Actinomycin D, Actinomycin x2, hai chất kháng sinh được phân lập dịch lên men streptomyces 21.123

Streptomyces 21.123 là chủng Streptomyces sinh tổng hợp kháng sinh được chúng tôi phân lập từ mẫu đất miền Bắc Việt Nam. Từ dịch lọc dịch lên men của chủng xạ khuẩn này, hỗn hợp kháng sinh được chiết tách tốt sang pha ethyl acetat ở pH 7,0. Sắc ký lớp mỏng cho thấy có ít nhất 4 thành phần trong trong hỗn hợp kháng sinh này.

ACTINOMYCIN D, ACTINOMYCIN X2, HAI CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC PHÂN LẬP DỊCH LÊN MEN STREPTOMYCES 21.123 PGS.TS Cao Văn Thu1, DS Nguyễn Quỳnh Trang, DS Hoàng Thị Cẩm, DS Nguyễn Thị Hải Vân, ThS Hoàng Thùy Hương, ThS Tạ Thu Lan2 Khoa Dược, Trường Đại học Hịa Bình Trường Đại học Dược Hà Nội Tác giả liên hệ: cvthu@daihochoabinh.edu.vn Ngày nhận: 29/5/2022 Ngày nhận sửa: 05/6/2022 Ngày duyệt đăng: 24/6/2022 Tóm tắt Streptomyces 21.123 chủng Streptomyces sinh tổng hợp kháng sinh phân lập từ mẫu đất miền Bắc Việt Nam Từ dịch lọc dịch lên men chủng xạ khuẩn này, hỗn hợp kháng sinh chiết tách tốt sang pha ethyl acetat pH 7,0 Sắc ký lớp mỏng cho thấy có thành phần trong hỗn hợp kháng sinh Các thành phần phân tách tinh chế qua sắc ký cột Silica gel Sử dụng phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân biện giải cấu trúc hóa học thành phần actinomycin D actinomycin X2 Từ khóa: Streptomyces, phổ khối, phổ NMR, actinomycin D, actinomycin X2 Actinomycin D and Actinomycin X2 - the two antibiotic components isolated from filtrate of the fermentation broth Streptomyces 21.123 Abstract Streptomyces 21.123 is an antibiotic biosynthesizing Streptomyces strain from soil samples in the North of Vietnam From the filtrate of the fermentation broth of this actinomycete strain, the antibiotic mixture was well extracted into the ethyl acetate phase at pH 7.0 Thin layer chromatography showed that there were at least components in this antibiotic mixture The major components were separated and purified by Silica gel column chromatography Using mass spectroscopy and nuclear magnetic resonance spectroscopy, the chemical structures of the two main components, actinomycin D and actinomycin X2 were explained Keywords: Streptomyces, mass spectroscopy, NMR spectroscopy, actinomycin D, actinomycin X2 Đặt vấn đề Streptomyces chi xạ khuẩn gồm nhiều lồi có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc đặc tính kháng sinh, số lồi chi cịn có khả sinh tổng hợp kháng sinh chống ung thư Streptomyces 21.123 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất miền Bắc Việt Nam có di truyền ổn định, có khả sinh tổng hợp kháng sinh tốt Sau số bước cải tạo giống Streptomyces 21.123 lên men máy lắc, dịch lọc chiết xuất ethyl acetat, từ tinh chế kháng sinh