kl le quoc thinh 062322s

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY DẦU RÁI (Dipterocarpus Alatus Roxb) BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS TRƯƠNG QUỐC ÁNH LÊ QUỐC THỊNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01/2011 i LỜI CẢM ƠN Để có kết ngày nay, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành đến cha mẹ, anh chị em gái người chỗ dựa vững cho tạo điều kiện để học tập tốt Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, đến quý thầy cô khoa Khoa Học Ứng Dụng thầy cô giảng dạy cho hiểu biết kiến thức chuyên môn, nghề mà chọn học Với biết ơn sâu sắc em gửi lời cảm ơn đến ThS.Trương Quốc Ánh, anh hướng dẫn tận tình, động viên ln tạo điều kiện để em thực tốt luận văn Em xin gửi đến cô, ThS.Nguyễn Ngọc Hồng, ThS.Nguyễn Thị Thu Sang, TS.Trần Thị Dung Cô người thầy, người bạn động viên giúp đỡ em nhiều suốt trình học tập để em vượt qua khó khăn Xin gửi lời cảm ơn đến đến giúp đỡ hướng dẫn bạn, anh chị làm việc Phịng Thí nghiệm sinh học phân tử - viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam Cuối xin cảm ơn bạn lớp 06SH1D, bạn sát cánh bên học tập giúp đỡ nhiều năm qua TP Hồ Chí Minh, ngày 20 Tháng 01 năm 2011 LÊ QUỐC THỊNH ii NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY DẦU RÁI (Dipterocarpus Alatus Roxb) BẰNG KỸ THUẬT RAPD TÓM TẮT Chọn giống nhân giống rừng khâu quan trọng định số lượng lẫn chất lượng rừng trồng 22 mẫu Dầu lấy từ 22 trội dự tuyển thu thập sáu tỉnh thuộc ba vùng địa lý Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ Tây Nguyên phân tích nhằm xác định nguồn gốc mối quan hệ di truyền kỹ thuật RAPD, với mồi khác phản ứng PCR-RAPD thuộc nhóm khác Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Doyle cộng (1987) có cải tiến cho phù hợp với đối tượng Dầu thực phản ứng PCR – RAPD Kết nghiên cứu cho thấy mồi chọn phản ứng cho băng đa hình rõ rệt Tổng số có 25 loại băng có kích cỡ khác nhau, 100% băng cho đa hình Từ thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền sơ đồ phát sinh chủng loại mối quan hệ di truyền 22 mẫu giống Dầu rái Sự tương đồng di truyền 22 giống Dầu rái nằm phạm vi từ 0.50 đến 1.00, chứng tỏ giống Dầu rái Việt Nam đa dạng phong phú, chúng chia thành nhóm nhỏ khác thuộc nhóm lớn Trong giống có mối quan hệ di truyền gần gũi nhau, số mẫu giống thuộc nơi khác hệ số tương đồng di truyền cao, nằm nhóm thuộc lồi ngăn cách địa lý lâu dài nên có biến động di truyền, giống sống vùng đệm hai vùng địa lý iii MỤC LỤC TỰA ĐỀ i TÓM TẮT iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮC .vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN : TỔNG QUAN 2.1 Cây Dầu Rái 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc tính thực vật học Dầu Rái 2.1.3 Cách trồng khai thác Dầu Rái 2.1.4 Thành phần hóa học Dầu Rái 2.1.5 Giá trị kinh tế Dầu Rái 2.2 Các khái niệm đa dạng di truyền 2.3 Phản ứng chuỗi polymerase PCR .10 2.3.1 Lịch sử 10 2.3.2 Nguyên tắc chung .10 2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR 12 2.4 Vai trò Marker phân tử chọn giống thực vật 14 