Mục tiêu của đề tài Phân tích và đánh giá hàm lượng một số chất tạo ngọt trong thực phẩm truyền thống ở tỉnh Thừa Thiên Huế'' là xác định hàm lượng chất tạo ngọt trong các loại thực phẩm truyền thống; đánh giá my=ức độ sử dụng chất tạo ngọt trong các thực phẩm truyến thống, từ đó đưa ra khuyến cáo và một số giải pháp nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm.
Trang 1ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TRAN TIEU LINH
PHAN TiCH VÀ DANH GIA HAM LUQNG MOT SO
CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM TRUYÊN
THONG Ở TỈNH THỪA THIÊN HUE
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Trang 2ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TRAN TIEU LINH
PHAN TiCH VA DANH GIA HAM LUQNG MOT SO CHAT TAO NGQT TRONG THUC PHAM TRUYEN
THONG Ở TINH THỪA THIEN HUE
CHUYÊN NGÀNH_ : HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ : 60 44 01 18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS NGUYÊN ĐÌNH LUYỆN
Trang 3LOI CAM DOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi
Các số liệu và các kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung
thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa được công bố
trong bắt kì một công trình nào khác
Trang 4thực hiện luận văn
xa chân thành cảm ơn = lây Cô giáo khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Huế đã tạo mọi điều kiệt lợi và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện/
Xin chân thành cả fc anh chị phụ trách phòng thí nghiệm của Trung a ái Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ ›gmộf Số thiết bị, hóa ¢hat trong qua trình thực hiện
tâm Kiểm nghiệm Thuốc và tạo điều kiện cho tôi, luận văn này
Cuối cẳng, tôi bạn bè đã luôi) động, luận văn
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gia đình,
hệ giúp đỡ tôi trong suốt quá lọc tập và nghiên cứu
Trang 5MUC LUC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục _— Danh mục các tử viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MO DAU
CHUONG 1 TONG QUAN LY THUYET
1.1 Giới thiệu về phụ gia thực phẩm 1.1.1 Định nghĩa về phụ gia thực phẩm 1.1.2 Vai trò của PGTP 1.1.3 Chức năng của nhóm phụ gia cho phép sử dụng trong thực phẩm 1.1.4 Thực trạng quản lý sử dụng phụ gia thực phẩm 1.1.5 Tác động bắt lợi của PGTP 1.2 Chất tạo ngọt 1.2.1 Tông quan về chất tạo ngọt 1.2.2 Tổng quan saccharin 1.2.3 Tổng quan acesulfame kali
1.2.4 Tổng quan về phương pháp phân tích saccharin va acesulfame kali
1.3 Giới thiệu về phương pháp sắc ký long higu nang cao (HPLC),
1.3.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC
1.3.2 Cơ sở của phép sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.3 Phân loại các kỹ thuật HPLC " 1 1.3.4 Cách đánh giá peak, tính kết quả trong phương pháp HPLC
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
2.2 Thiết bị và hóa chất
Trang 62.2.2 Hóa chất
2.3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Đối tượng nghiên cứu
2.3.2 Phương pháp lấy mẫu, xử lý mẫu và bảo quản mẫu
2.3.3 Phương pháp định lượng saccharin và acesulfame kali
2.3.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
2.4 Quy trình xử lý mẫu
2.5 Xử lý số liệu thực nghiệm
CHUONG 3 KET QUA VA THAO LU
3.1 Khảo sát điều kiện sắc ky định lượng saccharin và acesulfame kali
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động đến quá trình tách
3.2 Đánh giá độ tin cây của phương pháp phân tích
3.2.1 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ),
3.2.2 Phương trình đường chuẩn của saccharin va acesulfame kali 3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp 3.2.4 Độ đúng của phương pháp oe — 3.3 Xác định, đánh giá hàm lượng saccharin và acesulfame kali trong thực phẩm truyền thống, 3.3.1 Xác định hàm lượng saccharin, acesulfame kali và so sánh với tiêu chuẩn cho phép
3.3.2 Đánh giá hàm lượng saccharin theo vị trí lấy mẫu
Trang 7DANH MUC CAC TU VIET TAT Ký
STT hiệu 'Tên tiếng Anh 'Tên tiếng
1 | HPLC ung, Hiquid Í cực Lý lòng hiệu năng cao 2 | TCVN | Viet Nam Standard Tiêu chuẩn Việt Nam
3 | ppm | Partper milion Phân triệu
4 ppb | Partperbillon Phan ti
$ | LOD | Limit of detection Giới han phát hiện 6 | LOQ | Limit of quantitation Giới hạn định lượng 7 | RSD_ | Relative standard deviation | D6 léch chuẩn tương đối 8 | ACN | Acetonitrile Acetonitril
10 | GHPH | Limit Of Detection hạn phát hiện 11 | ML | Maximum level Lượng đối đa cho phép
2 S| Standard deviation Độ lệch chuẩn
13 | tr |Retenionetime Thời gian lưu
14 R | Correlation Hệ số tương quan 15 | Rev | Recovery Độ thu hồi
16 | Sac |Saccharin Saccharin 17 | Ace | Acesulfame potassium | Acesulfame kali
Trang 8DANH MUC CAC BANG
STT| Bang Tiêu đề Trang
1 | Bảng 2,1 | Kí hiệu mẫu và vị trí lấy mẫu 31 2 | Bang 2.2 | Sự biển động hàm lượng 2 chat tạo ngọt theo yếu tố „
khảo sắt
3 | Bang 2.3 | Kết quả phân tich ANOVA 1 chiéu 37
4 | Bang aa | Co thông số cơ bảng tốc đồ đồng Khác nhau của 0 saccharin và acesunlfame kali
‘Cac thong số cơ bản của quá trình tách saccharin và
5 | Bảng3.2 acesulfame kali ở ty lệ pha động khác nhau - - 42
6 | Bảng 3.3 | Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) 43
7 | Bang 3.4 | Sự phụ thuộc diện tích peak vào nòng độ 4
8 | Bang 3.5 | Kết quả khảo sát độ lặp lại trên nền mẫu thử (n=§) 46
9 láng 3.6 | Kết quả khảo sát độ đúng trên nền mẫu thử (n=3) 47 Kết quả xác định hàm lượng saccharin và acesulfame
10 | Bảng 3.7 | kali trong thực phẩm truyền thống được chế biến từ hải 48 sản
Kết quả xác định hàm lượng saccharin và acesulfame
11 | Bảng 3.8 | kali trong thực phẩm truyền thống được chế biến từ thịt | 49 và đậu
Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động
12 | Bảng 3.9 | hàm lượng saccharin trong thực phẩm truyền thống chế 50 biến từ hải sản theo vị trí lấy mẫu
'Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động
13 | Băng 3.10| hàm lượng saccharin trong thực phâm truyền thống chế 50 từ thịt theo vị trí lấy mẫu
Kết quả phân tích ANOVA I chiêu của sự biến động,
14 | Bảng 3.11 | hàm lượng saccharin trong thực phẩm truyền thống chế s1
biến từ đậu theo vị trí lấy mẫu
Trang 915 Bang 3.12
Độ lệch nhỏ nhat và độ lệch giữa các giá trị trung bình
của hàm lượng saccharin trong thực phẩm có nguồn gốc
từ hải sản theo vị trí lấy mẫu s2
16 Bang 3.13 Độ lệch nhỏ nhất va độ lệch giữa các giá trị trung bình của hàm lượng saccharin trong thực phẩm có nguồn gốc
từ thịt và đậu theo vị trí lấy mẫu 53 7 Bang 3.14 Các đại lượng thông kê thu được khi đánh giá hàm lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ hải sản 55 18 Bang 3.15 'Các đại lượng thông kê thu được khi đánh lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biển từ thịt hàm 56 19 Bang 3.16 Các đại lượng thông kê thu được khi đánh giá hàm lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ đậu 57 20 Bang 3.17 Két qua phan tich ANOVA 1 chiéu su bién déng him lượng saccharin theo nguồn gốc khác nhau 58
