(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus penta e, d18s51, d21s11, TH01 và d3s1358 phục vụ giám định

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN - Bùi Nguyên Hải NGHIÊN CƢ́U XÂY DƢ̣NG THANG ALEN CHỈ THI ̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, năm 2012 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN - Bùi Nguyên Hải NGHIÊN CƢ́U XÂY DƢ̣NG THANG ALEN CHỈ THI ̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH Chuyên ngành: Di truyề n ho ̣c Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội, năm 2012 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ/ chữ viết tắt ADN APS LD bp dNTP dATP dTTP dGTP dCTP FL M50 OD PCR PBS RFLP STR Taq TBE TE TEMED VNTR w/v Nghĩa tiếng Anh Acid Deoxyribonucleic Amonium persulfate Allelic ladder Base pair Deoxynucleoside triphosphate Deoxyadenine triphosphate Deoxythymidine triphosphate Deoxyguanine triphosphate Deoxycytozine triphosphate Fluorescein Marker 50bp Optical density Polymerase chain reaction Phosphate buffer saline Restriction fragment length polymophism Short Tandem Repeat Thermus aquaticus Tris-Boric acid-EDTA Tris-EDTA N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine Variable number of tandem repeat Weight/volume Nghĩa tiếng Việt Thang alen chỉ thi ̣chuẩn Cặp bazơ nitơ Chất nḥm huỳnh quang Fluorescein Thang kích thƣớc ADN 50bp Mật độ quang Phản ứng chuỗi trùng hợp Đa hình theo chiều dài đoạn bị cắt enzyme giới hạn Các đoạn lặp lại ngắn Các đoạn lặp nối tiếp có số lƣợng khác Khối lƣợng/ thể tích TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Mở đầu Chƣơng Tổng quan tài liệu Phƣơng pháp xác định cá thể dựa thị ADN 1.1.1 Cơ sở khoa học phân tích ADN xác định cá thể 1.1.2 Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN 1.1 1.1.2.1 Kỹ thuật RFLP 1.1.2.2 Các kỹ thuật dựa phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 1.2 Đại cƣơng locus STR đƣợc sử dụng nhận dạng cá thể ngƣời 1.2.3 Các locus STR ứng dụng phân tích cá thể người 1.2.4 Các locus sử dụng nghiên cứu Các phƣơng pháp phát ADN 10 1.3.1 Phương pháp nhuộm Ethidum bromide 12 1.3.2 Phương pháp đánh dấu phóng xạ 12 1.3.3 Phương pháp nhuộm bạc 12 1.3.4 Phương pháp đánh dấu huỳnh quang 13 Đại cƣơng chất huỳnh quang và ứng dụng phân 15 1.3 1.4 tớch ADN 1.4.1 Khỏi niệm chất huỳnh quang 15 1.4.2 Ứng dụng chất huỳnh quang phõn tớch ADN 17 Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen thị huỳnh quang 18 1.5.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trờn giới 18 1.5.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu nước 19 1.5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 Nguyên liệu 21 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.1.2 Thiết bị, vật tƣ nghiên cứu 21 2.1.3 Mồi cho locus nghiên cứu 21 2.1.4 Hoỏ chất 22 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN 25 2.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng ADN 25 2.2.3 Phƣơng pháp nhân bội ADN 26 2.2.4 Kỹ thuật điện di ADN 27 2.2.5 Phƣơng pháp phát ADN sau điện di 29 Phát băng ADN Ethidium bromide 29 2.2.5.2 Phát băng ADN kỹ thuật soi gel huỳnh quang 30 2.1 2.2 2.2.5.1 2.2.6 Phƣơng pháp chế tạo thang alen thị huỳnh quang 31 2.2.7 Thu thập và xử lý liệu 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết tỏch chiết ADN 35 3.2 Kết kiểm tra sản phẩm nhõn bội trờn gel agarose 36 3.3 Kết điện di khảo sát mẫu gel poly acrylamide 39 3.4 Kết lựa chọn mẫu và tinh sản phẩm nhõn bội 44 3.5 Kết chế tạo thang alen dạng đơn lẻ 47 3.6 Kết chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus 50 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 55 55 4.