Tác động sinh thái của thuốc trừ sâu cypermethrin ở nồng độ môi trường đến vi khuẩn phân lập từ nước hồ 29/3, Tp Đà Nẵng

Bài viết Tác động sinh thái của thuốc trừ sâu cypermethrin ở nồng độ môi trường đến vi khuẩn phân lập từ nước hồ 29/3, Tp Đà Nẵng trình bày xác định ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cypermethrin ở nồng độ thường tồn dư trong môi trường nước đến số lượng sống, hoạt tính enzyme (protease, cellulase) và khả năng kháng kháng sinh (độ nhạy cảm với kháng sinh) sau tiếp xúc lâu dài với Cypermethrin của vi khuẩn E. Coli và Pseudomonas sp. được phân lập từ hồ 29/3, thành phố Đà Nẵng.

Phùng Khánh Chuyên, Nguyễn Thị Tâm 68 TÁC ĐỘNG SINH THÁI CỦA THUỐC TRỪ SÂU CYPERMETHRIN Ở NỒNG ĐỘ MÔI TRƯỜNG ĐẾN VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ NƯỚC HỒ 29/3, TP ĐÀ NẴNG ECOLOGICALLY RELEVANT EFFECTS OF THE INSECTICIDE CYPERMETHRIN AT ENVIRONMENTAL CONCENTRATIONS ON THE BACTERIA ISOLATED FROM 29/3 LAKE, DANANG CITY Phùng Khánh Chuyên, Nguyễn Thị Tâm Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng; khanhchuyenqlmt@gmail.com Tóm tắt - Thuốc trừ sâu thường nghiên cứu độc tính lên vi sinh vật, nhiên chủ yếu tập trung vào độc tính cấp nồng độ gây chết khơng phải độc mãn tính nồng độ thấp Trong nghiên cứu này, kết cho thấy tiếp xúc với thuốc trừ sâu cypermethrin nồng độ tương đương với nồng độ diện môi trường ảnh hưởng chức sinh thái vi khuẩn phân lập từ hồ 29/3 E coli Pseudomonas sp., hoạt động enzyme (cellulase protease) Trong nồng độ xử lý thấp cypermethrin không tác động đến tổng số tế bào sống hai loài vi khuẩn phân lập, chúng lại làm giảm hoạt động enzyme cellulase protease Sau tiếp xúc với cypermethrin hầu hết nồng độ, E coli Pseudomonas sp bị giảm độ nhạy với kháng sinh thông dụng ceftazidim ciprofloxacin Riêng tiếp xúc với nồng độ cypermethrin 25µg/L gây kháng mức trung bình E coli với ciprofloxacin Abstract - Insecticides are often tested for toxicity but only for acute and lethal, not for chronic and sublethal effects on microbes In this study, exposures of Escherichia coli and Pseudomonas sp isolated from 29/3 lake in Danang city to the pesticide cypermethrin at environmentally relevant concentrations (0.25; 2.5 and 25 µg/L) were found to induce changes regarding ecological function such as enzymatic activities (cellulase and protease) While these sublethal concentrations of cypermethrin did not affect total vital bacteria cells of both bacteria species, they reduced activity of cellulase and protease enzymes in E coli and Pseudomonas sp With the application of cypermethrin at most of the concentrations, E coli and Pseudomonas sp had significant reduction in susceptibility to the antibiotics ceftazidim and ciprofloxacin Specifically, exposure to 25µg/L of cypermethrin caused intermediate resistance to ciprofloxacin in E coli Từ khóa - thuốc trừ sâu; cypermethrin; vi khuẩn; kháng kháng sinh; tác động sinh thái Key words - insecticides; cypermethrin; bacteria; antibiotic resistance; ecological effects Đặt vấn đề Nông nghiệp kinh tế quan trọng việc đảm bảo an ninh lương thực, phát triển hội nhập quốc tế Việt Nam Trong nông nghiệp, việc sử dụng phân bón hóa học hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) có thuốc trừ sâu mang lại hiệu đáng kể phòng trừ dịch hại, sâu bệnh, tăng suất sản lượng nông phẩm Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc trừ sâu nơng nghiệp ngày tăng, với độc tính loại thuốc trừ sâu thường cao, nên gây tác hại tiêu cực sức khỏe người, mơi trường lồi sinh vật khơng chủ đích khác, kể lồi vi sinh vật Thuốc trừ sâu thâm nhập vào hệ sinh thái thuỷ sinh nhiều cách: Dùng trực tiếp để kiểm soát sâu bệnh, vi khuẩn, nấm bệnh cho trồng động vật thuỷ sinh; Tiếp cận với nguồn nước lan truyền từ vùng đất xung quanh phun hay bón thuốc Khi thuốc trừ sâu xâm nhập vào môi trường nước tồn lâu dài gây số tác động tiêu cực cho sinh vật thủy sinh hệ thống vi khuẩn phân giải chất hữu nước [1] Hệ vi sinh vật môi trường nước có vai trị quan trọng chuyển hóa vật chất thơng qua chu trình dinh dưỡng chuyển hóa nitơ, phân giải cellulose, phân giải tinh bột… Sự phân bố lồi vi khuẩn mơi trường nước góp phần điều hịa chất lượng nước tự nhiên, giảm ô nhiễm môi trường giảm tượng phú dưỡng gây ảnh hưởng đến sinh vật thủy sinh khác Phản ứng vi sinh vật khuyến cáo số cảnh báo sớm căng thẳng hệ sinh thái, nhờ vào tính chất phản ứng nhanh chóng với thay đổi điều kiện môi trường, tiếp xúc với độc tố [2] Độc tính thuốc trừ sâu ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật theo cách khác Thuốc trừ sâu điều chế phát triển với chế hoạt động đặc biệt cho côn trùng, cỏ dại mầm bệnh Hầu hết thuốc trừ sâu với cách thức hoạt động cụ thể sâu bệnh (thuốc ức chế AChE, điều biến GABA, kênh điều biến natri kali, chất ức chế sterol, ức chế phát triển) khơng có hoạt động hay tác dụng trực tiếp vi khuẩn [3] Các loại thuốc trừ sâu với chế khơng có tiềm tác động đến vi khuẩn khơng gây ảnh hưởng đến chúng, mặt khác với loại có tiềm ảnh hưởng tác động cách làm vi khuẩn chết, làm giảm dân số hoạt tính chúng Hóa chất bảo vệ thực vật ảnh hưởng đến vi khuẩn theo nhiều cách thông qua việc biến đổi thuộc tính sinh hóa sinh lý [4], việc tiêu diệt chúng Thuốc trừ sâu gây hại trực tiếp (ngay ngắn hạn) đến vi khuẩn tiếp xúc với hóa chất gián tiếp thay đổi gây chất hóa học mơi trường hay thông qua nguồn thực phẩm [5] Tác động thuốc trừ sâu bị ảnh hưởng nhiều thông số mơi trường, ngồi tính độc nội hóa chất Cypermethrin hoạt chất nhóm Cúc tổng hợp (Pyrethroid), tổng hợp thành công vào năm 1974, thuốc trừ sâu ứng dụng rộng rãi hiệu nông nghiệp, nuôi trồng thủy sản sử dụng lĩnh vực gia dụng y tế [6] Hoạt chất cypermethrin thuộc nhóm độc II, có số tác động mơi trường tương đối cao (EIQ 36,35), cypermethrin độc với cá ngun nhân làm tơm chết hàng loạt Vì ngày 16/01/2012, Bộ NN&PTNT ban hành Thông tư số 03/2012/TTBNNPTNT cấm sử dụng cypermethrin sản xuất, kinh ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 3, 2020 doanh thủy sản Tuy nhiên, loại thuốc trừ sâu có hoạt chất sản xuất sử dụng rộng rãi nông nghiệp Điều dẫn đến nguy xâm nhập tồn dư hệ sinh thái thủy sinh, gây ảnh hưởng đến trình phân giải hệ vi khuẩn nước, góp phần làm tăng nhiễm mơi trường nước Tuy vậy, tác động sinh thái loại thuốc trừ sâu nói chung cypermethrin nói riêng chủ yếu đánh giá độc tính cấp số lượng tế bào sống vi sinh vật nồng độ xử lý cao Do đó, cịn thiếu nghiên cứu độc tính lâu dài số liên quan đến chức sinh thái ảnh hưởng đến độ nhạy vi khuẩn