21 Bang 3.18 Độ lệch nhỏ nhất và độ lệch giữa các giá trị trung bình của hàm lượng saccharin trong thực phẩm theo nguồn
gốc khác nhau 58
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH STT| Hình Tiêu đề Trang 1 | Hình 1 | Giới thiệu hệ théng HPLC 20
2 | Hinh 1.2 | Sắc đồ hai cấu tử A và B 2
Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở 3 | Minh 3.1 tốc độ 0,6ml/phút 38 Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali & 4 | Hình32 | tốc độ 0,8ml/phút 39 5 | Hình33 Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở 3» tốc độ 1,0ml/phút Sắc ký đồ hỗn hợp sacccharin và acesuniiame kali 6 | Hình34 " với tỷ lệ pha động [40:60] 41 Sắc ký đỗ hỗn hợp sacccharin và acesunifame kali
7 | Hình3% với tỷ lệ pha động [80:40] 2 lẽ nha đãi #
8 | Hình 3.6 | Đường chuẩn của saccharin 4
9 | Hình 3.7 | Đường chuẩn của acesufame kali 4 10 | Hình | Điến đồbiêu iễn sự biến động hàm lượng của 55
saccharin trong ruốc và tôm chua
H1 | Hình 3, | Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng của " saccharin trong nem và chả
Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng của
12 | Hình3.10 saccharin trong mé xing và chè ` a 37
Biéu do bieu dién su bien dong ham luong saccharin
13 | Hình 3.11 | trung bình trong thực phẩm có nguồn gốc khác nhau 59
Trang 11MO DAU
Sự phát triển kinh tế - xã hội luôn đi đôi với nhu cầu nâng cao chất lượng cuộc sống của con người, trong đó có nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm an toàn Hiện nay, các thực phẩm có vị ngọt như chè, bánh kẹo, nước ngọt, các loại mứt hoa quả là thực phẩm phổ biến được người tiêu dùng sử dụng trong ăn uống hằng ngày Ngoài vị ngọt có giá trị dinh dưỡng thì đa phần các vị ngọt khác đều do các chất tạo ngọt không có giá trị dinh dưỡng tạo nên Khi sử dụng thực phẩm có hàm lượng chấ tạo ngọt quá liều lượng có thể
tây ảnh hưởng sức khỏe
cho người tiêu ding
Việc sử dụng các chất tạo ngọt tổng hợp có trong danh mục phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm với hàm lượng nằm khoảng giới hạn quy định thì không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng Ngược lại khi sử dụng chúng quá liều lượng thì có thể gây ngộ độc hóa học, và là nguyên nhân gây ra nhiều chứng bệnh khác nhau[6] Tuy nhiên tại nhiều cơ sở sản xuất thực phẩm, người ta thường thêm chất tạo ngọt tống hợp như acesulfam kali, aspartam, saccharin, với những lượng khác nhau, có thể vượt quá giới hạn cho phép để tăng vị ngọt, tạo hương vị thơm cho sản phẩm nhằm mang lợi nhuận nhiều hơn[4] Vì vậy việc phân tích và đánh giá hàm lượng của chúng có trong thực phẩm là nhiệm 'vụ vô cùng cắp bách và cần thiết
‘Theo Quyết định của Bộ Y tế về việc ban hành “Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm”, số 3742/2001/QĐ - BYT, tháng 8
năm 2001[4], danh mục các chất tạo ngọt tông hợp gồm có manitol, acesulfame kali, aspartam, isomalt, sucralozơ, sorbitol, saccharin Trong đó hàm lượng saccharin và acesulfam kali sử dụng khá phô biến trong việc chế biến thực phẩm
Trang 12~ Xác định hàm lượng chất tạo ngọt trong các loại thực phẩm truyền thống như: sản phẩm từ đậu, từ thịt lợn và từ hải sản
~ Đánh giá mức độ sử dụng chất tạo ngọt trong các thực phẩm truyền thống, từ
Trang 13CHUONG 1
TONG QUAN LY THUYET
1.1 Giới thiệu về phụ gia thực phẩm
1.1.1 Định nghĩa về phụ gia thực phẩm (PGTP) [1J [7] I10/
Theo Ủy ban Tiêu chuẩn thực phẩm Quốc tế (Codex Alimentarius Commisson — CAC): PGTP là chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, không được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm và cũng không được sử dụng như một thành phần của thực phẩm Việc bổ sung chúng vào thực phẩm là để giải quyết mục đích công nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm cải thiện kết cấu hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó Phụ gia thực phẩm không
bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất độc bổ sung vào thực phẩm nhằm duy trì
hay cải thiện thành phần định dưỡng của thực phẩm
Theo tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and
Agriculture Organization of the United Nations — FAO): PGTP la chat khéng dinh
dưỡng được thêm vào các sản phẩm với các ý định khác nhau Thông thường các chất này có hàm lượng thấp, dùng để cải thiện
ih chat cam quan, cấu trúc, mùi vị cũng như bảo quản sản phẩm
Theo Tiêu chuân Việt Nam (TCVN): PGTP là những chất không được coi là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm Phụ gia thực phẩm có ít hoặc không có giá trì dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp ứng yêu cầu
của công nghệ trong quá trình sản xuất, chế bi , bao gói, vận chuyển, bảo
quản thực phẩm Phụ gia thực phẩm không bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất bổ sung vào thực phẩm với mục đích tăng thêm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm
Từ xưa đến nay, các loại gia vị tự nhiên được sử dụng nhiều trong chế biến thông dụng như: hành, gia vị ớt, hạt tiêu tạo vị cay, cà chua tạo vị chua - ngọt, cũ cải tạo vị đắng Đến năm 1990 từ vanille, tỉnh dầu chanh, cam, bạc hà được chiết
Trang 14‘1.1.2 Vai tré ctia PGTP [8]
Khoa học và công nghệ ngày cảng phát triển giúp cho PGTP cũng đa dạng hơn Đến nay đã có hơn 2500 phụ gia đã được sử dụng trong công nghệ thực phẩm góp phần quan trọng trong việc chế biến thực phẩm
Phụ gia thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm:
~ Góp phần điều hòa nguồn nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất thực phẩm, giúp nhà máy có thể hoạt động quanh năm, sản phẩm được phân phối trên toàn thế giới
~ Cải thiện được tính chất của sản phâm: PGTP được bổ sung vào thực phẩm nhằm làm thay đổi tính chất cảm quan như cấu trúc, màu sắc, độ đồng đều, của
sản phẩm
~ Làm thỏa mãn thị hiếu ngày càng cao của người tiêu dùng
~ Góp phần làm đa dạng hóa các thực phẩm: củng với sự xuất hiện của PGTP thức ăn nhanh, thức ăn ít năng lượng, các thực phẩm thay thế khác cũng ra đời và phát triển để đáp ứng nhu cầu ăn uống ngày càng đa dạng của con người
~ Nâng cao chất lượng sản phẩm: các chất màu, chất mùi, chất tạo vị làm gia tăng tính hấp dẫn của sản phẩm
~ Đơn giản hóa các công đoạn sản xuất: việc sử dụng các hợp chất bóc vỏ
trong chế biến các loại củ giúp rút ngắn thời gian bóc vỏ