actinomycin D chất thứ hai actinomycin X2 Cấu trúc kháng sinh xác định phương pháp phổ NMR MS Bài viết giới thiệu trình phân lập xác định cấu trúc hóa học kháng sinh Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Chủng giống vi sinh vật, môi trường [1] Chủng Streptomyces 21.123 phân lập từ mẫu đất miền Bắc Việt Nam Chủng vi khuẩn kiểm định: Proteus mirabilis BV 108, Bacillus subitilis ATCC 6633 Các mơi trường chính: MT1, MT1dt mơi trường tối ưu hóa [1], canh thang, thạch thường 2.2 Phương pháp nghiên cứu [1-3] Phổ khối loại phổ NMR đo Cải tạo chọn giống Streptomyces Viện Hóa học hợp chất tự nhiên, Viện 21.123 ứng dụng phương pháp sàng lọc ngẫu Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiên đột biến sử dụng ánh sáng UV 254 Kết nghiên cứu nm, dung dịch HNO2 kết hợp với sàng lọc Dịch chiết etyl acetat dịch lọc dịch ngẫu nhiên sau đột biến Đánh giá hoạt tính lên men kháng sinh Streptomyces 21.123 kháng sinh thực phương loại dung môi, phân lập phương pháp khuếch tán sử dụng khối thạch, giếng pháp sắc ký kết hợp với kết tinh lại thạch, khoanh giấy lọc Phương pháp lên dung môi hữu cơ, thu kháng sinh men chìm máy lắc Taitec Bioshaker BR - chất (37,20%) chất kháng sinh 300 LF Phương pháp chiết kháng sinh từ thứ - chất (19,89%) dịch lọc ethyl acetat pH 7,0 áp - Phổ 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT, dụng để chiết xuất kháng sinh Phương pháp COSY, HMBC, HSQC, phổ khối lượng sắc ký lớp mỏng sử dụng để khảo sát chất thể so sánh với phổ thành phần kháng sinh Phương pháp actinomycin D công bố theo bảng sắc ký cột với chất hấp phụ Silica gel cỡ sau [3-5]: hạt 0,04 - 0,063 mm sử dụng để tinh chế kháng sinh Bảng Các đặc trưng phổ NMR chất so với actinomycin D Actinomycin D Chất Vị trí -ring -ring -ring -ring C C C H C H (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) L-Meval C=O # # 167,673 167,572 71,3/71,4 71,369 2,70 71,182 2,70 -CH 26,9 26,9 26,934 2,65 26,890 2,65 -CH N-CH3 39,2 39,2 39,283 2,92 39,163 2,90 x CH3 & & $ @ $ @ Sar C=O # # 166,551 166,502 CH2 51,4 51,4 51,370 3.60 3.60 N-CH3 34,9 34,9 34,935 2,85 34,873 2,85 L-Pro C=O # # 173,659 173,297 56,3 56,3 56,454 5,90/6,00 56,240 5,90/6,00 -CH 31,0/31,3 30,953 1,82/2,18 31,252 1,82/2,18 -CH2 22,9/23,1 22,843 2,15/2,30 23,010 2,15/2,3 - CH2/C 47,3/47,5 47,332 3,68/3,75 47,332 3,68/3,75 - CH2 D-Val C=O # # 173,262 173,248 58,7 58,7 58,873 3,59 58,718 3,70 -CH 31,5/31,7 31,792 2,78 31,561 2,90 -CH x CH3 & & $ @ $ @ (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) L-Thr C=O # # 168,976 168,498 54,9/55,3 54,812 4,53 55,182 4,45 -CH -CH CH3 Phenoxazon 75,0 17,8 75,0 17,4 1a C # 101,6 146,0 # 113,5 145,1 140,5 127,5 130,2 125,9 132,6 129,1 7,7 15,0 C=O 4a 5a 9a 4-CH3 6-CH3 74,961 17,759 