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC (Bảng và Hỡnh ảnh) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 55 56 MỞ ĐẦU Những năm cuối kỷ XX đã chứng kiến phát triển nhanh chóng kỹ thuật di truyền kể từ James Watson và Francis Cric phát cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN (năm 1953), và Kary Mullis phát minh phƣơng pháp nhân bội ADN từ một lƣợng ADN nhỏ ban đầu ống nghiệm (năm 1985) Những thành tựu này nhanh chóng đƣợc ứng dụng rộng rãi nghiên cứu y, sinh học và khoa học hình nhằm mục đích xác định đặc trƣng cá thể ngƣời Có thể kể đến ứng dụng để phân biệt cá thể đƣợc tiến hành Anh vào năm 1985 với cơng trình nghiên cứu Alec Jeffreys và cợng nghiên cứu đoạn gen mã hóa protein Myoglobin máu ngƣời Họ đã phát đoạn gen có mợt trình tự bao gồm bazơ nitơ đƣợc lặp lại một số lần, điều đáng ý là đoạn lặp này cá thể khác có số lƣợng đoạn lặp khác Jeffreys coi là một đặc điểm quan trọng để phân biệt khác cá thể Với phát triển kỹ thuật gen, nhiều đoạn lặp lại đa hình khác lần lƣợt đƣợc phát sau Từ việc phát đoạn đa hình có trình tự lặp lại phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn (RFLP) đến phƣơng pháp lai đầu dò (ADN probe), đoạn lặp lại ngẫu nhiên có đợ dài đơn vị lặp lại trung bình (VNTR) đoạn có đơn vị lặp lại ngắn, từ 2-4 đôi bazơ nitơ (STR) kết hợp kỹ thuật PCR, phƣơng pháp nhận dạng và phân biệt cá thể đã phát triển lên một tầm cao Cũng từ đây, giám định tƣ pháp gen đời Giám định gen đã khắc phục đƣợc hạn chế phƣơng pháp huyết học trƣớc đây, giúp nhà điều tra truy nguyên đƣợc đến cá thể ngƣời, xác định đƣợc quan hệ huyết thống cha-con, mẹ-con, xác định đƣợc hài cốt, xây dựng sở liệu và tàng thƣ gen tội phạm TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nghiên cứu tìm kiếm trình tự gen đa hình để phân biệt cá thể ngƣời đồng thời nghiên cứu chế tạo bợ KIT phục vụ cho mục đích này đƣợc nhiều công ty Công nghệ sinh học để ý tiềm ứng dụng lớn Ngay từ năm 90 kỷ trƣớc, hai hãng sản xuất chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã cho xuất xƣởng nhiều bộ KIT khác nhau, bộ KIT đơn locus, locus, locus, 12 locus và 16 locus đã lần lƣợt đời Mỗi bợ KIT phân tích ADN có kèm thang alen chuẩn, một thành phần quan trọng thiếu Thang alen là một hỗn hợp bao gồm tất alen xuất mợt quần thể ngƣời định Sự có mặt thang alen cho phép xác định đƣợc xác kiểu gen mẫu phân tích Bất kỳ mợt thí nghiệm phân tích xác định cá thể ngƣời nào cần sử dụng thang alen Tuy nhiên, bộ KIT đƣợc thƣơng mại hóa hãng kể có giá thành cao, thủ tục nhập đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi Việt Nam Do đó, để chủ đợng cơng nghệ, đồng thời phục vụ cho thí nghiệm phân tích gen ngƣời Việt Nam nói chung, lĩnh vực khoa học hình nói riêng, tiến tới triển khai rợng cơng nghệ phân tích gen tới phịng thí nghiệm địa phƣơng chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng thang alen thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 phục vụ giám định Mục tiêu đề tài là chế tạo đƣợc thang alen thị gắn huỳnh quang cho 05 locus gen đa hỡnh STR nờu trờn dạng đơn lẻ và dạng phức hợp để cú thể sử dụng phõn tớch trờn thiết bị scan gel huỳnh quang phục vụ công tác giám định cá thể TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phƣơng pháp xác định cá thể dựa thị ADN 1.1.1 Cơ sở khoa học phân tích ADN xác định cá thể Với nghiên cứu nhà khoa học, ngƣời đã phát chất di truyền nằm cấu trúc phân tử ADN ADN (axit deoxyribonucleic)là một chuỗi nucleotide gồm loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin (C) và Timin (T) xếp nhau, khác trình tự loại nucleotide phân tử ADN 23 đôi nhiễm sắc thể có tế bào cá thể là sở cho giám định gen để xác định cá thể Hình Cấu trúc phân tử ADN Trong trình tìm kiếm sở nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, nhà khoa học đã phát nhiều công cụ hữu hiệu cho phép xác định TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com khác với mục đích phân biệt cá thể ngƣời này với cá thể ngƣời khác Một phƣơng pháp là dựa dạng đa hình trình tự phân tử ADN [21] Trình tự nucleotide sợi kép ADN có hai dạng đa hình [1, 2, 23]:  Đa hình theo trình tự: gốc nucleotide ngẫu nhiên đoạn ADN khơng theo mợt trình tự nào: Ví dụ: cá thể thứ locus A ta có trình tự: 10 - AGACTGCTAG 10 cá thể thứ hai: - AGCCTGCGAG- Nhƣ vị trí số và vị trí số dãy thứ đã đƣợc thay A C và T G  Đa hình theo chiều dài: Mợt số gốc nucleotide đƣợc lặp lặp lại nhiều lần chiều dài đoạn ADN Ví dụ: Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT-  đoạn lặp ATAT Cá thể thứ hai - ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT -  đoạn lặp ATAT Trong trình hình thành và phát triển loài và cá thể, biến đổi trình tự nucleotide sợi kép ADN đã xảy ra, mà ngƣời đã ghi nhận đƣợc nhiều biến đổi Khái niệm alen đƣợc thống để trạng thái khác gen locus Nhƣ vậy, với gen hay locus, ngƣời đã ghi nhận đƣợc nhiều alen khác Chính khác trình tự nucleotide alen locus phân tử ADN nhiễm sắc thể là sở cho giám định gen hình để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com khuôn đầu vào q trình nhân bợi cho kết thang có alen tƣơng đồng, khơng có alen nào đƣợc nhân bợi nhiều alen lại Thang alen thu đƣợc sử dụng phƣơng pháp trộn mẫu bao gồm alen 5-9-10-11-1213-14-15-16-17-18-19-20 Locus D18S51 25 17 12 11 19 17 LD K562 21 20 18 16 17 13 12 15 15 15 14 Hình 21 Kết chế tạo thang alen locus D18S51 LD: Thang alen đơn đƣợc chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 25,17,12,11,9,4: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 12-21: Các alen thu đƣợc sau khảo sát Thang alen locus D18S51 thu đƣợc bao gồm alen 12 đến 21 Thang alen thu đƣợc có tỷ lệ alen thành phần phù hợp, thể băng ADN đồng đều, khơng có sai khác Locus D21S11 11 LD 21 K562 34 33 32.2 33.2 32 30.2 31.2 30 30.2 29.2 31 30 29 29.2 29 Hình 22 Kết chế tạo thang alen locus D21S11 LD: Thang alen đơn đƣợc chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 9,11,4,21,7,3: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 29-34: Các alen thu đƣợc sau khảo sát 49 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Sử dụng mẫu đã lựa chọn để chế tạo thang alen locus D21S11, thu đƣợc thang alen bao gồm alen từ 29 đến 34 Kết cho thấy thang alen thu đƣợc có chất lƣợng tốt, alen đồng đều, khơng có chênh lệch tỷ lệ Locus TH01 K562 9.3 11 LD 22 15 10 Hình 23 Kết chế tạo thang alen locus TH01 LD: Thang alen đơn đƣợc chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 3,22,7,15: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 5-11: Các alen thu đƣợc sau khảo sát Thang alen locus TH01 thu đƣợc bao gồm alen từ đến 11, bao gồm một alen lẻ 9.3 Các băng ADN (các alen) thang sau chế tạo có tƣơng đồng cao cho thấy tỷ lệ trộn mẫu phù hợp Locus D3S1358 12 18 LD 18 K562 19 17 16 15 16 14 13 Hình 24 Kết chế tạo thang alen locus D3S1358 LD: Thang alen đơn đƣợc chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 6,12,18,4: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 13-19: Các alen thu đƣợc sau khảo sát 50 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Thang alen locus D3S1358 thu đƣợc bao gồm alen từ 13 đến 19 Tỷ lệ trợn mẫu q trình chế tạo thang phù hợp nên thang alen thu đƣợc có băng (các alen) đồng đều, sử dụng cho nghiên cứu 3.6 Kết quả chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus Sau chế tạo đƣợc thang alen đơn, pha loãng sản phẩm PCR thang alen đơn và trộn với để tạo thành khuôn ban đầu để thực phản ứng PCR nhân bội đồng thời 05 locus Nồng độ pha loãng thang alen đơn thực đồng thời cho 05 thang alen đơn là 1/5000 Để nhân bội đƣợc thang alen phức hợp 05 locus một phản ứng, sử dụng kết tối ƣu thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt đƣợc thực đề tài cấp Nhà nƣớc Các thang alen đƣợc trộn theo tỷ lệ khuôn D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: Kết chế tạo thang alen phức nhƣ sau: LD LD K562 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 25 Kết chế tạo thang alen phức 05 locus LD: Thang alen phức hợp 05 locus hoàn chỉnh 51 K562: Mẫu chuẩn TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Thang alen phức hợp sau nhân bội đƣợc điện di mẫu sản phẩm nhân bội sử dụng khuôn ADN chuẩn K562 và một số mẫu khuôn khác Kết cho thấy, thang alen sử dụng để định danh đƣợc kiểu gen mẫu Bên cạnh đó, theo tỷ lệ trợn mẫu D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: 1, chúng tơi nhận thấy thang alen thành phần chƣa có tƣơng đồng Hình ảnh cho thấy, thang alen D21S11 đậm nhất, sau đến thang alen D18S51, thang alen Penta E và D3S1358 tƣơng đƣơng thang TH01 cho hình ảnh mờ so với thang alen cịn lại Do đó, chúng tơi điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn (thang alen đơn) D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E ban đầu từ 1: 1: 1: 1: thành 2: 4: 1: 2: sử dụng cho phản ứng PCR, thu đƣợc kết điện di nhƣ sau: LD LD K562 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 26 Kết điều chỉnh tỷ lệ trợn khn chế tạo thang alen phức 05 locus LD: Thang alen phức chế tạo đƣợc sau điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn K562: MÉu chuÈn 52 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Sau điều chỉnh lại tỷ lệ trộn thang alen đơn làm khuôn nhân bội tạo thang alen phức 05 locus, thu đƣợc thang alen phức rõ nét, có tƣơng đồng locus và sử dụng đƣợc phân tích xác định kiểu gen mẫu khuôn ADN khác Tiến hành nhân bợi thang alen nhiều cấp theo phƣơng pháp đã trình bày, thu đƣợc kết nhƣ sau: LD LD LD 1/1000 1/5000 K562 LD 1/10000 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 27 Kết chế tạo thang alen phức 05 locus hệ LD: Thang alen phức hệ I LD 1/1000, 1/5000, 1/10000: Thang alen phức hệ I, II, III 53 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Từ kết trên, sử dụng nồng độ pha loãng khuôn ADN khác (1000, 5000 và 10.000 lần) để tiến hành PCR tạo thang hệ I, II, III cho kết giống nhau, khơng có khác biệt Do đó, từ nồng đợ này tiếp tục pha loãng để nhân bội thang alen Trƣờng hợp thang alen thời gian bảo quản lâu dài có ảnh hƣởng đến chất lƣợng, sử dụng bợ KIT Wizard®SV Gel and PCR clean-up System hãng Promega để tinh lại sản phẩm PCR và sử dụng làm khuôn cho nhân bội tiếp Thử nghiệm dùng thang alen đã chế tạo để phân tích kiểu gen mợt số mẫu cá thể ngƣời, chúng tơi thu đƣợc hình ảnh phân tích nhƣ sau: 101 103 105 107 109 111 113 115 K562 102 104 106 108 110 112 114 116 LD LD LD LD LD LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 28 Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức đƣợc chế tạo nghiên cứu K562: Mẫu chuẩn - Giếng 101-116: Các mẫu nhân bội 05 locus 54 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 117 118 120 119 LD 122 121 123 LD 124 LD 126 125 K562 LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 29 Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức đƣợc chế tạo nghiên cứu K562: Mẫu chuẩn - Giếng 117-126: Các mẫu nhân bội 05 locus Với kết khảo sát thử nghiệm nhƣ trên, thang alen phức 05 locus D3S1358 – TH01 – D21S11 – D1851 – Penta E đã đƣợc chế tạo hoàn toàn sử dụng để phân tích xác định đƣợc kiểu gen mẫu cá thể ngƣời Thang alen sử dụng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng phân tích cá thể nhƣ lĩnh vực khoa học hình và giải nhu cầu dân sinh nhƣ xác định huyết thống 55 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã chế tạo thành công thang alen thị huỳnh quang cho locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 