1.1.3 Chức năng của nhóm phụ gia cho phép sử dụng trong thực phẩm [7], [10] “Theo Ủy ban tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (CAC), PGTP được chia làm 23 nhóm dựa trên mục đích sử dụng của chất phụ gia Tùy theo tình hình của mỗi nước mà cơ quan quản lý về an toàn thực phẩm quy định danh mục riêng áp dụng cho quốc gia đó Các chất phụ gia chứa chức năng cụ thể đảm bảo các nguyên tắc sau:
~ Tất cả các phụ gia thực phẩm dù trong thực tế đang sử dụng hoặc sẽ được đề nghị đưa vào sử dụng phải được tiến hành nghiên cứu vẻ độc học hoặc bằng việc đánh giá và thử nghiệm mức độc hại, mức độ tích lũy, tương tác hoặc các phản ứng tiềm tàng của chúng theo phương pháp thích hợp
Trang 15~ Chỉ có phụ gia thực phẩm đã được xác nhận bảo đảm độ an toàn theo quy định, không gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng ở tất cả các liều lượng được đề nghị mới cho phép sử dụng
~ Các phụ gia thực phẩm đã được xác nhận vẫn cần xem xét, thu thập những bằng chứng thực tế chứng minh không có nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng ở ML (maximun level) đã đề nghị, vẫn phải theo dỡi liên tục và đánh giá lại về tính độc hại bắt kể thời điểm nào cn thiết khi những điều kiện sử dụng thay đổi và các thông tin khoa học mới
~ Tại tắt cả các lần đánh giá, phụ gia thực phẩm phải phủ hợp với các yêu cầu kỹ thuật đã được phê chuân, nghĩa là các phụ gia thực phẩm phải có tính đồng nhất, tiêu chuẩn hóa về chất lượng và độ tinh khiết đạt các yêu cầu kỹ thuật theo CAC
~ Các phụ gia thực phẩm chỉ được sử dụng khi đảm bảo các yêu cầu sau: + Không làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng của thực phẩm
+ Cung cắp thành phần hoặc các kết cấu cần thiết cho thực phẩm được sản xuất phục vụ đối tượng có nhu cầu đặc biệt
+ Tăng khả năng duy trì chất lượng, tính ổn định của thực phẩm hoặc các thuộc
tính cảm quan của chúng nhưng phải đảm bảo không làm thay đổi bản chất, thành phần hoặc chất lượng của thực phẩm
+ Hỗ trợ quy trình chế biến, bao gói, vận chuyển và bảo quản thực phâm, phải bảo đảm rằng phụ gia không được dùng để “cải trang”, “che giấu” các nguyên liệu hư
hỏng hoặc các điều kiện thao tác kỹ thuật không phù hợp (không đảm bảo vệ sinh)
trong quá trình sản xuất chế biến thực phẩm
~ Việc chấp nhận hoặc chấp nhận tạm thời một chất phụ gia thực phẩm đẻ đưa vào danh mục được phép sử dụng cần phải: Xác định mục đích sử dụng cụ thể, loại thực phẩm cụ thể và dưới các điều kiện nhất định; Hạn chế sử dụng càng nhiều càng tốt đối với những thực phẩm đặc biệt dùng cho các mục đích đặc biệt, với mức thấp nhất có thể đạt được hiệu quả mong muốn (về mặt công nghệ); Đảm bảo độ tỉnh khiết nhất định và nghiên cứu những chất chuyển hóa của chúng trong cơ thể, Khi phụ gia dùng để chế biến thực phẩm cho nhóm người tiêu dùng đặc biệt thi can xác định liều tương ứng với nhóm người đó
Trang 161.1.4 Thực trạng quản lý sử dụng phụ gia thực phẩm[7], [10]
Nguồn phụ gia thực phẩm được sử dụng để sản xuất và chế biến thực phẩm hiện nay ở nước ta chủ yếu là nhập khẩu Tuy nhiên, hiện tượng nhập lậu phụ gia thực phẩm vẫn đang xảy ra, gây khó khăn cho các cơ quan chức năng trong việc
kiểm soát chất lượng Phụ gia được bán ra tại các cửa hàng hầu hết đều là những
mặt hàng đã được công bố chất lượng, tuy vậy tại một số cơ sở kinh doanh phụ gia vẫn còn tồn tại tình trạng kinh doanh phụ gia không rõ nguồn gốc, bao gói, nhãn mác của phụ gia không đúng quy định, ngoài danh mục của Bộ Y tế Việc quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm đối với chất phụ gia, chất hỗ trợ chế biến, chất tạo ngọt
thực phẩm còn bắt cập: việc thanh tra, kiểm tra, xử lý vi phạm chưa thường xuyên;
phương tiện, trang thiết bị kiểm tra còn hạn chế Tình trạng mua bán, sử dụng các chất phụ gia như chất tạo ngọt, chất bảo quản không rõ nguồn gốc, ngoài danh mục cho phép sử dụng còn phổ biến ở các cơ sở kinh doanh nhỏ
1.1.5 Tác động bắt lợi của PGTP [7|, [10]
Bên cạnh những tác động có lợi, PGTP cũng tác động bất lợi đến sức khỏe
người tiêu dùng Đây là một vấn đẻ phức tạp và nhiều nhà khoa học vẫn đang tranh
luận về sự an toàn của các chất PGTP Các tác hại của PGTP gồm:
~ Ngô độc cấp tính: có thể gây mẫn cảm như ngứa, sưng phủ, nóng bừng mặt,
cứng gáy, chóng mặt, tê lưỡi, nhức đầu, buồn nôn
~ Ngô độc mãn tính: dù dùng liều nhỏ, nếu thường xuyên, một số PGTP tích
lũy trong cơ thê có thể gây mắt cảm giác ngon miệng, giảm cân, tiêu chảy, rụng tóc,
suy thận mãn tính, da xanh xao, động kinh, thiểu máu, suy tìm, suy gan, suy thận, tiểu đường, nguy cơ hình thành khối u, ung thư, đột biến gen, quái thai Khi phát hiện một chất PGTP nào gây ra ung thư cho vật thí nghiệm, nó sẽ bị cắm sử dụng ngay tức khắc ở bắt cứ liều lượng nào
Ngoài ra, PGTP có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm như phá hủy các chất dinh dưỡng và các vitamin Tác hại của PGTP còn do một số chất thêm vào thực phẩm để bảo quản hoặc tăng sức hắp dẫn, mặc dù chúng chưa có trong danh mục cho phép của Bộ Y tế hoặc đã bị cắm Hẳu hết các chất đó đều có hại đến sức khỏe con người, thậm chí có thể gây ung thư, quái thai,
Trang 171.2 Chất tạo ngọt 1.2.1 Tổng quan về chất tạo ngọt [10J' Chất tạo ngọt là phụ gia thực phẩm được sử dụng khá phổ n trong công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm Chất tạo ngọt có nhiều loại ứng với cấu trúc và tính chất hóa học khác nhau
Đến nay, các nhà khoa học đã tìm hàng trăm chất hóa học có khả năng
tạo vị ngọt, chúng được chiết tách từ thực vật hoặc sản xuất bằng phương pháp tông,
hợp Tuy nhiên, chỉ vài phụ chất được phép sử dụng trong công nghệ thực phẩm
Tủy vào quy định của mỗi quốc gia, mà danh mục các chất tạo ngọt cho phép sử
dụng có thể khác nhau
Có nhiều phương pháp phân loại các chất tạo ngọt Theo Branen và cộng sự (1989), các chất tạo ngọt có thể chia thành hai nhóm: có giá trị dinh dưỡng và
không có giá trị đỉnh dưỡng (xem phụ lục 4)
lê sử dụng chất tạo ngọi trong thực phẩm hiện nay
'Phụ gia thực phẩm nói chung và chất tạo ngọt nói riêng được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm nhằm hoàn thiện và tăng tính hấp dẫn của sản phẩm Trong đó, các chất tạo ngọt tông hợp phổ biến bao gom acesulfame kali, aspartam, sodium cyclamate va saccharin déu duge phép sir dung tai nhiều quốc gia trên thế giới Các chất này được quy định như PGTP theo Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ và cần phải được phê chuẩn về sự an toàn trước khi đưa ra thị trường Acesulfame kali va aspartam ciing được phép sử dụng tại Anh Tuy nhiên, các sản phẩm có chất này phải thực hiện yêu cầu ghi nhăn đặc biệt
Ở Việt Nam, do giá thành rẻ và độ ngọt cao nên các chất tạo ngọt acesulfame kali, aspartam, cyclamate và saccharin được bán nhiều tại các chợ đầu mối và các chợ nhỏ Chúng được sử dụng nhiễu trong các sản phẩm đóng chai, đóng hộp có thông tin về các chất tạo ngọt được ghi trên nhãn, ngoài ra chúng còn được sử dụng
