH 14 Andrews Jennifer M (2001), "BSAC standardized dics susceptibility testing method", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, p 43-57 15 Ch MI., Wen YF., Cheng Y (2007),“Gas chromatographic/mass spectrometric analysis of the essential oil of Houttuynia cordata Thunb by using on-column methylation with tetramethylammonium acetate”, J AOAC Int., 90 (1), p 60-67 16 Cho E J., Yokozawa T., Rhyu D Y., Kim S C., Shibahara N., and Park J C (2003), “Study on the inhibitory effects of korean medicinal plants and their main compounds on the 1,1-diphenyl-2-peakrylhydrazyl radical”, Phytomedicine, 10 (6-7), p 544-551 17 Cho E J., Yokozawa T., Rhyu D Y., Kim H Y , Shibahara N., Park J C (2003), “The inhibitory effects of 12 medicinal plants and their compoment compound on lipid peroxidation”, Am J Chin Med , 31 (6), p 907-917 18 Clinical and Laboratory Standards Institude (CLSI) (2008), Performance Standards for Antimicrobio Susceptibility Testing; Eightenth Informational Supplement 19 Corlett J L., Clegg M S., Keen C L., Grivetti L E (2002), "Mineral content of culinary and medicinal plants cultivated by Hmong refugees living in Sacramento, California", Int J Food Sci Nutr , 53 (2), p 117-128 20 Hu S H., Du A F (1997), "Treatment of bovine mastitis with Houttuynia sodium bisulphate", Zentralbl Veterinarmed B, 44 (6), p 365-370 21 Kim S K., Ryu S Y., No J., Choi S U., Kim Y S (2001), “Cytotoxic alkaloids from Houttuynia cordata”, Arch Pharm Res , 24 (6), 518-521 22 Kim IS, Kim JH, Kim JS, Yun CY, Kim DH, Lee JS, (2007), “The inhibitory effect of Houttuynia cordata extract on stem cell factor-induced HMC-1 cell migration”, J Ethnopharmacol, 112 (1), p 90-95 23 Li G Z., Chai O H., Lee M S., Han E H., Kim H T., Song C H (2005), “Inhibitory effects of Houttuynia cordata water extration on anaphylactic reaction and mast cell activation”, Biol Pharm Bull, 28 (10), p 1864-1868 24 Meng J., Dong X P., Zhou Y S., Jiang Z H., Leung S Y., Zhao Z Z (2006), “Study on chemical constituents of flavonoids in fresh herb of houttuynia cordata”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 31 (16), p 1335-1337 25 Ng LT, Yen FL, Liao CW, Lin CC (2007),“Protective effect of Houttuynia cordata extract on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats”, Am J Chin Med, 35(3), p 465-75 26 Probstle A., Bauer R (1992), “Aristolactams and a 4,5-dioxoaporphine derivative from Houttuynia cordata”, Planta Med , 58 (6), p 568-569 27 Tang W., Eisenbrand G (1992), "Chinese drugs of plant origin, chemical, pharmacology, and use in traditional and modern medicine", Berlin Heidelberg, New York Springer verlag, p 589-591 28 Wise Alsasdair P Mac Gowan Richard (2001), "Establishing MIC breakpoints and interpretation of in vitro susceptibility tests", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, p.17-38 PHỤ LỤC PL 1: Kích thước từ nguyên liệu diếp cá thu từ Bình Dương Cây KL Khối lượng diện tích chia nhỏ 0,8961 0,0081 0,0066 0,006 0,0062 0,0048 0,005 0,5534 0,0053 0,0039 0,0041 0,0045 0,0037 0,003 0,4036 0,0042 0,0037 0,0039 0,0041 0,0028 0,004 Cây 0,5874 0,0052 0,0041 0,0037 0,0028 0,0053 0,003 0,4302 0,0039 0,0048 0,0041 0,0047 0,0031 0,003 0,3221 0,0031 0,0037 0,0048 0,0041 0,0037 0,002 Cây 0,6271 0,0061 0,0065 0,0051 0,0043 0,0039 0,004 0,657 0,0052 0,0026 0,002 0,7601 0,0072 0,0039 0,0052 0,004 0,0053 0,0058 0,0058 0,008 0,0068 PL 2: Kích thước từ nguyên liệu diếp cá thu từ Long An Cây KL Khối lượng diện tích chia nhỏ 0,8961 0,0081 0,0066 0,006 0,0062 0,0038 0,002 0,5534 0,0053 0,0039 0,0041 0,0045 0,0027 0,003 0,4036 0,0042 0,0037 0,0039 0,0041 0,0018 0,003 Cây 0,5874 0,0052 0,0041 0,0037 0,0028 0,0033 0,002 0,4302 0,0039 0,0048 0,0041 0,0047 0,0034 0,003 0,3221 0,0031 0,0037 0,0048 0,0041 0,0033 0,002 Cây 0,6271 0,0061 0,0065 0,0034 0,0043 0,0031 0,003 0,657 0,0052 0,0026 0,002 0,7601 0,0072 0,0039 0,0052 0,003 0,0053 0,0058 0,0058 0,008 0,0068 PL 3: Kích thước từ nguyên liệu diếp thu từ Tp Hồ Chí Minh Cây KL Khối lượng diện tích chia nhỏ Lá 0,5854 0,0029 0,0042 0,0043 0,0027 0,0043 0,004 Lá 0,4302 0,0039 0,0041 0,0051 0,0031 0,0034 0,002 Lá 0,3231 0,0026 0,0019 0,0034 0,0027 0,0022 0,004 Cây 0,6572 0,0061 0,0034 0,0033 0,0034 0,0035 0,002 0,4306 0,0042 0,0039 0,0037 0,0024 0,0041 0,003 0,2741 0,0027 0,0041 0,0041 0,0033 0,0034 0,002 Cây 0,5636 0,0024 0,0031 0,0026 0,0034 0,0042 0,003 0,2445 0,0038 0,0032 0,0024 0,0027 0,0043 0,002 0,3234 0,0021 0,0033 0,0027 0,0023 0,0029 0,002 PL 4: Tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu làm dược liệu theo Dược điển Việt STT CHỈ TIÊU SỐ LIỆU ĐỘ ẨM ≤ 13% TRO TOÀN PHẦN ≤ 14% TỶ LỆ VỤN NÁT ≤ 5% TỶ LỆ TẠP CHẤT ≤ 2% CHẤT CHIẾT TRONG ≥ 11% DƯỢC LIỆU ĐỊNH LƯỢNG (Hàm lượng tinh dầu) ≥ 0,08% ... − kaempferol-3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-( 1-6 )-beta-D-glucopyranosid − quercitrin − quercetin-3-O- β-D-galactopyranosid (hyperin) − quercetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-7-O-beta-D-glucopyranosid... đơn giản - Chlorogenic methyl ester - (E )-4 -Hydroxy- 4-[ 3’ (beta-D-glucopyranosyloxy) butyliden ]-3 , 5, 5-trimethyl-2cyclohexan-1-on - 2-( 3,4-dihydroxyphenyl) ethyl-beta-D-glucopyranosid - p-hydroxyphenethyl-beta-D-glucosid... phần (-) -beta-pinen (1,02 %), betamyrcen (1,62%), 1-terpinen-4-ol (1,59%), decanal (1,49%), 2-undecanon (1,47%) [18] 2.2.2 Flavonoid [8, 17, 18, 19] − quercetin-3-O-beta-D-galactosid-7-O-beta-D-glucosid