với loại kháng sinh phổ biến Bài báo xác định ảnh hưởng thuốc trừ sâu Cypermethrin nồng độ thường tồn dư môi trường nước đến số lượng sống, hoạt tính enzyme (protease, cellulase) khả kháng kháng sinh (độ nhạy cảm với kháng sinh) sau tiếp xúc lâu dài với Cypermethrin vi khuẩn E Coli Pseudomonas sp phân lập từ hồ 29/3, thành phố Đà Nẵng Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp thu mẫu Các mẫu nước thu hồ công viên 29/3 TP Đà Nẵng quy trình thu mẫu theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8880:2011 - Chất lượng nước - Lấy mẫu nước để phân tích vi sinh vật Chọn 05 vị trí thu mẫu khác hồ sau trộn mẫu lại để mẫu đặc trưng Mẫu bảo quản lạnh, không để ánh sáng tiếp xúc trực tiếp với mẫu vận chuyển nhanh phịng thí nghiệm để phân tích 2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Phân lập mẫu dựa phương pháp phân lập Egorow [7] 2.3 Phương pháp định danh vi khuẩn Xác định đặc điểm hình thái, phản ứng sinh hóa, kiểm tra tiêu bản: Nhuộm Gram, tính di động, catalase, oxidase, khả sử dụng đường điều kiện hiếu khí yếm khí (O/F), dựa theo phương pháp Frerichs Millar [8] Buller [9] Đồng thời, sử dụng kít API 20E (BioMerieux) để định danh đến loài vi khuẩn 2.4 Phương pháp giữ giống vi khuẩn Egorow Để bảo quản chủng giống vi sinh vật cho nghiên cứu tiếp theo, vi khuẩn cấy lại định kì mơi trường thạch nghiêng có môi trường để tủ ấm 350C – 390C - ngày Sau bảo quản tủ lạnh 0C, cấy chuyền định kì để giữ giống 2.5 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn Tổng số vi khuẩn xác định phương pháp đếm số khuẩn lạc môi trường thạch đĩa thích hợp loại vi khuẩn 𝐶𝐹𝑈 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 (𝐶𝐹𝑈)𝑥 Độ 𝑝ℎ𝑎 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 = 𝑔 𝑇ℎể 𝑡í𝑐ℎ 𝑚ẫ𝑢 (𝑚𝑙) 2.6 Phương pháp xác định khả sinh hoạt tính enzyme protease, cellulase amylase vi sinh vật Xác định khả sinh hoạt tính enzyme protease, cellulase vi sinh vật phương pháp đục lỗ thạch [7] 69 2.7 Phương pháp xác định thời gian sinh trưởng vi khuẩn Xác định đường cong sinh trưởng vi sinh vật tuyển chọn phương pháp nuôi cấy tĩnh đếm số lượng khuẩn lạc môi trường thạch đĩa [10] 2.8 Phương pháp kháng sinh đồ Phương pháp lập kháng sinh đồ thực theo tiêu chuẩn The Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2006) [11], sử dụng môi trường MuellerHinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany) với loại kháng sinh Ciprofloxacin, Ceftazidime (Bio-rad, Marnes-la-Coquettle, France) Ủ 24 – 48 28 – 300C, sinh khối khoảng 108 CFU/mL Đo đường kính vô trùng (mm) theo tiêu chuẩn Clinical Laboratory [11], nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình kháng Độ nhạy vi khuẩn loại kháng sinh ceftazidime ciprofloxacin quy định theo bảng 1: Bảng Xác định độ nhạy vi khuẩn ceftazidime ciprofloxacin theo đường kính vịng vơ trùng (CLSI 2006) Kháng sinh Vịng vơ trùng (mm) Nhạy Kháng trung bình Kháng Ceftazidime 19 17 – 18 16 Ciprofloxacin 21 15 – 20 14 2.9 Phương pháp xử lí số liệu Tất số liệu lặp lại với mẫu Phân tích hồi quy đơn biến (ANOVA) (phần mềm SPSS phiên 22) sử dụng để nhận biết khác biệt thông số mẫu xử lý thuốc trừ sâu mẫu đối chứng(∝= 0,05) Nếu có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 95% (p0,05) phép phân tích hậu định Tukey sử