tại nhiều hàng quán via hè, tiểu thương vẫn dùng loại đường hóa học này để chế
biến thức ăn, nấu chè, luộc bắp hay ngâm trái cây đẻ tăng vị ngọt và khơng được
kiểm sốt chặt chẽ
Trang 18Nhu vay, các chất tạo ngọt được sử dụng khá rộng rãi tại Việt Nam, tuy nhiên
các cơ quan chức năng cần quản lý chặt chẽ hơn trong quá trình sử dụng để chúng đảm bảo an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng 1.2.2 Tổng quan saccharin [26] ôâ Cu to Cụng thức cấu tạo: ° Nu PX đ oO
Saccharin có công thức hóa học là C;H;NO;S§, danh pháp quốc tế là 1-dioxo- 1 ,2-benzothiazol-3-1; tén gọi khác là benzoic sunfimit hoặc octho- sunphobenzamit
Vào năm 1878, khi nghiên cứu về các dẫn xuất trong than đá tại phòng thí nghiệm, tình cờ giáo sư Constantine Fahlberg và giáo sư Ira Remsen đã phát hiện ra vị ngọt của chất bám trên tay khi ăn bánh mỳ do không rửa sạch tay sau khi thí
nghiệm Đến năm 1879 và năm 1880 họ đã chính thức công bố phát hiện và đặt tên
cho chat ngot nay la saccharin
© Tinh chat:
- Khối lượng phân tử: 183,17g/mol
-_ Tỷ trọng: 0,82§8g/cm”
- Nhiệt độ nóng chảy: 228,8 ~ 229,7%C = Độ hỏa tan trong nước: Ig/270ml nước
'Bột saccharin kết tỉnh có mảu trắng, tan ít trong nước và ête, nhưng dạng muối
natri và canxi của nó thì dễ tan Saccharin én định trong môi trường axit, nhưng lại
không có phản ứng gì với các thành phần trong thực phẩm nên nó thường được dùng nhiều trong đồ uống, nước ngọt Ở nhiệt độ cao saccharin vẫn giữ được độ
ngọt vốn có, có thê thay thé tối đa là 25% lượng đường saccharose nên cũng được
sử dụng trong sản xuất bánh, mứt, kẹo cao su, hoa quả đóng hộp, kẹo, bánh tráng,
miệng,
Trang 19Saccharin có độ ngọt cao gắp 200 - 700 lần những loại đường tự nhiên, nhưng
nó có nhược điểm lớn là có hậu vị cay và đắng cùng với mùi kim loại nhất là khi
nồng độ cao Vì vậy saccharin thường được kết hợp với các loại đường khác như
đường cyclamate va aspartame với nồng độ thấp, để bổ trợ và khắc phục nhược điểm này, cũng như nhiều chất ngọt thay thé khác saccharin không bị hap thu boi hệ
tiêu hóa, không gây ảnh hưởng tới hàm lượng insulin trong máu, không tạo năng lượng Vì vay saccharin được xếp vào nhóm chất ngọt không calo, còn được sử
dụng trong cả những sản phâm mỹ phẩm, vitamin và được phẩm
«Vai trò
Được sử dụng để tạo vị ngọt hay che giấu mùi vị trong thức ăn, đồ uống, kem
đánh răng, nước súc miệng Nó thường được sử dụng ở nồng độ 0,02 - 0,5% Phản
img bat lợi do saccharin đã được ghi nhận: mẻ đay, nhạy cảm với ánh sáng, hằng
ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng saccharin dưới dạng muối (natri, kali) lớn hơn Smg/kg trọng lượng 1.2.3, Tong quan acesulfame kali [25] © Cau tao: 00 văn 9W AA, Acesulfame kali có công thức hóa học là C;H;KNO¿S, danh pháp quốc tế là Potassium-6-methyl-2, 2-dioxo-oxathiazin-4-olate Năm 1967: Được nhà hóa học người Đức Karl Clauss phát hiện © Tinh cha ~_ Khối lượng mol: 201,24 g/mol ~ _ Điểm nóng chay: 225°C - pH:2-10
~ _ Trạng thái: dạng tinh thể màu trắng, không mùi
Độ ngọt: Acesulfame kali ngọt gấp 180 - 200 lần đường saccharose Vị ngọt bắt đầu nhanh và hậu vị không kéo dài Giống saccharin, nó có hậu vị đắng nhẹ, đặc
Trang 20biệt khi ở nồng độ cao Acesulfame kali thường được dùng kết hợp với các chất tạo ngọt khác như aspartame, sucralose Sự kết hợp này giúp tạo ra vị giống với đường hơn vì mỗi chất tạo ngọt sẽ che đi hậu vị của những chất khác
Tinh ôn định: Aeesulfame kali én định dưới tác dụng của nhiệt, ngay cả
trong điều kiện có tính axit hoặc kiềm mạnh, nó được phép dùng trong các sản
phẩm nướng hay các sản phẩm yêu cầu hạn sử dụng dài Hợp chất có độ ôn định cao trong môi trường lỏng
Độ hòa tan: Tan tốt trong nước, một lít nước ở 20%C có thể hòa tan được 270g acesulfame kali
® Vai trò
Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm nhằm tăng
cường vị và che dấu những vị khó chịu Thường được dùng phối hợp với các chất
ngọt tổng hợp khác như aspartam, cyclamat Không được chuyển hóa trong cơ thể
và nhanh chóng đào thải ra khỏi cơ thể Hằng ngày không nên đưa vào cơ thể một
lượng lớn hơn 15mg/kg trọng lượng
1.3.4 Tổng quan về phương pháp phân tích saccharin và acesulfame kali [13]
1.2.4.1 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước
Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm
có thể tiến hành phân tích chất tạo ngọt theo các phương pháp khác nhau Một số
phương pháp phô biến có thể kể đến như quang phổ hắp thụ phân tử LV-VIS, điện di mao quản vùng CZE, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Trong đó phương pháp quang phổ UV-VIS tuy có thể dùng để định hướng riêng các chất nhưng có nhược điểm là khó phân biệt phổ của các chất khi có lẫn các chất cản trở như: chất bảo quản, các loại đường, phẩm màu, nên hiện nay ít sử dụng Trong đó phương pháp HPLC có độ chính xác và độ chọn lọc rất cao nên được các cơ sở thí nghiệm tin dùng
1.2.4.2 Các phương pháp trên thé giới
Phương pháp HPLC là kỹ thuật phân tích phù hợp cho việc xác định đồng thời
một số các chất ngọt tổng hợp và đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới Vậy nên
trong mục này chỉ đề cập tới những công trình nghiên cứu tiêu biểu
Trang 21+ Phương pháp quang phé UV-VIS (Phuong phap chung cho các đồ uống không cồn)
+ Nguyên tắc: Saccharin được trích ly từ một lượng mẫu axit hóa với diethyl ete Các dung môi được loại bỏ và dung dịch còn lại được đồng hóa bởi axit HCI, sau đó được sử lý bằng thuốc thử Nessler và đo độ hấp thụ quang của sản phẩm ở
bước sóng 425nm
+ Quy trình: Thêm 2ml dung dịch HCI vào 50g mẫu Trích ly với 50ml diethyÌ ete (3 lần) Lọc dung dịch trích ly vào bình tam giác 250ml sạch và làm bay hơi dung môi Thêm 6ml HCI và 5ml nước cất và cho bay hơi khoảng Iml trong chậu nước nóng Một lần nữa thêm 6ml HCI và 5ml nước cất cho bay hơi khoảng 1ml
Pha loãng dung dịch thành 50ml với nước cắt Hút 2ml dung dịch này vào bình định
mức 25ml Thêm Iml thuốc thử Nessler và dùng nước cất định mức đến vạch Tương tự hút 0,5; 1; 2; 3 và 4ml dung dich chuẩn (200mg/ml) vào bình định mức
thụ quang của mẫu tại bước sóng
25ml và tạo màu với thuốc thử Nessler Đo độ
425nm Từ đó tính hàm lượng sacccharin trong mẫu từ đồ thị hiệu chuẩn + Phương pháp điện di mao quản
Tach va sir dung chất tạo ngọt tổng hợp sử dụng điện di mao quản là phương,
pháp thực hiện nhanh và đơn giản có thể kể đến một số công trình nghiên cứu đã
được triển khai thành công trên hệ thống này trong việc xác định các chất ngọt tổng hợp như sau:
Phuong pháp xác định đồng thời aspartame, cyclamate, saccharin, acesulfame kali trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với dectector độ dẫn