5,23 1,27 75,044 17,345 5,23 1,27 C 166,502/166,551 101,660 147,569 179,064 113,505 145,072 140,469 127,668 130,284 125,749 132,559 129,080 7,775 15,055 H 7,36 7,62 2,25 2,25 #: 13 nhóm C=O actinomycin D [1] C = 166,1; 166,3; x 166,5; x 167,6; 168.5; 168,9; x 173,3; 173,7, 179,1 &: nhóm CH3 actinomycin D [1] C = x 19,1; x 21,6 $: nhóm CH3 chất C = 17,759; 18,977;19,039; 19,093; 19,239; 19,281; 21,572; 21,671 Vị trí (1) L-Meval C=O -CH -CH N-CH3 x CH3 Sar C=O CH2 N-CH3 L-Pro C=O -CH @: nhóm CH3 chất H = 0,72 (6H); 0.96 (12H); 1,02 (6H) Tiếp tục phân tích phổ hồn tồn khẳng định chất actinomycin D Hợp chất biết đến từ chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 nghiên cứu trước - Phổ 13C-NMR, 1H-NMR,DEPT, COSY, HMBC, HSQC, phổ khối lượng chất thể theo bảng sau [3-5]: Bảng Các đặc trưng phổ NMR chất so với actinomycin D Actinomycin D Chất -ring -ring -ring -ring C C C H C H (2) (3) (4) (5) (6) (7) # # 71,3/71,4 26,9 26,9 39,2 39,2 & & # 51,4 34,9 L-Pro # 56,3 # 51,4 34,9 L-Pro # 56,3 167,496 71,454 27,017 39,368 $ 166,320 52,865 34,914 2,70 2,66 2,95 @ 4,60 -3,98 2,89 L-Pro 173,534 56,462 5,80 166,584 71,242 26,954 39,184 $ 2,70 2,66 2,95 @ 166,128 51,321 4,72 - 4,62 34,758 2,89 (L-4-oxo) 173,135 54,979 6,6 -CH2 - CH2/C - CH2 D-Val C=O -CH -CH x CH3 (1) L-Thr C=O -CH -CH CH3 Phenoxazon C=O 4a 5a 9a 4-CH3 6-CH3 31,0/31,3 22,9/23,1 47,3/47,5 31,029 22,962 47,436 1,82 2,15-2,31 3,75-3,89 31,549 208,773 51,321 2,37/3,86 3,60-4,60 # # 58,7 58,7 31,5/31,7 & & (2) (3) 174,030 58,534 31,859 $ (4) 3,59 2,75 @ (5) 172,719 57,159 31,697 $ (6) 3,75 3,21 @ (7) 168,976 54,306 74,749 17,679 4,58 5,20 1,20 168,738 54,769 74,641 17,125 4,55 5,15 1,25 # # 54,9/55,3 75,0 75,0 17,8 17,4 1a C # 101,6 146,0 # 113,5 145,1 140,5 127,5 130,2 125,9 132,6 129,1 7,7 15,0 C 165,939/165,258 101,704 147,421 179,016 113,622 145,027 140,511 127,891 130,347 126,127 132,070 129,153 7,728 15,030 #: 13 nhóm C=O actinomycin D C = 166,1; 166,3; x 166,5; x 167,6; 168.5; 168,9; x 173,3; 173,7, 179,1 &: nhóm CH3 actinomycin D C = x 19,1; x 21,6 $: nhóm CH3 chất C = 18,816; 18,916; 19,032; 19,066; 19,197; 19,226; 21,573; 21,692 @: nhóm CH3 chất H = 0,75 (6H); 0.96 (12H); 1,02 (6H) Kết so sánh giá trị phổ actinomycin D chất giống nhau, H 7,36 7,62 2,25 2,51 ngoại trừ xuất thêm nhóm carbonyl vùng trường thấp c 208,773 Kết phổ gợi ý so sánh với kết phổ chất actinomycin X2 đưa nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29 công bố Kết hợp với kết phổ ghi nhận chất phổ NMR actinomycin X2 công bố nhận thấy chất actinomycin X2 với khối lượng theo phổ khối lượng ESI-MS xuất pic có cường độ cao m/z 1269,45 [M+H]+ m/z 1291,43 [M+Na]+ H3C H3C CH3  CH3 H3C CH  L-MeVal H3C N N O H2C Sar O O H2 C  CH3 H3C   H2C H3C