sử dụng hệ thống scan huỳnh quang  Thang alen locus Penta E gồm 13 alen: alen số 5, từ alen số đến alen số 20  Thang alen locus D18S51 gồm 10 alen: từ alen số 12 đến alen số 21  Thang alen locus D21S11 gồm 11 alen: từ alen số 29 đến alen số 34  Thang alen locus TH01 gồm alen: từ alen số đến alen số 11 (có alen số 9.3)  Thang alen locus D18S51 gồm alen: từ alen số 13 đến alen số 19 Đã chế tạo thành công thang alen thị huỳnh quang phƣ́c hơ ̣p 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 sử dụng hệ thống scan huỳnh quang So với thang alen đơn lẻ, thang alen phức hợp cho phép xác định đƣợc kiểu gen cá thể ngƣời lúc 05 locus, nâng cao hiệu phân tích giám định Kiến nghị Trên sở kết nghiên cứu và xác định đƣợc điểm cịn chƣa giải đƣợc, chúng tơi kiến nghị: Giải trình tự mợt số alen locus để kiểm tra tính xác định tƣ̀ng alen Tiếp tục nghiên cứu xây dựng thang alen thị huỳnh quang khác: Từ 10 locus trở lên để nâng cao đợ xác , phuc vu ̣ tố t cho công tác giám định gen 4.2 56 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nghiêm Xuân Dũng, (2004), “Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ADN nhận dạng cá thể ngƣời“, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học kỹ thuật cấp Nhà nước, KC 04.05 Nghiêm Xuân Dũng, (2007), “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển kỹ thuật phân tích ADN phục vụ chuẩn đốn hình sự’’, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học kỹ thuật cấp Nhà nước, KC 04.31 Nghiêm Xuân Dũng, Lê Đức Đào, Trần Minh Đôn, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Lƣơng Thị Yến, Trần Công Tƣớc, Trần Thị Quỳnh Hoa, Phạm Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Lợi, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, (2000), “Tạo dòng phân tử hai allen dị hợp tử THO1 A và THO1 B’’, Hội nghị sinh học Quốc gia, trang 35-38 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, Lê Bích Trâm, Ngơ Thị Kim, Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, (2003), “Bƣớc đầu nghiên cứu đặc trƣng cá thể ngƣời qua locus PENTA E, D18S51 kỹ thuật PCR’’, Tạp chí Di truyền ứng dụng số 2, trang 25-29 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, (2003), “Bƣớc đầu khảo sát tần số phân bố alen gen D21S11’’, Tạp chí nghiên cứu Y học Số 3, trang 81-85 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, Lê Đức Đào, (2003), “Nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen hệ nhóm máu ABO cá thể’’, Tạp chí nghiên cứu Y học Tập 23, Số 3, trang 74-80 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đơn, Lƣơng Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, (2003), “Tối ƣu điều kiện PCR sử dụng phức hợp mồi locus 57 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PENTA E, D18S51 và D18S51’’, Báo cáo Khoa học Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, trang 1173-1176 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, (2004), “ứng dụng kỹ thuật PCR khảo sát sơ bộ tần suất phân bố alen locus D18S51 ngƣời Việt Nam’’, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Số 1, trang 41-45 Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, (2001), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục 10 Trần Minh Đôn, Nghiêm Xuân Dũng, Lƣơng Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, (2003), “Nghiên cứu chế tạo và ứng dụng thang alen thị locus D18S51”, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, trang 1170-1172 11 Bùi Diệu Hồng, Hà Quốc Khanh, Đinh Thị Nga, (2003), “Tần suất gen D3S1358, vWA, FGA ngƣời Việt ứng dụng giám định gen”, Tạp chí nghiên cứu y học, trang 86-89 12 Hồ Quang Huy, Vũ Triệu An, Văn Đình Hoa, Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, (2004), “Tần suất alen STR PENTA E, D18S51, D18S51 và