của các tác giả Anna Beatriz Bergamo, Jose Alberto Fracassi Du Silva, Dosil
Pereiru De Jesus Trong công trình nghiên cứu này tác giả đã sử dụng dung dịch đệm tris(hydroxymethyl)aminomethane 100mmol.L"! (TRIS) va _ histidine(His) 10mmol.L", véi thời gian phân tích các mẫu trong vòng 6 phút, và hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng 94 -108%
+ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
độ, độ
chọn lọc rất cao nên được sử dụng rất nhiều ở các nước trên thế giới Một số công Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật có độ chính x trình tiêu biểu của các tác giả
Trang 22Xác định đồng thời 9 chất tạo ngọt nhân tạo có nồng độ cao trong thực phẩm
(Aspartame, saccharin, acesulfame kali, alitame, axit cyclamic, neotame,
hydrochlcone, sucraloze, neohesperidine) bằng phương pháp HPLC của các tác giả
Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber, phương pháp có độ
chính xác tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 93 ~ 109%, LOD dưới 15 pg.g! va
LOQ dưới ug g'
Phương pháp HPLC cũng được các tác giả Chigusa Kobayashi, Mitsuo Nakazoto, Hirofumi Ushiyama, Yuka Kawai, Yukinari Tateshi, Kazuo Yasuda sử dụng để xác định đồng thời 5 chất tạo ngọt: slitame (AL), acesulfame kali
(Ace kali), saccharin (Sac), aspartam (Asp) va dulcin (DU) trong rat nhiều loại
thực phẩm khác nhau Độ thu hồi của các chất tạo ngọt trong mẫu thức ăn khoảng 77 ~ 102%, giới hạn phát hiện là 10ppm Với Tetra n-butylammonium
bromide và đệm photphat pH = 5,0 được thêm vào dung dịch hỗn hợp, sau đó
cho chảy qua cột C18 và được rửa bằng nước và hỗn hợp methanol - nước
(45:55) Các chất tạo ngọt này được tách trên cột ODS-2 với pha động là
methanol - nước (1:3), bao gồm 0,01 mol/l tetra-n-propylammonium hydroxide
được điều chỉnh đến pH = 3,5 với axit photphoric và được phát hiện ở bước
song 210nm
1.3 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lông hiệu năng cao (HPLC)
1.3.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC J9J
Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyên qua pha tĩnh đẻ mang chất
phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động Do các chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau
1.3.2 Cơ sở của pháp sắc ký lồng hiệu năng cao [11], [14), [16] [17], [12] * Giai đoạn tách
Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất
cao (200+500 atm) Vi vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch
(thường là hòa tan trong dung môi làm pha đông) Phương pháp này thích hợp cho
Trang 23tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường)
Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách -> chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh
Dũng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi don hoặc hỗn hợp các dung môi) đẻ rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau)
Kỹ thuật chạy sắc ký:
+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi)
+ Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục) Građient có thể là từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho
quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn
* Giai đoạn phát hiện và xứ lý kết quả phân tích
Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là
detecto
'Việc ghỉ nhận và xử lý kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết: thời gian lưu, diện tích và chiều cao peak, hệ số phân giải, hệ số đối xứng
+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ
vào tính chất này để phân tích định tính
+ Độ lớn peak được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích
Trang 24(HH thông phân phát dang môi) a "Nước tht Hinh 1.1 Gidi thiệu hệ thống HPLC
«ˆ Các thơng số của phương pháp sắc ký lỏng + Hệ số phân bồ Kp và cách xác định
Cấu tử A phân bố giữa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập:
A = Ae
'Hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng độ chất phân tích giữa hai pha:
Trong đó : [A» ] là nồng độ chất phân tích trong pha động
[A: ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh
Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong pha động Hệ số phân bố Kp có thể được xác định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng Một cách gần đúng Ko được xác định theo công thức sau:
M—M,)E „=[ z ø)
Trong đó: M là lượng chất ban đầu: mg
MI là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc: mg
'V là thể tích pha động: mÌ m là lượng chất hắp thụ: g
Trang 25+ Đĩa lý thuyết
Đĩa lý thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập Theo quan niệm của Martin và Synge, cân bằng được thiết lập nhanh chóng, tức thời Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tượng peak sắc ký không cân đối Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được cân bằng khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tinh và ngược lại, từ đó tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ
Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân bằng phân bố chất phân tích
Gọi n là số đĩa lý thuyết, ø là độ lệch chuẩn; z~ ý+ Đối với cột sắc ký n
cảng lớn peak cảng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, tr ~ n, nên ta có thể viết fe z hay n-(2) z Mặt khác: w=4Ø hay ø = Số đĩa lý thuyết có thể viết lại la: 2 + Hệ số đối xứng S,
S; được xác định tại 109% chiều cao peak Công thức tính : S,= b/a
a là độ rộng nữa peak trước ở 10% chiéu cao peak
b là độ rộng nửa peak sau ở 10% chiễu cao peak được lựa chọn thường có giá
-12
trị từ 0,
+ Sắc đỗ
Sac dé là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo được có thể là độ hắp thụ quang, cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tằn số xung điện liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian Các tín hiệu này được gọi là “peak” sic ky Dé tính toán hàm lượng chất phân tích, tính diện tích peak sắc ký là chính xác nhất Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các thiết bị tính diện tích của peak sắc ký một cách tự động
Trang 26
We W,
Hình 1.2 Sắc đồ hai cấu tử A va B
+ Detector trong HPLC
Detector là một bộ phận quan trong quyết định độ nhạy của phương pháp, là 'bộ phận dùng đẻ phát hiện chất phân tích, cũng như pha động, pha tĩnh Có nhiều loại detector thường được sử dụng trong HPLC như detector quang phổ, điện hóa
> Detector hắp thụ tử ngoại - kha kién UV-Vis
Đây là loại detector rất thông dụng, hầu hết các thiết bị sắc ký lỏng được trang bị loại deteetor này Nó có cấu tạo gần giống với máy trắc quang bình thường, điểm khác nhau ở buồng mẫu, phần cuvet tĩnh được thay bằng Flowcell Nồng độ chất phân tích tối thiểu có thể phát hiện được thông qua công thức