D-Val  O   O  O D-Val 10a 9a H3C D-Val   L-Thr L-Thr CH3 O    L-Thr CH3 ring 10a 9a NH2 4a 5a  CH N D-Val NH O O Phenoxazone ring O HC ring HB CH3 CH3  CH O  HN HN HA CH2 CH CH O NH2 CH3 O L-Pro CH2  N  O   HC NH H 3C Sar O H2 C  CH CH CH3 CH2 N CH CH O H3C N  CH3   4a 5a  H2C H 3C ring N O CH3 O  O H2 C H2C CH NH O O HA N  CH3 HC ring L-Pro CH3  CH HN HB L-4-OxoPro O CH2 HN  CH H 3C C  CH CH NH H2C Sar O   N O  N N HC CH CH L-Thr Sar O H2 C N H 3C CH2 O HC L-MeVal H3C N  CH  H2C CH L-MeVal CH3 O  N CH3  O   CH  HC L-MeVal H3C CH3  CH O O  CH L-Pro  CH O O CH3 O CH3 Phenoxazone ring 1a L-Meval: N-metyl-L-valine; Sar: sarcosine; L-Pro: L-proline; L-4-oxoPro: L-4-oxo-proline; D-Val: D-valine; L-Thr: L-threoline Hình Cấu trúc hóa học actinomycin X2 (1) actinomycin D (2) Bàn luận Kết thu khác với kết Caixia Chen cộng [3] phân lập actinomycin D actinomycin X2 thành phần từ Streptomyces sp MS449 phân lập từ biển Còn Việt Nam, có Cao Văn Thu cộng [2] cơng bố phân lập actinomycin X2 từ Streptomyces 15.29 mà Kết luận Kết nghiên cứu cho phép lần Việt Nam phân lập thành công kháng sinh gồm: chất - actinomycin D (thành phần chính), chất - actinomycin X2 (chất phụ) từ dịch lên men Streptomyces 21.123 với hiệu suất cao 37,20 % 19,89 % tính từ cắn kháng sinh thơ Tài liệu tham khảo PGS.TS cộng (2020), “Nghiên cứu tối ưu hóa lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 21.123.33.12”, Nội san Khoa học Công nghệ Đại học Hịa Bình, Số 01 (12/2020), tr 98104 Cao Văn Thu, Bùi Việt Hà, Phan Văn Kiệm (2010), “Actinomycin X2, chất kháng sinh phân lập từ trình lên men sinh tổng hợp”, Tạp chí Hóa học, T.48, tr 469-474 C Chen, F Song, Q Wang, W M.Abdel - Mageed, H Guo, C Fu, W Hou, H Dai, X Liu, N Yang, F Xie, K Yu, R Chen, L Zhang (2012), “A marine - derived Streptomyces sp MS449 produces high yield of actinomycin X2 and actinomycin D with potent anti-tuberculosis activity”, Appl Micr & Biotechnol, vol 95 (4), pp 919-927 A B Mauger and W J Rzeszotarski(1976), Organic Magnetic Resonance, Vol 8, 219223 Liviab Inbar and Aviva Lapidot (1988), Journal of Biological Chemistry, Vol 263, 1601416022  ... dung dịch HNO2 kết hợp với sàng lọc Dịch chiết etyl acetat dịch lọc dịch ngẫu nhiên sau đột biến Đánh giá hoạt tính lên men kháng sinh Streptomyces 21.123 kháng sinh thực phương loại dung môi, phân. .. cơng bố phân lập actinomycin X2 từ Streptomyces 15.29 mà Kết luận Kết nghiên cứu cho phép lần Việt Nam phân lập thành công kháng sinh gồm: chất - actinomycin D (thành phần chính), chất - actinomycin. .. actinomycin X2 (chất phụ) từ dịch lên men Streptomyces 21.123 với hiệu suất cao 37,20 % 19,89 % tính từ cắn kháng sinh thô Tài liệu tham khảo PGS.TS cộng (2020), “Nghiên cứu tối ưu hóa lên men sinh tổng