dụng để nhận biết nồng độ xử lý có tác động mang ý nghĩa thống kê đến thông số 2.10 Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm ảnh hưởng cypermethrin lên vi khuẩn phân lập Vi khuẩn nuôi lọ chứa môi trường NB lỏng, với nồng độ thuốc thử nghiệm cuối tương đương với nồng độ cypermethrin diện môi trường nước mặt báo cáo nghiên cứu trước (0,11µg/L) [12] cao nồng độ từ 10 – 100 lần để mô nồng độ nước thải trường hợp sử dụng thuốc trừ sâu với số lượng lớn nhiều khơng kiểm sốt chặt chẽ (gồm 0,25; 2,5 25µg/L) Ni lắc máy lắc (200 vòng/phút) sau 48h mẫu vi khuẩn lọ lấy để xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp đục lỗ thạch, xác định mật độ sống theo phương pháp xác định tổng số vi khuẩn cấy chuyền qua đợt môi trường giống môi trường ban đầu để tiến hành xác định hoạt độ enzyme, mật độ sống theo thời gian Kết nghiên cứu 3.1 Kết mật độ sống vi khuẩn nuôi cấy với cypermethrin nồng độ khác Từ mẫu nước mặt phân lập định danh chủng vi khuẩn Thử nghiệm sinh hóa với sử dụng test API định danh chủng này, gồm E.coli, Phùng Khánh Chuyên, Nguyễn Thị Tâm 70 Bảng Mật độ sống vi khuẩn sau đợt cấy chuyền môi trường chứa thuốc trừ sâu cypermethrin nồng độ khác Nồng độ thuốc trừ sâu (µg/L) Vi khuẩn Thời gian Số lượng vi khuẩn*108±SE (CFU/mL) Đối chứng 0,25 2,5 25 Sau 48h đợt 167,30 ±5,24 165,00 ±2,65 166,30 ±3,84 166,00 ±3,79 Sau 48h đợt 167,00 ±6,66 163,67 ±4,80 162,30 ±4,84 165,00 ±4,36 Sau 48h đợt 168,30 ±2,90 162,00 ±3,46 162,00 ±5,36 165,00 ±4,73 Sau 48h đợt 153,30 ±3,48 154,67 ±3,48 151,67 ±1,86 153,67 ±3,53 Pseudom Sau 48h onas sp đợt 154,67 ±3,53 152,00 ±3,22 154,00 ±4,04 155,30 ±7,10 Sau 48h đợt 154,00 ±3,60 155,30 ±1,80 154,67 ±5,24 155,30 ±3,84 E coli Về khả sinh trưởng chủng vi khuẩn qua nồng độ đợt sau ngày tiếp xúc với thuốc, số lượng CFU/ml E.coli nằm pha cân nồng độ 0,25 µg/L; 2,5µg/L, 25 µg/L khơng có khác so với đối chứng Cụ thể, đợt số lượng CFU/ml dao động từ 165,0±2,7 đến 166,3±3,8 CFU/ml, so với mẫu đối chứng (167,3±5,2) khơng có khác biệt rõ rệt (p-value>0,05) Ở đợt 2, số lượng CFU/ml thấp nồng độ 2,5 µg/L 162,3±4,8 so với mẫu đối chứng 167,0±6,7CFU/ml khác Trong đợt 3, tương tự đợt trước số lượng CFU/ml nồng độ thuốc dao động từ 162,0±3,5 đến 165,0±4,7 CFU/ml, nhiên không khác biệt so với mẫu đối chứng 168,3±2,9 CFU/ml Đối với Psedomonas sp., số lượng vi khuẩn sau đợt cấy chuyền tiếp xúc với thuốc trừ sâu Cypermethrin, có số lượng sinh trưởng pha cân thấp so với số lượng sinh trưởng E.coli, nhiên khơng có thay đổi có ý nghĩa thống kê so với mẫu đối chứng Ở đợt 1, số lượng vi khuẩn dao động từ 151,7±1,9 đến 154,7±3,5CFU/ml, so với mẫu đối chứng 153,3±3,5 CFU/ml khơng có khác biệt (p>0,05) Tương tự, đợt đợt số lượng vi khuẩn pha cân khơng có khác biệt so với mẫu đối chứng 3.2 Kết đánh giá khả sinh hoạt tính enzyme cellulase protease vi khuẩn sau cấy chuyền môi trường chứa cypermethrin 3.2.1 Tác động lên enzyme cellulase Kết phân tích cho thấy, theo nồng độ thuốc thời gian tiếp xúc lâu dài với cypermethrin khả sinh tổng hợp cellulase E.coli có chênh lệch so với mẫu 40 Đường kính (mm) Kết đếm CFU hai loài vi khuẩn mẫu đối chứng mẫu xử lý với thuốc trừ sâu cypermethrin nồng độ khác qua đợt cấy chuyền thể Bảng đối chứng đợt ni cấy, khác có ý nghĩa thống kê (p