A= log elC
Trong đó: A: mat d6 quang; Ip va Ï là cường độ của tia toi và tủa truyền qua
£: hệ số tắt phân tử; I chiều đày cuvet (cm)
.: nồng độ chất tan cần xác định (mol/l) > Detector điện hóa
Cae detector điện hóa đóng vai trò như các máy phân tích điện hóa có độ nhạy
cao để phát hiện và định lượng các chất cẳn phân tích theo 1 tính chất điện hóa nào đó
của chúng nhờ sự thay đổi cường độ dòng, thé, độ dẫn điện, điện lượng Loại detector
này có thể dùng phân tích nhiều chất vô cơ, hữu cơ với giới hạn độ nhạy rất cao
Tín hiệu đo được theo một tính chất điện hóa của chất phân tích trong những điều kiện thực nghiệm đã chọn, nồng độ của chúng tuân theo biểu thức sau:
Trang 27A=kC
Trong đó: A là tín hiệu đo, k là hằng số thực nghiệm, C là nồng độ chất phân tích + Pha tinh trong HPLC
Pha tinh duge chia lam 2 loai: rắn và lỏng Nếu pha
là chất lỏng ta có sắc
ký lỏng - lỏng; nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng - rắn
Các hạt chất nhôi trong pha tĩnh rắn có d =
Chọn pha tĩnh trong HPLC sao cho:
Cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại
10 jum, phé bién nhất là 3+7 um
phải được thiết lập nhanh
'Pha tĩnh có dung lượng lớn để hắp phụ một lượng lớn chất phân tích Khoảng áp suất làm việc tương đối rộng
* Pha tĩnh hấp thụ pha thường: trên bể mặt của nó có chứa các nhóm OH là
các nhóm phân cực Nhóm này là nhóm ưa nước vì để tạo cầu liên kết H với các
phân tử nước, vì vậy nó làm giảm hoạt tính sắc ký pha tinh Loại pha tĩnh này được sử dụng để tách các chất không phân cực hoặc ít phân cực Pha động cho loại pha tĩnh này là những chất không tan trong nước như: C;H¿, CeHsCHs, CCl,
* Pha tĩnh hắp thụ pha ngược: là những silicat trung tính đã được ankyl hóa
các nhóm OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl: Ca, Cs, Cs, Cis ° XỌ ° XO — mm ~À—o—s—R + HCl oO” % o % 'Vì vậy mà chất nhồi này có bề mặt không phân cực, nó thuộc loại chất nhồi ky
nước nghĩa là nước không làm ảnh hưởng đến bề mặt của nó Vì vậy pha động cho loại sắc ký này là nước có hòa tan các chất hữu cơ như: nước - metanol, nước — acetonitri, được trộn theo những thẻ tích xác định Loại pha tĩnh này đề tách cả chất
không phân cực và phân cực
Các tính chất đặc trưng như cấu trúc hạt, độ xốp hạt, kích thước hạt đều có ảnh hưởng đến kết quả phép tách sắc ký
+ Pha dong trong HPLC
Pha động trong HPLC được chọn là tùy thuộc vào mẫu phân tích hoặc nồng độ,
Trang 28nó có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp 2, 3 dung môi được trộn theo những thể tích nhất định Khi chọn pha động thì phải chú ý những yêu cầu sau:
- Tro va khong tic dụng hóa học với pha tỉnh
~ Bền và ôn định trong quá trình chạy sắc ký
~ Hòa tan tốt hỗn hợp các chất phân tích
~ Phù hợp với detectơ đã lựa chọn
Trong sắc ký hp thụ pha thường: vì pha tĩnh là phân cực nên pha động là chất không phân cực hay ít phân cực, nói chung đó là dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước Hệ dung môi hữu cơ này dùng để tách hiđrocacbon hoặc các hợp chất hữu cơ ít phân cực
Trong sắc ký hấp thụ pha ngược vì pha tĩnh không phân cực hay ít phân cực
nên pha động phải phân cực như: dung môi hữu cơ phân cực hoặc hỗn hợp các dung môi hữu cơ phân cực với nước Người ta thường dùng nhất là metanol = nước và
acetonitril nước Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực
đến không phân cực Vì vậy phạm vi sử dụng đa dạng, phong phú hơn 1.3.3 Phân loại các kỹ thuật HPLC [11J, [14], [16], [17], [18]
Hiệu quả của quá trình tách sắc ký phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn kỹ thuật
chạy sắc ký Việc lựa chọn này phụ thuộc vào tính chất của chất phân tích Hiện nay
có nhiều kỹ thuật tách
* Sắc ký hắp thụ:
Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha
tĩnh và pha đông nhờ tương tác phân tử thông qua các trung tim hap thy Pha tĩnh là
các chất rắn hoặc lông có diện tích bề mặt lớn, bền vững vẻ mặt hoá học Chúng hấp
thụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động
chứa chất phân tích tiếp xúc với chúng Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau
* Sắc ký phân bồ lông - lỗng
Sự phân biệt giữa sắc ký phân bó lỏng - lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng
Trang 29pha động cũng là chất lỏng, sự phân bồ chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết, còn sự phân bồ nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn
Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hắp phụ là ở
chỗ: sắc ký phân bố lỏng - lỏng có đường đăng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ
lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tượng trôi mắt pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm
* Sắc ký ion (trao đổi ion)
'Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân
tích trong pha động Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả
năng trao đổi anion gọi là anionit Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện, phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân
tích, pH của dung dịch và bán kính hidrat hoá của các ion chất phân tích Ví dụ
phản ứng trao đổi ion giữa cationic axit mạnh và Ca°° có thể viết như sau:
2R-SO;H + Ca?" =(R-SO¿)Ca + 2H“ Phản ứng của anionit bazơ mạnh véi Cl
R-N(CH:;OH +CE =R-N(CH›):Cl +OH
* Sắc ký rây phân tử:
Pha tinh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong
lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kích thước cỡ phân tử Các phân tử chất phân
tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tuỳ theo kích thước của chúng Các chất phân tích có kích thước lớn không thể đi sâu vào pha tĩnh được sẽ bị rửa giải nhanh còn các phân tử chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha
tĩnh sẽ bị rửa giải chậm Thứ tự rửa giải là các chất có kích thước nhỏ đi ra sau và ngược lại Thời gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kích thước phân tử của chúng Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh Như vậy
một phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mả chúng ta
không xét ở đây
1.3.4 Cách đánh giá peak, tính kết quả trong phương pháp HPLC [11], [17] >_ Cách đánh giá peak
Trang 30
Tín hiệu đo là diện tích của peak hay chiều cao của peak Để tiến hành định lượng chất phân tích người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích có độ tình khiết cao Tiến hành khảo sát chất chuân để tìm điều kiện đo của chất chuân, mẫu giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế
mn tich hoặc
Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì chiều cao của peak tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:
§=KC _ (S: diện tích của peak)