2.4.1 Marker phân tử có tính chất di truyền .14 2.4.2 So sánh số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị phân tử chọn giống thực vật 19 2.5 Ứng dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu di truyền .20 2.5.1 Sơ lược RAPD marker 20 iv 2.5.2 2.6 Các bước thực chủ yếu kỹ thuật RAPD .21 Một số cơng trình nghiên cứu khoa học có liên quan 22 2.6.1 Một số nghiên cứu giới 22 2.6.2 Một số nghiên cứu nước 22 PHẦN : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 3.1 Địa điểm thời gian thực đề tài 24 3.2 Vật liệu .24 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.2.2 Hóa chất dụng cụ 25 3.2.3 Thiết bị - dụng cụ 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Chọn thu mẫu trội dự tuyển trội 27 3.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA 29 3.3.3 Phản ứng PCR .30 3.3.4 Quy trình điện di 31 3.4 Phương pháp phân tích số liệu 32 3.4.1 Một số công thức dung đánh giá đa dạng di truyền 32 3.4.2 Phương pháp chạy chương trình NTSYSpc vesion 2.1 33 PHẦN : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Sản phẩm DNA sau ly trích 36 4.2 Kết nghiên cứu quan hệ di truyền kỹ thuật RAPD 38 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 PHỤ LỤC 52 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮC - AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism - Al: Allele - ALP: Amplicon length polymorphism - AP –PCA: Arbitrary primer – PCR - BD: Bình Định - BT: Bình Thuận - CP: Chư Prong - Cs: Cộng - CT: Cát Tiên - CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide - DAF: DNA amplification fingerprinting - DMC: Dương Minh Châu - dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate - EB: extraction buffer - EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid - ES: Easup - MAAP: Multiple arbitrarily primed PCR - NN & PTNT: Nông nghiệp phát triển nông thôn - OD: Optical density - PCR: Polymerase Chain Reaction - RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA - RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism - SNP: Single Nucleotide Polymorphic - SSR: Simple Sequence Repeats - STS: Sequence Tagged Site - T a: Annealing temperature - TBE: Tris – Boric acide - EDTA vi - Tm: Melting temperature - UPGMA: Unweighted pair – ground method with arithmetic mean - WB: Washing bufer vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Chỉ số chất lượng Dầu Rái Bảng 2.2: Các loại DNA markers thông dụng 18 Bảng 2.3: So sánh số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị phân tử 19 Bảng 3.1: Thông số mẫu Dầu rái trội chọn phân tích 24 Bảng 3.2: Danh sách mồi RAPD 26 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho mẫu DNA thực phản ứng PCR 30 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR 30 Bảng 3.5 Thông số điều kiện điện 32 Bảng 4.1 Giá trị OD 22 giống Dầu rái dung để chạy PCR với mồi RAPD 37 Bảng 4.2 Tổng số band DNA sản phẩm RAPD với mồi ngẩu nhiên 40 Bảng 4.3 Tỉ lệ số band đa hình sản phẩm RAPD với mồi ngẩu nhiên 41 Bảng 4.4: Thơng tin đa hình PIC 22 giống Dầu rái 42 Bảng 4.5: Hệ số tương đồng 22 giống Dầu rái nghiên cứu 44 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hoa Dầu Rái Hình 2.2: DNA marker kiểu gene A, B, C, D 16 Hình 2.3: So sánh (a) codominant marker (b) dominant marker 17 Hình 2.4: Phản ứng PCR RAPD 21 Hình 3.1: Cửa sổ chương trình NTSYSpc, mục Similarity 34 Hình 3.2: Cửa sổ chương trình NTSYSpc, mục Clustering 35 Hình 4.1: Kiểm tra mậu DNA ly trích bẳng gel Agarose 1% 36 Hình 4.2: Sản phẩm PCR mồi OPB12 39 Hình 4.3: Sản phẩm PCR mồi OPU9 39 Hình 4.4: Sơ đố biểu diền quan hệ di truyền 22 giống Dầu rái 45 ix PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Chọn giống nhân giống rừng khâu quan trọng định số lượng lẫn chất lượng rừng trồng Việc sử dụng giống cải thiện áp dụng biện pháp trồng rừng thâm canh khác nước ta năm qua góp phần đáng kể tăng nhanh suất rừng trồng bình quân từ 5– 6m3/ha/năm lên 10-15m3/ha/năm, nhiều khu rừng thí nghiệm đạt 30 m3/ha/năm (Lê Đình Khả cộng sự, 2000) Tuy nhiên, nghiên cứu chọn tạo giống nhân giống thời gian qua tập trung chủ yếu vào số loài nhập nội, mọc nhanh như: Bạch Đàn, Keo, Tràm, Thông, Lát Hoa Phi Lao mà chưa ý đến việc cải thiện giống gỗ lớn địa Bên cạnh đó, diện tích rừng gỗ lớn địa ngày bị thu hẹp mà trường hợp rừng họ Dầu ví dụ điển hình ( Nguyễn Hồng Nghĩa, 2002) Theo số liệu thống kê cho thấy diện tích rừng họ Dầu vùng Đơng Nam Bộ giảm từ 49% năm 1959 xuống 34% năm 1968 18% năm 1982 (Nguyễn Hồng Nghĩa, 2002) Với tình trạng khai phá nay, nhiều rừng Dầu lại có nguy biến tương lai (Lê Quốc Huy Tạ Minh Hịa, 1998) Chính mà việc bảo tồn loài rừng họ Dầu ngày trở nên cấp bách hết Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb.), thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae), lồi địa lớn, thường xanh, có giá trị kinh tế cao, chiếm ưu rừng mưa nhiệt đới, có quần thụ lớn trước xếp vào lồi bị suy thối nghiêm trọng (Nguyễn Hồng Nghĩa, 2005) Vì cho nên, lồi xếp vào loại ưu tiên cho trồng rừng phòng hộ đầu nguồn trồng rừng cảnh quan, đô thị khu công nghiệp (Bộ NN & PTNT, 2004) Đến năm 2005, Bộ NN & PTNT định đưa Dầu Rái vào danh mục loài chủ yếu tiên phong cho trồng rừng sản xuất vùng sinh thái lâm nghiệp Đông Nam Bộ, Tây Nguyên Nam Trung Bộ ES2 5 30 ES3 3 2 25 ES5 26 BD1 5 25 BD2 27 BD3 7 29 ĐD4 0 4 19 BT1 1 26 BT2 2 23 BT3 7 27 BT4 24 Tổng 64 112 60 70 107 74 99 586 Tính đa hình thể xuất hay không xuất band DNA so sánh mẫu Dầu rái với mồi Điều tổng kết thể qua tỷ lệ band đa hình mồi nghiên cứu Kết tổng hợp bảng 4.3 Bảng 4.3 : Tỉ lệ số band đa hình sản phẩm RAPD với mồi ngẩu nhiên Stt Primer Tổng số phân đoạn Số phân đoạn đa hình Kích thước Tỷ lệ phân đoạn band (bp) đa hình % OPU4 11 11 800 – 1500 100 OPU5 12 12 500 – 1350 100 OPU9 9 800 – 1400 100 OPB6 13 13 700 – 1400 100 OPB12 18 18 400 – 1400 100 OPC9 15 15 500 – 1500 100 OPD2 14 14 500 – 1500 100 Tổng 92 92 41 Qua phân tích bảng 4.3 nhận thấy, tổng số band DNA 22 mẫu Dầu rái phân tích mồi ngẫu nhiên 92 phân đoạn, 92 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 100%) khơng đa hình phân đoạn Kích thước phân đoạn DNA nhân khoảng từ 500 đến 1500 bp Số lượng phân đoạn tương ứng với mồi nằm khoảng từ đến 18 phân đoạn, mồi nhân phân đoạn DNA mồi OPU9 (9 phân đoạn), mồi nhân nhiều phân đoạn DNA mồi OPB126 (18 phân đoạn) Bảng 4.3 cho thấy, tất mồi ngẩu nhiên cho tỉ lệ đa hình cáo, tỉ lệ đa hình tất mổi 100% Giá trị PIC (Polymophism Information Content) sử dụng phân tích thơng tin đa hình Giá trị PIC không liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà cịn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể xuất phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ Giá trị PIC lớn đa hình cao ngược lại Bảng 4.4 : Thơng tin đa hình PIC 22 giống Dầu rái Stt Mổi PIC OPU4 0.845 OPU5 0.901 OPU9 0.818 OPB6 0.873 OPB12 0.914 OPC9 0.885 OPD2 0.905 PIC trung bình 0.877 Tính đa hình mồi RAPD cịn đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC lớn đa hình cao ngược lại Từ bảng 4.4 cho thấy, giá trị PIC dao động từ 0,818 (mồi OPU9) đến 0,914 (mồi OPB12), đó, tất mồi RAPD cho kết đa hình cao, với giá trị PIC > 0,5, (số liệu bảng 4.4 phù hợp với tỷ lệ đa hình phân đoạn DNA nhân bảng 4.3) Sự đa hình 42 mồi tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA nhân điều cho thấy mức độ đa dang kiểu gen 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu cao 43 44 CT1 DMC2 DMC3 CT2 CT3 CT4 DMC1 CP1 ES2 CP2 CP4 CP3 ES3 ES1 BD1 BD2 BD3 BT1 BT3 BD4 BT2 BT4 IIIB III IIIA II B DMC1MW II IIA I 0.49 0.59 0.70 0.80 0.90 1.00 Coefficient Hình 4.4: Sơ đố biểu diền quan hệ di truyền 22 giống Dầu rái Sơ đồ hình tính theo thuật tốn Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA mức độ sai khác di truyền 22 mẫu Dầu rái Mức độ khác biểu hệ số sai khác mẫu Các mẫu có hệ số di truyền giống tương tự xếp thành nhóm, nhóm lại có liên hệ với Phân tích kết từ bảng 4.5 hình 4.4 cho thấy hệ số tương đồng di truyền 22 mẫu Dầu rái với mồi ngẫu nghiên dao động từ 0.45 đến Ba mẫu BD1, BD2, BD3 Bình Định có hệ số di truyền cao 45 Biểu đồ hình tạo phân tích 22 mẫu Dầu rái với mồi ngẩu nhiên chia làm nhóm chính:  Nhóm I: Bao gốm mẫu BT2 BT4 có xuất sứ Bình thuận, hai mẫu có hệ số tương đồng 0.72 có hệ số sai khác di truyền so với mẫu thuộc nhóm II 47% (1-0.53) nhóm III 50% (1-0.50)  Nhóm II: Gốm 13 mẫu ( CP1, CP2, CP3, CP4, ES1, ES2, ES3, BD1,BD2, BD3, BD4, BT1, BT3) chia thành hai nhóm phụ gồm phụ (IIA, IIB) o Nhóm phụ IIA: Gồm gồm mẫu (BD1, BD2, BD3, BD4, BT1, BT3) thuộc hai tỉnh Bình Định Bình Thuận mẫu đươc chọn đại diện cho vùng địa lý Nam Trung Bộ chia thành cụm - Cụm I: Chỉ gồm mẫu BD4 có hệ sồ tương di truyền với cụm II 0.61 - Cụm II: Gồm mẫu BT1, BT3 BD1, BD2, BD3 chia thành hai cặp có hệ số tương đồng cao mẫu BD1, BD2, BD3 có hệ số tương đồng di truyền Hai mẫu BT1 ,BT2 có hệ số tương đồng di truyền 0.95 o Nhóm phụ IIB: gốm mẫu ( CP1, CP2, CP3, CP4, ES1, ES2, ES3) thuộc hai tỉnh Gia Lai Đắk Lắk mẫu chọn đại diện cho vùng địa lý Tây nguyên Các mẫu có hệ số tương đồng di truyền với cao khoảng từ ( 0.80 đến 0.94)  Nhóm III: Gốm mẫu (CT1, CT2, CT3, CT4, DMC1, DMC2, DMC3) thuộc hai tỉnh Đồng Nai Tây Ninh, mẫu đại diện