D21S11 107 ngƣời Mƣờng Việt Nam”, Tạp chí Y-Dược học quân sự, trang 280-283 13 Ngô Thu Hƣờng, Nguyễn Văn Mùi, (2001), “Bƣớc đầu khảo sát một số locus gen cặp mồi đơn để xác định huyết thống ngƣời’’, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Số 2, trang 45-50 14 Hà Quốc Khanh, Đinh Thị Nga, Bùi Diệu Hồng và cộng sự, (2003), “Tần suất gen D8S1179, D21S11, D18S51 ngƣời Việt ứng dụng giám định gen hình sự’’, Báo cáo khoa học Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2003, trang 1102-1105 15 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng, (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 58 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 16 Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung, (2005), Giáo trình Cơng nghệ ADN tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 17 Lê Đình Lƣơng, (2001) “Nghiên cứu tính đặc trƣng cá thể và tần số phân bố alen ba locus VNTR (D1S80, YNZ22, APOB) Việt Nam kỹ tht PCR’’ T¹p chÝ Di trun häc vµ øng dơng, sè 4, trang 40-44 TIẾNG ANH 18 ABI Prism STR Primer Set Protocol, 1995, The Perkin Elmer Corporation 19 Budowle B., Adams D.E., and Allen R.C., Fragment Length Polymophisms for Forensic Science Applications, Methods in Nucleic Acid Research, 181-202 20 Budowle B, Safantila A, Hochmeister MN ADN Corney C T, (1994), The application of STR to Forensic Science, The PCR, pp 244-256 21 Butler MJ, (2001), Forensic DNA typing, Academic Press 22 Butler MJ, (2001), Forensic DNA Typing, Biology ADN Technology behind STR Markers 23 Butler MJ, (2006), Genetics ADN Genomics of Core STR loci used in human identity testing, J Forensic Sci, 51 (Mar 2006 issue) 24 Butler MJ, (2007), Mini-review: Short Tandem Repeat typing technologies used in human identity testing Biotechniques, Vol.43, No.4, Sii-Sv 25 Butler MJ, (2011), Advanced topics in Forensic DNA typing: Methodology 59 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 26 Edwards, A Civitello, H A Hammond, and C T Caskey, (1994), “DNA typing and genetic mapping with trimetic and tetrameric tandem repeats”, Am J Hum Genet 49, pp 746-756 27 Kimpton C, Fisher D., Watson S., Adams M., Urquahard A., Lygo, Gill P, (1994) “Evaluation of an automated DNA profiling system employing mutiplex amplification of four tetrameric STR loci”, Int J Leg Med 106: pp 302-321 28 Marie Phillips, (2002), “DNA fingerprints ADN their statistical analysis in human population” ICOTS6, The University of Melbourne, Australia 29 Maxam A M and Gilbert W., In: Grossman L., Moldave K.(eds), Methods in enzymology, Vol.65 Academic Press, New York, 499-599 30 Promega, (1999), Technical Manual, Geneprint Fluorescent STR systems Promega, (2003), Life Science Catalog 31 Ray A Wickenheiser, (2002), “Trace DNA: A review, discussion of theory ADN application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact” Journal of Forensic Sciences, ASTM International 32 Sambrook, K J Fristsch, E.F Maniatis, T., (1989) Molecular cloning 1, 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press USA 33 Schum et al, (2000), “Allelic ladders for Short Tandem Repeat loci”, United States Patent, No: 6156512 34 Shimada I, Brinkmann B, Nguyen QT, Hohoff C, (2002), “Allele frequency data for 16 STR loci in the Vietnamese population”, International Journal of legal Medicine 35 Southern,E.M., (1975) “Detection of specific sequences among DNA fragments seperated by electrophoresis”, J Molecular Biology 98, pp 503-517 60 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 36 Westermeier R., (1997) Electrophoresis in practice VCH, A Willey Company 37 Wyman A L and White P H (1980) “A highly polymorphic locus in human DNA”, Proc Natl Acad Sci USA 77, pp 6750-6754 38 Yamamoto Y, Inagaki