h=KC (h: chiều cao của peak)
Các phương trình này dùng đề định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường
người ta dùng điện tích của peak dé độ chính xác cao hơn
Để tính diện tích peak, ta dùng máy tính đã cài sẵn chương trình, phương pháp
này có thể dùng cho cả những peak bị trôi đường nền Phương pháp này đỏi hỏi hệ
xứng nằm trong khoảng 0,80 + 1,20 Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó
khăn khi peak có cường độ quá cao, bị doăn, không đối xứng hoặc detector bi nhiễu Nếu đánh giá dựa vào chiều cao peak (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh peak) thì không cần xét đến hệ số đối xứng
>_ Cách tính kết quả
® Phương pháp ngoại chuẩn (phương pháp đường chuẩn)
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau trong điều kiện tương tự mẫu phân tích Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích của peak đối với đãy chất chuẩn Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của peak vào nông độ chất phân tích Để xác định nồng độ chất phân tích C ta cũng thực hiện phép đo đối với chất phân tích, được S (h.) nhất định, đối chiếu với đường chuẩn ta có nồng độ chất phân tích trong mẫu
‘© Phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng ngay mẫu phân tích làm nền Dung dịch mẫu thử được thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn, tiến hành phép sắc ký trên mẫu thử và mẫu thêm chuẩn phải trong cùng điều kiện
Trang 31+ Cột bao vé, C18 pha đảo
Các tiêu chí tính năng đối với các cột tách thích hợp là độ phân dải nền của chất phân tích tương ứng 3.2.2 Hóa chắt ~ Chất chuẩn saccharin ~ Chất chuẩn Acesulfame kali ~ Acetonitril ~ Metanol
~ Kali dihydro orthophosphat (KH;PO,) ~ Dikali hydro orthophosphat (K2HPOs)
- Axit phosphoric, p2o(HsPOs) = 1,71g/ml, w(HsPOs
= Axit phosphoric, w(HsPOs) = 5%: Ding pipet ldy cén thận 6ml axit
phosphoric cho vào bình định mức 100ml, có chứa 80ml nước Pha loãng bằng
nước đến vạch
-Dung dich Camz I Hòa tan 15g kai hexaxyanoferrat (1)
(K+[Fe(CN)¿]-3H2O) trong nước và thêm nước đến 100ml ~ Dung dịch Carrez II: Hòa tan 30 g kẽm sulfat (ZnSO 7
) trong nước và thêm nước đến 100ml
~ Dung dịch dém phosphat c(KH:POs) = 0,02 mol/L, pH = 4,32: Hòa tan 2,72g kali dihydro orthophosphat vào 800ml nước trong cốc có mỏ dung tích 1000ml Chinh pH đến 3,5 bằng axit phosphoric Chuyển dung dịch này sang bình định mức
1000ml và thêm nước đến vạch
- Pha động: dung dịch đệm phosphat va acetonitril
Đong cần thận lượng dung dịch đệm phosphat đã chọn cho vào acetonitril và
trộn Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0.45um và khử khí dé 5 phút trong thiết bị siêu âm “Chuẩn bị pha động trong ngày sử dụng
~ Dung dịch gốc
Cân 10mg saccharin va 10mg acesunlfame kali, chinh xéc dén 0,1mg, cho vào bình định mức 100ml Hòa tan và pha loãng bằng nước đến vạch Dung dịch này có chứa Ig/] của từng chất tạo ngọt
Trang 32~ Dung địch chuẩn: + Dung dịch chuẩn I
Dùng pipet lấy 10ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml và pha loãng bằng nước đến vạch Dung dịch này có chứa 100mg/1 của từng chất tạo ngọt
+ Dung địch chuẩn II
Dũng pipet lấy 5ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml và pha
loãng bằng nước đến vạch Dung dịch này có chứa 50mg/1 của từng chất tạo
ngọt
+ Dung dịch chuẩn III
Dùng pipet lấy Iml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml và pha loãng bằng nước đến vạch Dung dịch này có chứa 10mg/1 của từng chất tạo
ngọt
3.3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Các loại thực phẩm truyền thống được chế biến từ hải sản, thịt lợn, đậu 3.3.2 Phương pháp lấy mẫu, xử lý mẫu và báo quản mẫu [3J'
Mẫu thực phẩm truyền thống được lấy gồm thực phẩm chế biến từ hải sản
(tôm chua, ruốc), từ thịt lợn (nem, chả), đậu (mè xửng, chè đậu xanh) Mỗi mẫu
được tiến hành lấy ở 5 cơ sở nỗi tiếng khác nhau trên địa bàn tinh Thừa Thiên Huế
và bảo quản theo quy định [3]
Kí hiệu mẫu: mẫu ruốc kí hiệu R;, mẫu tôm chua kí hiệu T,, mẫu chả kí hiệu
C¡, mẫu nem kí hiệu Nị, mẫu mè xửng kí hiệu M,, mẫu chè kí hiệu Chí trong đó
¡= 1+§ là vị trí lấy mẫu, mẫu lấy ở tinh Thừa Thiên Huế được trình bày ở bảng 2
Trang 33Bang 2.1 Kí hiệu mẫu và vị trí lầy mẫu Ki a Ki ma
ay Vị trí lấy mẫu " Vị trí lấy mẫu Rỉ | CôRi— 184 Tăng Bạt Hỗ Ni [BàKý~3 Đào DuyTừ R: | BàXoa-32 Tô Hiển Thành N: [191 Tang Bat Ho
Rs [39— Duong Vin An N; [BãĐảm-lô454-AnCựu Ry [453—Nguy€n Tat Thanh Ni [2 Dao Duy Te
Rs | 15/03 Mac Dinh Chi Ns | 115 Han Mae Tr Ti | CORi— 184 Ting Bat Hỗ Mi [Thiên Hương Ta [Bà Xoa~32 Tô Hiến Thành Mz |Sông Hương
Ts [39- Dương VănAn Ms [Tan Loc T; |22-ChiLăng M: |ThuậnHưng T; | 12- Trin Quang Bich M: [Nam Thuan C_ | BaKy—3 Dio Duy Tr Chr [Ba Trigu
€: [TSI Tăng BạtHỗ Ch [Nguyễn CôngTrứ €: [BàĐâm-l6454-AnCựu Chị [Nguyễn Huệ C¿ [2Đảo DuyTừ Chị [Hằng Vương
€c †TiSHmmMặcTữ Chc [Nguyễn CôngTrứ2
2.3.3 Phương pháp định lượng saccharim và acesulfame kali [3J
Ham lượng saccharin, và acesulfame kali được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha dio, ding detector UV
© Điều kiện sắc ký:
~ Sử dụng cột pha đáo RP18 (150 x 4,6 mm; 3m) ~ Dung môi pha động: đệm phosphat : acetonitril (60:40) - Thể tích bơm mẫu 20uI
~ Tốc độ dòng 0,8ml/phút
~ Detector: UV bước sóng 220nm
2.3.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích [15]
+ Khảo sát khoảng tuyển tính
Trang 34Khoảng tuyến tính được khảo sát bằng phương pháp xây dựng đường chuẩn
biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak thu được theo dãy nồng độ của hai chất
saccharin và acesulfame kali
Để xác định sự phụ thuộc này ta sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính, tinh
ố tương quan R được xây dựng trên phần mềm máy tính
+ Xác định giới han phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu có thê phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu trắng (tín hiệu nền)
Có nhiều cách xác định LOD khác nhau Một trong những phương pháp phổ
biến hiện nay là “quy tắc 3 Ø ”
Theo quy tắc này LOD được xác định như sau:
y=ys+3on hay y=ys+3Sp 410)
Trong đó: y là LOD hoặc tín hiệu ứng với LOD Biết tín hiệu y sẽ tính được
LOD từ phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính:
y=a+bx c LOD =x =ÐTØ Ø2)
ya là nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng
øw (hoặc Sn) là độ lệch chuẩn của nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng
ya và Sa được xác định như sau: Tiến hành thí nghiệm để thiết lập phương trình đường chuẩn y = a + bC Từ đó xác định ys và Sa bằng cách chấp nhận yn (tín hiệu mẫu trắng) là giá trị của y khi x = 0 => yu = a (đoạn cắt trên trục tung của đường chuẩn hồi quy tuyến tính) và Ss = S; (độ lệch chuẩn của tin hiệu y trên đường chuẩn):
(23)
Ở đây: y¡ là giá trị thực nghiệm của y
`Y; là các giá trị tính từ phương trình đường chuẳn của y Sau đó, tính tín hiệu ứng với LOD theo (2.1)
Y=Yn +3§p=a+38, 24) Thay y ở (2.4) vào (2.2), ta sẽ được công thức tính LOD:
Trang 353,0%S,
Lop= — + (25) Ở đây, b là độ đốc của đường chuẩn hồi quy tuyến tính
Giới hạn định lượng LOQ là tín hiệu hay nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống định lượng được
LOQ= 10S, = 3,3LOD (26)
Dé xác định LOD, người ta xây dựng đường chuẩn tuyến tính ở gần gốc tọa độ, hay trong khoảng hẹp của nồng độ các chất ở gần gốc tọa đô
'Kết quả được tính trên phần mềm Excel + Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp được xác định thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) RSD (%)= - 100 xe Trong đó : S: độ lệch chuẩn x„: giá trị trung bình
Khi phân tích một nồng độ xác định (C) (đô lặp lại được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả ở các phòng thí nghiệm tham gia), nồng độ đó tuân theo phương trình Horwitz:
RSDu (9%) = 20 = 05'z€) Trong đó
RSDu là độ lệch chuẩn tương đối khi xác định chất phân tích có nồng độ C
(các phòng thí nghiệm tham gia phân tích dùng bắt kỳ phương pháp nào)
C là nồng độ chất phân tích biểu diễn dưới dạng phân số
'Khi chất phân tích nồng độ C trong nội bộ phòng thí nghiệm, nếu đạt được độ
lặp lại với RSD (%) < 1⁄4 RSDu là đạt yêu cầu
+ Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách phân tích mẫu thêm chuẩn rồi tính độ thu hồi (Rev)
Trang 36Tién hanh: phan tich mau co thém chuan 6 mite néng d6 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm Do lap lại 3 lần, lấy giá trị trung bình Độ thu hỏi tính theo công thức:
Rey % =—C?— 100
oC,
Co là nồng độ chất thêm chuẩn trong mẫu thử: C¡ là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
C¿ là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử đã thêm chuẩn 2.4 Quy trình xử lý mẫu > Chuin bi dung dich mẫu thử |3| Cân khoảng từ 5g phần mẫu đã đồng hóa kỹ, chính xác đến Img, cho vao binh định mức 100ml Thêm khoảng 50ml nước và đặt bình này vào thi
40°C trong 20 phút bị siêu âm ở
Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng Thêm 2ml dung dịch thuốc thử
'Carrez I, trộn rồi thêm 2ml dung dịch Carrez II Lắc mạnh và để yên dung dịch ở
nhiệt độ phòng trong 10 phút Pha loãng bằng nước đến vạch Lọc dung dịch qua
giấy lọc gấp nếp, loại bỏ 10ml dịch lọc đầu tiên
> Nhận biết: [3|
Nhận biết các chất tạo ngọt trong dung dịch mẫu bằng cách so sánh các thời gian lưu của chất phân tích có liên quan trong dung dịch mẫu với các thời gian lưu của chất chuẩn
Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thứ và dung địch chuẩn Khoảng thời gian giữa các lần bơm kế tiếp của các dung dịch chuẩn không được nhỏ hơn 15 phút
'Khi có khả năng bị nhiễu thì nên rửa các cột Pha động thích hợp để rửa cần có các thành phần sau: 50 phần thể tích đệm phosphat + 50 phần thể tích acetonitril
>_ Xác định [3]
Đối với việc xác định theo phương pháp ngoại chuẩn, thì tích phân các diện
tích peak hoặc xác định chiều cao peak và so sánh kết quả với giá trị tương ứng của chất chuân có diện tích peak, chiều cao peak gần nhất hoặc sử dụng đường chuẩn
Trang 37Dé chuẩn bị đường chuẩn bơm một lượng thích hợp các dung dịch chuân có
các nồng độ khối lượng thích hợp Vẽ các chiều cao peak hoặc diện tích peak của các dung dịch chuẩn tương ứng với nồng độ khối lượng tính bằng mg/1 Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn
Ngoài ra việc hiệu chuẩn cũng có thể được đánh giá bằng hồi quy toán học Kiểm tra độ tuyến tính của đường hỗi quy
>_ Tính kết quả |3]
«_ Phương pháp ngoại chuẩn
Tính phần khối lượng của chất tạo ngọt có liên quan (w) đo bằng mg/kg hoặc
nồng độ khối lượng (p) đo bằng mg/I theo công thức (1) m*F 1000 on) Trong đó: 4¿ là điện tích peak của chất tạo ngọt có liên quan thu được bằng dung dịch mẫu thử; 4› là điện tích peak của chất tạo ngọt có liên quan thu được bing dung dich chuẩn;
ƒ¡ là thể tích của dung địch mẫu (ở đây là 100ml hoặc 500ml) tính bằng ml; V> la thể tích của dung dịch chuẩn (ở đây là 100ml) tính bằng ml;
‘my là khối lượng của chất tạo ngọt có liên quan trong dung dich chuẩn (V›) tính
bing mg;
mo la khi lượng của phần mẫu thử, tính bằng g hoặc mi
là hệ số pha loãng dùng cho phương pháp tỉnh sạch được sử dụng (Ví dụ
khi làm sạch cột thì Z = 10; khi làm trong thuốc thử Carrez thì F = 1)
«Đường chuẩn:
“Tính phần khối lượng của chất tạo ngọt có liên quan (w) đo bằng mg/kg hoặc nông độ khối lượng (p) đo bằng mg/1 theo công thức (2):
CxExI, @
Trang 38
Trong đó:
C là hàm lượng chất tạo ngọt có liên quan trong dung dịch mẫu thử, đọc
được từ đường chuẩn, tinh bằng mg/1 hoặc mg/kg;
F, Vi, mo xem trong công thức (1)
2.5 Xử lý số liệu thực nghiệm
Áp dụng phần mềm excel 2010 để xử lý và kiểm tra các số liệu thực nghiệm,
phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA I chiều)
'Đánh giá hàm lượng hai chất bằng phương pháp thống kê © Tinh sai s6 [15] Các kết quả sau khi xử lý bằng pham mém Excel 2010 trén may vi tính và biểu diễn dưới dạng: Trong đó: Giá trị trung bình của các lần xác định 98 Chuan student ứng với p
Sai số chuẩn của các giá trị trung bình được xác định bằng biểu thức: S, Trong đó: S là độ lệch chuẩn: s x, - XP " Do do: Sy = YL —— (N: số lần thí nghiệm) NW=1
© Phan tich phuong sai mét yéu t6 (ANOVA 1 chiéu)
+ Ảnh hướng của một yếu tổ trên giá trị quan sát Y; (i=
2,3, K)
Trang 39Bang 2.2 Swe bién déng ham lugng 2 chat tao ngot theo yéu tổ khảo sát : ‘Cie mức độ của yêu tô khảo sát Số thí nghiệm 1 2 i m 1 xi xa Xu xi 2 Xa xe Xj Xem T xã xa Xã xe N Xai xe xe Xem Tong cong Tr T T; Tạ
Bang 2.3 Kết quả phân tích ANOVA I chiéu
Nguôn | Tongbinh | Bact] Phuong] Fim Ty nã phương sai | phương do(Ð sai
Khối yêutôT | 7 s Fp =0.05,F fun) o! fem-l Sai sốthi | Q=@-O} fy =ma-H nghigm Phuong sai 1 tổng Œ)vớiN=nm'
Nếu tu: < tý usy& tương ứng với mức ý nghĩa p = 0,05: các kết quả thí
nghiệm như nhau, hay yếu tố khảo sát không ảnh hưởng đến kết quả
ghiệm có
ý nghĩa về mặt thống kê với p > 0,05
Nếu tím > tly suy tương ứng với mức ý nghĩa p = 0,05: các kết quả thí nghiệm khác nhau, hay yết
hảo sát ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm có ý
nghĩa về mặt thống kê với p < 0,05
Trang 40CHƯƠNG 3
KET QUA VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng saccharin và acesulfame kali 3.1.1 Khảo sắt ảnh hưởng của tốc độ dòng tối quả trình tách
Tốc độ dòng là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình tách sắc ký Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát trên hệ dung môi pha động
dich dich đệm phosphat: acetonitil = (60:40) với tốc độ dòng 0,6ml/phút;