cho vủng địa lý Đông Nam Bộ nhóm phân nhóm thành nhóm riêng có hệ số sai khác di truyền so với nhóm I nhóm II 50% (1 -0.50) chia thành hai nhóm phụ IIIA IIIB o Nhóm phụ IIIA: gốm mẫu DMC1 có hệ số sai khác di truyền so với nhóm phụ IIIB 42% (1 -0.58) o Nhóm phụ IIIB: Gồm mẫu (CT1, CT2, CT3, CT4, DMC2, DMC3) chia thành hai cụm 46 - Cụm I: Gồm hai mẫu CT3 CT4 có hệ số tương đồng di truyền 0.67 có hệ số sai khác di truyền với cụm II 34% (1 – 0.66) - Cụm II: Gồm mẫu CT1, DMC2, DMC3, CT2 có hệ số tương đồng di truyền lần lược 0.88, 0.72, 0.69 Qua phân tích kết phân nhóm chùng tơi nhận thấy 22 mẫu dầu rái nghiên cứu chia thành nhóm riêng biệt đại diện cho vùng địa lý khác Vùng Đông Nam Bộ phân thành nhòm Riêng với độ sai khác di truyền vời nhóm khác 50% Vùng Tây Nguyên phân thành nhóm riêng biệt nhiên có hệ số tương đồng gần với nhiều mẫu thuộc vùng Nam Trung Bộ hệ số di truyền nằm khoản (0.58 – 0.76) Vùng Nam Trung Bộ có hai mẫu (BT2, BT4) có độ sai khác lớn so với vùng khác củng phân thành nhóm riêng Từ kết phân nhóm chúng tơi nhận thấy tính đa hình 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu phạm vi phân tích mồi ngẫu nhiên phản ứng RAPD – PCR chứng minh cho khác cấu trúc DNA mẫu Dầu rái chon nghiên cứu Dầu rái tự thụ phấn hệ gen bảo thủ, hệ số sai khác giống nghiên cứu tương đối thấp nên ta dùng mẫu làm giống, thiết kế tộ hợp lai phục vụ cho việc lai tạo giống theo nguyên tắc lấy giống có hệ số sai khác di truyền xa dùng lai với sử dụng ưu lai 47 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đả tách chiết DNA tổng số từ non 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu Qua kiểm tra cho thấy, mẫu DNA tổng số tách chiết có chất lượng tốt - Bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng mồi ngẫu nhiên nhận 586 band DNA nhân ngẫu nhiên từ hệ gen 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu Trong mồi ngẫu nhiên sử dụng mồi biểu tính đa hình - Kết phân tích cho thấy, 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu chia thành nhóm chính, hệ số tương đồng di truyền nhóm 0.5 0.53 (tức sai khác từ 47% đến 50%) Các nhóm phân phản ảnh phân vùng địa lý chúng - Một số mẫu Dầu rái thuộc nơi khác hệ số tương đồng di truyền cao, nằm nhóm thuộc loài ngăn cách địa lý lâu dài nên có biến động di truyền - Với kết luận chứng tỏ phương pháp phân loại mức độ DNA phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý bổ sung hổ trợ cho để cơng tác phân loại chọn giống trở nên xác 5.2 Kiến nghị - Cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật RAPD với nhiều mồi ngẫu nhiên kết hợp nhiều kỹ thuật khác SSR, AFLP, RFLP để xác định mối quan hệ di truyền mẫu giống Dầu rái có độ tin cậy nhằm tạo sở cho việc lai tạo giống Dầu rái có hiệu - Ứng dụng kết đánh giá phân nhóm đa dạng di truyền bước đầu thiết kế tổ hợp lai 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bộ Lâm nghiệp, 1988 Quy phạm kỹ thuật trồng rừng Dầu Rái (Dipterocarpus alatus ) (QPN 11-88) Bộ Lâm nghiệp, 1993 Quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống vườn giống (QPN 15-93)và Quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống chuyên hóa (QPN 16-93) ban hành theo định số 804/QĐKT ngày 02/11/1993 Bộ NN & PTNT, 2003 Tiêu chuẩn ngành 04TCN-64-2003: Tiêu chuẩn công nhận giống lâm nghiệp ban hành theo định số 188/2003/QĐ-BNN ngày 23/01/2003 Bộ NN & PTNT, 2004 Chọn lồi ưu tiên cho chương trình trồng rừng Việt Nam – Cẩm nang ngành lâm nghiệp Bộ NN & PTNT, 2005 Danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sàn xuất theo vùng sinh thái lân nghiệp, ban hành kèm theo định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003 Giáo trình di truyền số lượng Nhà xuất Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2008 Giáo trình tin sinh học Nhà xuất Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Bùi Đoàn, 2002 Dầu Nước – báo cáo chuyên đề có dầu Việt Nam, trang 1-6, Viên khoa học Lâm Nghiệp – Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục 10 Hà Huy Thịnh, 2007 Annual progress report of Project “Use of genetic diversity and biotechnological advances in forest tree improvement researches” Reporting period: 01/01/2004 – 31/12/2007 11 Lê Đình Khả cộng sự, 2000 Nghiên cứu chọn giống nhân giống cho số trồng rừng chủ yếu 49 12 Lê Quốc Huy Tạ Minh Hịa, 1998 Một số kết nghiên cứu cơng nghệ vườn ươm nhân hom sinh dưỡng sản xuất Sao Đen Dầu nước chất lượng cao 13 Nguyễn Hồng Nghĩa, 2001 Nhân giống vơ tính trồng rừng dịng vơ tính Nhà Xuất Bản Nơng Nghiệp 14 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2002 Dipterocarps, 7-10 October 2002, Kuala Lumbur, Malaysia Eds H.Aminah, S Ani, H C Sim anh B Krisnapillay, pp 73-79 15 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005 Cây họ Dầu Việt Nam (dipterocarps of Vietnam) Nhà xuất Nông Nghiệp, 100 trang 16 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Nguyễn Đức Thành Nguyễn Thúy Hạnh, 2005 Genetic relationship of some dipterocarp species in Vietnam based on RAPD and cpDNA analyses 8th Round-table coference on Dipterocarps, 15-17 November 2005, Ho Chi Minh city, Vietnam 17 Nguyễn Minh Đường, 1987 Kỹ thuật trồng rừng số loại họ Dầu – Sao Tập san khoa học kỹ thuật phía Nam, số 29, quý III, trang -12 18 Nguyễn Quang Bình cộng sự, 2004, Chọn lồi ưu tiên cho chương trình trồng rừng Việt Nam, nhà xuất giao thông vận tải 19 Phạm Thành Hổ, 2002, Di Truyền Học , Nhà Xuất Bản Giáo Dục, 619 trang 20 Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương, Phan thị Hoan, Hoàng Thị Ngọc Lan, Trần Thị Liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang, 2008, Di truyền y học,Nhà xuất giáo dục Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: 21 Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005 An introduction to markers, Quantitative Trait Loci (QTL) mapping and marker – assisted selection for crop improvement: The Basis Concepts Euphytica, 142: 169 – 196 22 Doyle,J.J and J.l.Doyle, 1987 Preservation of plant samples for DNA retriction endonuclease analysis Taxon 36:715-722 50 23 Doyle, J, J 1991 DNA protocols for plant.pp 283 -293 in : G.Hewitt, A.W.B ASI Series H, Cell Biology Vol 57 24 Jones N., Ougham H., and Thomas H., 1997 Markers and mapping: We are all geneticists now New Phytol, 137: 165 – 177 25 Nei M and Li WH (1979), "Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction end nucleases", Proc Natl Acad Sci USA 76, p.5269 5273 26 Paterson A H., 1996a Making genetic maps Tn: A.H Paterson (Ed.), Genome Mapping in Plants, pp 23 – 39 R G Landes Company, San Diego, California; Academic Press, Austin, Texas 27 Winter P., and Kahl G., 1995 Molecular marker technologies for plant improvement World Journal of Microbiology and Biotechnology, 11: 438 – 448 28 Weeden N., Timmerman G., and Lu J., 1994 Identifying and mapping genes of economic significance Euphytica, 73: 191 – 198 29 Yanti Rachmayanti, Ludger Leinemann, Oliver gailing and Reiner Finkeldey, 2006 Extraction, Amplification and Characterization of Wood DNA from Dipterocarpaceae, plant Molecular biology Reporter 24 : 45 -55, March 2006 30 David James and Henri Loréal, 2005, Application of modern analytical techniques to ensure seafood safety and authenticity, FAO, Viale delle Terme di Caracalla, 00100 Rome, Italy Tài liệu từ internet PGS.TS Bùi Cách Tuyến , Khái niệm đa dạng di truyền, 01/2011, Cổng thông tin điện tử tổng cục môi trường, Cục bảo tồn đa dạng sinh học http://vea.gov.vn/VN/quanlymt/baotondadangsh/Gioithieu/Pages/Kháiniệmđad ạngditruyền.aspx 51 PHỤ LỤC Phụ lục Kết đọc band 22 mẫu dầu rái phản ứng với mồi ngẫu nhiên M CT CT CT DMC DMC DMC CP CP CP CP ES ES ES BD BD BD ĐD BT BT BT BT Mẫu CT B6 U9 U5 U4 MỒI 1500 1400 1350 1300 1250 1200 1100 1050 1000 900 800 1350 1300 1250 1200 1150 1100 1000 900 800 650 600 550 500 1400 1300 1250 1220 1200 1100 800 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1120 1100 1050 1000 900 800 700 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 52 B12 C9 D2 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1100 1000 900 800 750 700 650 600 550 500 450 400 1500 1450 1400 1350 1300 1250 1200 1100 1000 900 850 700 600 550 500 1500 1400 1300 1200 1100 1000 950 900 800 750 700 650 550 500 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 Phụ lục Hình số thiết bị dụng cụ thí nghiệm làm đề tài: Micro pipet Bình đựng Nito lỏng Máy định lượng DNA Máy ủ rung nhiệt Bể ổn nhiệt Mày chụp hình gel điện di 54 Mày PCR real - time PCR May ly tâm lạnh Buồng thao tác DNA Máy li tâm nhỏ Bồn điện di Tủ trử mẫu - 500C 55 ... Trình tự OPB6 5? ?- TGC TCT GCC C-3’ OPB12 5? ?- CCT TGA CGC A-3’ OPC9 5? ?- CTC ACC GTC C-3’ OPD2 5’-GGA CCC AAC C-3’ OPU4 5’-ACC TTC GGA C-3’ OPU5 5’-TTG GCG GCC T-3’ OPU9 5’-CCA CAT CGG T-3’ 3.2.2.3... - AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism - Al: Allele - ALP: Amplicon length polymorphism - AP –PCA: Arbitrary primer – PCR - BD: Bình Định - BT: Bình Thuận - CP: Chư Prong - Cs: Cộng -. .. - Máy chụp hình gel tia UV (UVP liboratory , GDS-8000 system.) - Tủ thao tác PCR (ESCO IEC601 0-1 ) - Máy PCR (eppendort – 553 2-5 3091, Realtime Bio-RAD 584BR4769) - Máy ủ mẫu (eppendort – 535 0-2 3552)