S, Yoshitome K, Okamoto O, Shigeta Y, Doi Y, Takata T, Ishikawa T, Imabayashi K, Miyaishi S ADN Ishizu H, (2001), “Japanese population data on fifteen short tandem repeat (STR) loci D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, PENTA E, PENTA E, D18S51, D21S11, D18S51, D16S539, CSF1PO, PENTA D, VWA, D8S1179, TPOX, FGA”, The 7th Indo-Pacific Congress on Legal Medicine ADN Forensic Sciences 39 ZHOU XiaGuang, REN LuFeng, Li YunTao, ZHANG Mei, YU YuDe & YU Jun (2010), “The next-generation sequencing technology: A technology review ADN future perspective”, Science China- Life Sciences, Jannuary 2010, Vol.53, No., pp 44-57 61 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN Danh mục Bảng Số bảng Tên bảng Bảng Thông tin locus nghiên cứu Bảng Các phƣơng pháp phát ADN Bảng Đặc trƣng một số thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng bộ KIT phân tích STR thƣơng mại Bảng Trình tự mồi nghiên cứu Bảng Thành phần phản ứng nhân bợi đơn locus Bảng Chu trình nhiệt nhân bợi đơn locus Bảng Thành phần phản ứng nhân bội phức hợp 05 locus Bảng Chu trình nhiệt nhân bội phức hợp 05 locus Bảng Các mẫu lựa chọn chế chế tạo thang alen đơn locus Bảng 10 Hàm lƣợng và độ tinh mẫu sản phẩm PCR sử dụng cho chế tạo thang alen đơn Danh mục Hình ảnh Số hình Tên hình Hình Cấu trúc phân tử ADN Hình Quá trình phát huỳnh quang Hình Mơ hình thí nghiệm Hình Kết điện di một số mẫu khuôn ADN tổng số Hình Kết điện di sản phẩm PCR locus Penta E mợt số mẫu khảo sát Hình Kết điện di sản phẩm PCR locus D18S51 một số mẫu khảo sát Hình Kết điện di sản phẩm PCR locus D21S11 mợt số mẫu khảo sát Hình Kết điện di sản phẩm PCR locus TH01 mợt số mẫu khảo sát Hình Kết điện di sản phẩm PCR locus D3S1358 một số mẫu khảo sát Trang 11 18 22 27 27 32 32 45 46 Trang 16 24 35 36 37 37 38 38 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 10 Hình 11 Hình 12 Hình 13 Hình 14 Hình 15 Hình 16 Hình 17 Hình 18 Hình 19 Hình 20 Hình 21 Hình 22 Hình 23 Hình 24 Hình 25 Hình 26 Hình 27 Hình 28 Hình 29 Kết điện di sản phẩm PCR locus Penta E một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus Penta E một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus D18S51 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus D18S51 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus D21S11 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus D21S11 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus TH01 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus TH01 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus D3S1358 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết điện di sản phẩm PCR locus D3S1358 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Kết chế tạo thang alen locus Penta E Kết chế tạo thang alen locus D18S51 Kết chế tạo thang alen locus D21S11 Kết chế tạo thang alen locus TH01 Kết chế tạo thang alen locus D3S1358 Kết chế tạo thang alen phức 05 locus Kết điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn chế tạo thang alen phức 05 locus Kết chế tạo thang alen phức 05 locus hệ Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích 39 39 40 40 41 41 42 42 43 43 47 48 48 49 49 50 51 52 53 54 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng thang alen thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 phục vụ giám định Mục tiêu đề tài là chế tạo đƣợc thang alen thị gắn huỳnh. .. (PCR mix cho locus nhiều locus phản ứng) - Thang thị alen (allelic ladder) bao gồm toàn bợ alen locus cần phân tích Thang alen thị để định danh alen điện di Trình tự mồi và thang thị alen tḥc... NGHIÊN CƢ́U XÂY DƢ̣NG THANG ALEN CHỈ THI ̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH Chuyên ngành: Di truyề n ho ̣c Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN