(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƢỢU VANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƢỢU VANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trƣơng Hƣơng Lan GS.TS Phạm Văn Ty Hà Nội – 2014 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong triǹ h thực tập tốt nghiệp hoàn thành luận văn , nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trương Hương Lan Chủ nhiệm môn thực phẩm dinh dưỡng - Viện Cơng nghiệp thực phẩm, người ln tận tình hướng dẫn, bảo cặn kẽ cho suốt q trình thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Đặc biệt, tơi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Văn Ty - Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thầy hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể cán bộ, nhân viên Phòng Thực phẩm dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn chân thành tới thầy giáo, cô giáo, Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội bảo, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân bên tôi, tạo điều kiện vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Đình Dũng TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung rƣợu vang .3 1.1.1 Vài nét rượu vang 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 1.2 Vi khuẩn lactic 1.2.1 Phân loại kiểu hình vi khuẩn lactic rượu vang .10 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni .11 1.3 Quá trình lên men malolactic .12 1.3.1 Bản chất trình lên men malolactic 12 1.3.2 Vai trị q trình lên men malolactic 14 1.3.3 Ảnh hưởng trình lên men malolactic đến thành phần chất lượng rượu vang 15 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện trình lên men malolactic 18 1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 18 1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hố axít malic .19 1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza sản xuất vang .20 1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic khả ứng dụng để nâng cao chất lƣợng rƣợu vang 21 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh hóa chất .25 2.1.1 Nguyên liệu .25 2.1.2 Vi sinh vật 25 2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật .25 2.1.4 Hóa chất 26 2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 2.2.1 Phương pháp công nghệ 26 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 27 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa 28 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang 31 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn malolactic Ninh Thuận 31 3.1.2 Xác định khả lên men malolactic chủng vi khuẩn phân lập 33 3.1.3 Xác định khả chịu SO2 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được36 3.2 Nghiên cứu trình lên men malolactic Chủng NT9 Chủng NT12 môi trƣờng rƣợu vang non .37 3.3 Nghiên cứu khả tạo chất thơm chủng vi khuẩn malolactic 42 3.4 Nghiên cứu xác định điều kiện tối ƣu trình lên men malolactic O.oeni NT12 44 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất dinh dưỡng bổ sung đến trình lên men malolactic 44 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic 47 3.4.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân tích rượu vang đỏ trước sau lên men malolactic 15 Bảng 3.1 Đặc tính sinh lý chủng vi khuẩn lactic phân lập 31 Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất chủng vi khuân lactic phân lập 34 Bảng 3.3 Khả lên men malolactic chủng vi khuẩn phân lập 35 Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic axít lactic trước sau lên men Malolactic mơi trường nước nho axít (AG) sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5 bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v 37 Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non 38 Bảng 3.6 Hàm lượng axít lactic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non 39 Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic .40 Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic 41 Bảng 3.9 Một số chất bay tạo thành sau trình lên men malolactic 02 chủng .43 Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau lên men rượu 45 Bảng 3.11 Hàm lượng axít malic (g/l) phân giải q trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác theo thời gian .46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic q trình lên men malolactic 48 Bảng 3.13 Thành phần rượu vang sau kết thúc trình lên men malolactic .49 Bảng 3.14 Thời gian lên men hàm lượng axít malic, axít lactic sau q trình lên men malolactic thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác 51 Bảng 3.15 Rượu etanol tạo thành hàm lượng đường sót sau trình lên men malolactic 52 Bảng 3.16 Sự tạo thành số chất bay tạo thành sau trình lên men malolactic 53 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng chuỗi chủng O.oeni .10 Hình 1.2 Quá trình trao đổi chất vi khuẩn lactic lên men dị hình .13 Hình 1.3 Cơ chế trình lên men malolactic 133 Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men malolactic 17 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu nho 27 Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non 38 Hình 3.2 So sánh hàm lượng axít lactic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non 39 Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic 41 Hình 3.4 So sánh hàm lượng diaxetyl trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic 42 Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau trình lên men malolactic chủng 43 Hình 3.6 Hàm lượng axít malic phân giải q trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác theo thời gian 46 Hình 3.7 So sánh tạo thành rượu etanol sau trình lên men malolactic 52 Hình 3.8 So sánh tạo thành số chất bay sau trình lên men malolactic 53 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AG Acid Grape - Nước nho axít CoA Coenzyme A CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS NAD+ Nicotinamit Adenin Dinucleotide NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen EO Chế phẩm Essential oenos OD Optical density - Mật độ quang MLF Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Rượu vang đồ uống có cồn sản xuất từ q trình lên men dịch nói chung mà phổ biến từ nho Do nho loại có thành phần hố học thích hợp cho nấm men phát triển có hương thơm đáp ứng yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất lượng cao Trải qua lịch sử hình thành phát triển lâu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v đồ uống có lợi cho sức khỏe người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon ưa chuộng khắp nơi giới Từ nhiều năm nay, rượu vang nho trở thành thức uống phổ biến nước ta Thị trường rượu vang nước phát triển, nhiên chưa đáp ứng yêu cầu chất lượng Theo số liệu Tổng cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập tăng khoảng 25%/ năm Trong đó, Ninh Thuận biết đến vùng trồng nho có sản lượng lớn nước, trồng chủ yếu giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi để lên men rượu cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn Do vậy, chất lượng rượu vang Việt Nam chưa thật cao so sánh với rượu vang nhập hương vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng cặn…Với tiềm thị trường lớn nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản xuất rượu vang nho vấn đề quan tâm Nhiều nước giới giải vấn đề nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất rượu vang nho sâu làm rõ chế như: chuyển hóa thành phần nho thành chất thơm rượu vang, tác động điều kiện môi trường đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn malolactic trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu vang trình lên men thực chủ yếu nhờ nấm men phần vi khuẩn lactic có mặt nho thiết bị làm rượu Nấm men sử dụng hệ enzym để chuyển hóa glucoza số đường khác thành rượu sản phẩm phụ khác (rượu bậc cao, este, axít hữu ), vi khuẩn lactic chuyển hóa axít malic thành axít lactic CO2 q trình lên men malolactic Lên men malolactic đóng vai trị quan trọng sản xuất rượu vang đỏ số loại vang TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com trắng, q trình khơng thể thiếu việc làm biến đổi thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang hương vị đặc trưng Với điều kiện, công nghệ sản xuất rượu vang Việt Nam nay, việc phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa q trình lên men malolactic cần thiết Điều giúp nhà sản xuất rượu vang kiểm sốt q trình sản xuất rượu vang tốt hơn, giảm rủi ro tạo sản phẩm hỏng có chất lượng khơng ổn định, đồng thời làm đa dạng chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Từ mở hướng nghiên cứu cho cơng nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao Việt Nam giải vấn đề thực tiễn ngành sản xuất rượu vang nước.Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic ứng dụng công nghệ sản xuất rượu vang” TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 3.11 Hàm lƣợng axít malic (g/l) đƣợc phân giải q trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác theo thời gian Ngày 10 15 20 25 g/l 2,15 1,8 1,6 1,2 0,8 0,55 0,025 g/l 2,15 1,7 1,4 0,12 0,1 0,05 g/l 2,15 1,6 1,3 0,9 0,12 0,1 0,075 g/l 2,15 1,5 1,25 0,86 0,12 0,1 Nồng độ EO Ghi chú: Mẫu mẫu đối chứng khơng bổ sung Essentials Oenos Mẫu có bổ sung Essentials Oenos (EO) Hình 3.6 Hàm lƣợng axít malic đƣợc phân giải q trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác theo thời gian Kết minh họa bảng 3.11 hình 3.6 cho thấy có khác biệt rõ ràng mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos mẫu thí nghiệm bổ sung Essentials Oenos khả phân giải axít malic thời gian lên men Ớ mẫu đối chứng, điều kiện dịch vang non không bổ sung dinh dưỡng, hàm 46 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com lượng axít malic ngày thứ 25 cịn 0,55 g/l, chứng tỏ q trình lên men malolactic chưa hồn thành Tiếp tục cho mẫu lên men ngày hàm lượng axít malic giảm xuống không đáng kể, 0,52 g/l (số liệu không trình bày) Trong đó, mẫu bổ sung Essentials Oenos, trình lên men malolactic kết thúc 20 ngày, với hàm lượng axít malic cịn lại thấp, 0,12 g/l Sự khác mẫu thể hai mẫu có nồng độ Essentials Oenos cao (0,05 0,075 g/l) khởi động vi khuẩn lactic ngày đầu nhanh phải cần đến 20 ngày phân giải axít malic gần cạn kiệt (0,12 g/l) Vì vậy, lựa chọn nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic Theo Henick - Kling nhiều tác giả, trình lên men malolactic khơng đơn q trình chuyển axít malic thành axít lactic mà cịn có ảnh hưởng lớn đển chất lượng cảm quan rượu vang Chất lượng cảm quan rượu cao hay thấp khơng phụ thuộc vào q trình lên men rượu mà phụ thuộc nhiều vào trình lên men malolactic, phải kể đến yếu tố chủng vi khuấn lựa chọn, điều kiện trình lên men [33] Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tiến trình lên men malolactic Tiến hành thí nghiệm với mẫu lên men malolactic bổ sung vi khuẩn lactic điều kiện nhiệt độ khác Kết thời gian lên men malolactic hình thành số tính chất quan trọng rượu vang trình bày bảng 3.12 Kết bảng 3.12 cho thấy lên men malolactic nhiệt độ 15°C khơng phù hợp sau 45 ngày lên men, hàm lượng axít malic cịn lại nhiều rượu vang (1,45 g/l) Số lượng quần thể vi khuẩn malolactic đạt từ đầu trình lên men có ý nghĩa quan trọng lên men malolactic Nhiệt độ thấp 15°C không thúc đẩy phát triển vi khuẩn không đủ sinh khối tạo enzym chuyển hóa axít malic thành axít lactic 47 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic q trình lên men malolactic Nhiệt độ lên men (0C) Axit malic (g/1) Axit lactic (g/1) Axít bay (g/1) axít axetic) Thời gian lên men malolactic (ngày) 15 1,45 0,92 0,28 45 20 0,12 1,80 0,30 23 25 0,12 1,81 0,35 20 30 0,11 1,82 0,46 19 Từ bảng 3.12 cho thấy tất mẫu lên men từ 20 - 30°C có khả chuyển hố axít malic thành axít lactic tương đối triệt để, khác thời gian lên men malolactic Điểm khác biệt lớn lên men 20, 25 30°C thời gian lên men malolactic nhanh ngày Tuy nhiên, khác biệt hình thành axít bay lại lớn mẫu Lên men nhiệt độ 20°C cho hàm lượng axít bay thấp (0,30 g/1) nhiệt độ 30°C, hàm lượng axít 0,46 g/1 Mặc dù lên men malolactic nhiệt độ thấp 20°C làm chậm thời gian so với 25°C ngày rõ ràng axít malic chuyển hóa triệt để, hàm lượng axít bay tạo lại giảm nhiều Chỉ tiêu axít bay biểu thị mạnh mẽ độ giảm chất lượng rượu vang Mặt khác, theo nhiều nghiên cứu, lên men nhiệt độ thấp làm giảm nguy bị nhiễm Do vậy, nhiệt độ trình lên men malolactic chọn 20°C Tiến hành lên men malolactic điều kiện nhiệt độ 20°C, có bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, sau xác định thành phần rượu vang kết trình bày bảng 3.13 Kết bảng 3.13 cho thấy rõ ràng hàm lượng axít tổng số giảm đi, hàm lượng axít bay tăng lên khơng nhiều, axít malic axít lactic hai thành phần bị thay đổi nhiều nhất, dư lượng axít malic cịn lại dịch lên men khơng đáng kể hàm lượng axít lactic lại tăng lên đến 1,78 g/1 Điều góp 48 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com phần quan trọng vào tính chất cảm quan sản phẩm, làm rượu trở nên mềm mại ổn định Bảng 3.13 Thành phần rƣợu vang sau kết thúc trình lên men malolactic Trƣớc lên men malolactic Sau lên men malolactic Etanol (%v/v) 12,8 12,3 Axít tổng số (g/1 H2SO4) 5,39 4,9 Axít bay (g/1 axít axetic) 0,23 0,28 Axít malic (g/1) 2,04 0,12 Axít lactic (g/1) 0,45 1,78 pH 3,4 3,5 Thành phần Từ kết thu được, đưa kết luận sau Quá trình lên men malolactic chủng môi trường rượu vang non đạt hiệu cao với hàm lượng axít malic cịn lại 0,12 g/1 điều kiện bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, nhiệt độ lên men 20°C thời gian lên men 23 ngày 3.4.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang Theo Henick-Kling nhiều tác giả, q trình lên men malolactic khơng đơn q trình chuyển axít malic thành axít lactic mà cịn có ảnh hưởng lớn đến chất lượng cảm quan rượu vang Chất lượng cảm quan rượu cao hay thấp khơng phụ thuộc vào q trình lên men rượu mà phụ thuộc nhiều vào trinh lên men nialolactic, phải kể đến yếu tố chủng vi khuẩn lựa chọn, điều kiện trình lên men [33] Để trình lên men malolactic thành cơng, thời điểm xác để bổ sung vi khuẩn lactic quan trọng Xung quanh vấn đề có nhiều quan điểm cịn tranh cãi Các ý kiến tán thành cho việc bổ sung vi khuẩn lactic đầu trình lên men rượu cho vi khuẩn phát triển tốt với nguồn dinh dưỡng dồi điều cho 49 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com phép trình lên men malolactic kết thúc trước trình lên men rượu (Beelman, 1982, 1985) Tuy nhiên, Gallander Lafon-Lafourcade lại báo cáo vi khuẩn phát triển chậm sir khử axít malic trở nên tương tác nấm men Sự cấy vi khuẩn lactic vào giai đoạn kết thúc trình lên men cồn có bất lợi như: mơi trường dinh dưỡng cạn kiệt, hàm lượng rượu etanol cao Cả hai điều kiện làm chậm trễ trình lên men malolactic (Lafon-Lafourcade, 1983) Một quan điểm khác tán thành việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điêm lên men rượu phần với lý vi khuẩn vừa tận dụng nguồn dinh dưỡng môi trường mà khơng ảnh hưởng đến tiến trình lên men rượu (Fornairon, 2001) Thí nghiệm trình bày kết trình lên men mallolactic thực với thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Quá trình lên men thực mục 2.2.1 nho sau nghiền xử lý với K2S2O5 enzym Pectinex, lên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn lactic J cho vào thời điểm trước, sau trình lên men rượu, cụ thể: Mẫu F: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic đầu trình lên men rượu Mẫu M: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic trình lên men rượu 48h Mẫu E: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic trình lên men rượu vừa kết thúc Mẫu ĐC: Lên men MLF tự phát, khơng bổ sung malolactic Q trình lên men malolacti thực điều kiện nhiệt độ 20°C Kết chuyển hố axít Malic thời gian lên men malolactic trình bày bảng 3.14 50 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 3.14 Thời gian lên men hàm lƣợng axít malic, axít lactic sau trình lên men malolactic thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Mẫu Axít malic (g/1) Axít lactic (g/1) Thời gian lên men (ngày) ĐC 0,10 1,64 23 F 0,09 1,68 14 M 0,09 1,66 12 E 0,09 1,69 14 Kết bảng 3.14 cho thấy: Khả phân giải axít malic - Mẫu ĐC hàm lượng axít malic cịn dư dịch lên men cao (0,10 g/l) - Mẫu F, M, E hàm lượng axít malic cịn dư dịch lên men lại (0,09 g/l) Khả tạo Axít lactic - Mẫu ĐC hàm lượng axít lactic cịn dư dịch lên men thấp (1,64 g/l) - Mẫu M hàm lượng axít lactic cịn dư dịch lên men (1,66 g/l) - Mẫu F hàm lượng axít lactic cịn dư dịch lên men cịn (1,68 g/l) - Mẫu E hàm lượng axít lactic dư dịch lên men cao (1,69 g/l) Mẫu đối chứng (ĐC) lên men tự phát có thời gian lên men malolactic dài tất mẫu nghiên cứu Sau trình lên men rượu kết thúc, đến ngày thứ tám, trình lên men malolactic bắt đầu kết thúc vào thời điểm 16 ngày sau Tổng q trình lên men malolactic 23 ngày Mẫu M, bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% có thời gian lên men malolactic nhanh nhất, 12 ngày sau kết thúc trình lên men rượu mẫu phù hợp 51 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Mẫu E, bổ sung vi khuẩn lactic vào giai đoạn cuối trình lên men rượu có thời gian lên men malolactic 14 ngày Tuy nhiên, bổ sung lactic giai đoạn khác q trình lên men rượu nên có tương tác nấm men vi khuẩn, ảnh hưởng đến trình lên men rượu, đặc biệt đến tạo thành etanol hàm lượng đường sót, ảnh hưởng trình bày bảng 3.15 hình 3.7 Bảng 3.15 Rƣợu etanol đƣợc tạo thành hàm lƣợng đƣờng sót sau q trình lên men malolactic Mẫu Etanol (%v/v) Đƣờng sót (g/1) ĐC 12,8 5,9 F 12,1 7,2 M 12,9 5,9 E 12,8 5,9 Hình 3.7 So sánh tạo thành rƣợu etanol sau trình lên men malolactic Kết quả, bảng 3.15 hình 3.7 cho thấy mẫu bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điểm đầu trình lên men rượu khiến cho trình lên men cồn thực 52 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com khơng hồn tồn, thể hàm lượng đường sót cịn tương đối cao (7,2 g/1), hàm lượng cồn tạo thành tương đối thấp Tuy nhiên, hàm lượng cồn thấp mẫu vi khuẩn lactic tiêu thụ phần đường để lên men Mẫu bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h lên men (mẫu M) có hàm lượng cồn tạo hàm lượng đường sót tương tự mẫu lên men cồn mà tham gia vi khuẩn lactic (mẫu ĐC mẫu E) Việc bổ sung lactic giai đoạn khác trình lên men rượu nên có tương tác nấm men vi khuẩn, ảnh hưởng đến trình lên men rượu, ảnh hưởng đến tạo thành chất bay hơi, ảnh hưởng trình bày bảng 3.15 hình 3.8 Bảng 3.16 Sự tạo thành số chất bay đƣợc tạo thành sau trình lên men malolactic Mẫu ĐC F M E Axít bay (g/1) 0,47 0,42 0,26 0,43 Hình 3.8 So sánh tạo thành số chất bay sau trình lên men malolactic 53 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Kết bảng 3.16 hình 3.8 cho thấy trình lên men malolactic tự phát tạo hàm lượng axít bay cao (0,47 g/1) Ở mẫu cấy vi khuẩn lactic sau 48 h hàm lượng axít bay giảm đáng kể (0,26 g/1) Ở hai mẫu lại, cấy vi khuẩn lactic vào giai đoạn đầu cuối trình lên men rượu hàm lượng axít bay tạo trung bình, 0,41 0,43 g/1 tương ứng Các axít bay yếu tố tiêu cực rượu, hàm lượng, rượu vang tăng lên chứng tỏ chất lượng rượu vang giảm Đã xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic cho chủng NT 12 môi trường rượu vang non quy trình sản xuất rượu vang đỏ: Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic.Nhiệt độ lên men 200C Thời gian lên men 23 ngày Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% 54 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Từ kết thu được, rút số kết luận sau đây: Từ 20 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ vùng trồng nho Ninh Thuận, chủng có khả chuyển hóa axit malic thành axit lactic Tuyển chọn chủng NT12 có khả phân giải malolactic tốt hàm lượng axít malic dư dịch sau lên men malolactic 0,12 g/l Đã xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic cho chủng NT12 mơi trường rượu vang non quy trình sản xuất rượu vang đỏ: - Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic - Nhiệt độ lên men 200C - Thời gian lên men 23 ngày - Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định thêm số điều kiện tối ưu cho chủng NT 12 để ứng dụng sản xuất thử nghiệm rượu vang đỏ chất lượng cao Việt Nam 55 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2005), Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Lê Đình Hùng, Trần Thị Minh Hà, Ngơ Anh Tuấn, Yoshihiro Komiyama (2007), Nghiên cứu ứng dụng SO2 nâng cao độ ổn định chất lượng rượu vang trình bảo quản, Tạp chí Cơng nghiệp, Bộ Cơng nghiệp, số 3/2007, tr.22-25 Lại Quốc Phong (2007), “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Oenococcus oeni cho lên men malolactic rượu vang đỏ”, Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học - công nghiệp thực phẩm giai đoạn 20012005, Nhà xuất Lao động-Xã hội, tr.196-202 Lê Thị Liên Thanh (1997), Nghiên cứu số đặc tính sinh lí hóa sinh Leuconostoc oenos ứng dung sản xuất rượu vang, Luận án Tiến sĩ khoa học, Đại học Bách khoa Hà Nội Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Quang Hào (2003), Nghiên cứu hiệu sử dụng enzym chất phụ gia sản xuất vang Việt Nam chất lượng cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.569-572 Tiêu chuẩn Việt Nam (2002), Rượu vang - Quy định kỹ thuật, Trung tâm tiêu chuẩn Việt Nam TCVN:7045:2002 Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Trần Thị Minh Hà, Ngô Anh Tuấn, Taillandier Patricia, Lonvaud Aline (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu vang chất lượng cao Việt Nam Báo cáo tổng hợp, tr 12-24 56 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Tiếng Anh Amerine M.A and Cruess W.V (2003), The technology of wine making, The AVI Publishing Company Inc., Connecticut AOAC Oficial Method of Analyis (1995), 27, pp 2651-2659 10 Asmundson RV, Kelly WJ (2000), “The effect of temperature and etanol concentration on the growth of Leuconostoc oenos”, In: Williams PJ, Davidson D, Lee TH (Eds), Proceedings of the seventh Australian wine industry technical conference, 14-16 August 1989, Adelaide, S.A Winetitles, pp 251-252 11 Bartowsky E.J., and Henschke P.A., (2004), “The “buttery” attribute of winediacetyl- desirability, spoilage and beyond”, Int J Food Microbiol., 96, pp 235-252 12 Boutlton R.B., V.L Singleton, L.F Bisson, and R.E Kunkee (2006), “Malolactic fermentation”, In: Principles and practices of winemaking, Chapman & Hall, Aspen Publishers, Maryland 13 Britz TJ, Tracey RP (1990), “The combination effect of pH, S02, etanol and temperature on the growth of Leuconostoc oenos”, J Appl Bacteriol., 68, pp 23-31 14 Carreté R, Teresa Vidal M, Bordons A, Constanti M (2002), “Inhibitory effect of sulphur dioxide and other stressvcompounds in wine on the ATPase activity of Oenococcus oeni”, FEMS Microbiol Lett 211, pp.155-159 15 Collin C.H., Lyne M., Grange J.M (1989), Microbiological methods, Sixth Edition, Butterworth and Co (Publishers) Ltd London, pp.169- 233 16 Chu-Ky s, Tourdot-Marechal R, Marechal PA, Guzzo J (2005), “Combined cold, acid, etanol shocks in Oenococcus ami: Effects on membrane fluidity and cell viability”, Biochimica et Biophysica Acta.,1717, pp.118-124 17 Davis C.R., D Wibowo, T.H Eschenbruch, and G.H Fleet (1985), “Practical implications of malolactic fermentation: A review”, Am J Enol Vitic., 36, pp.290-301 18 Delore A., Kraeva B., Martin M., Hunter J.J (2005), “Sugar loading and 57 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com phenolic accumulation as affected by ripeness of Syrah R99 grapes”, Confference XIV International GESCO Viticulture Congress Geisenheim, Germany 23-27, August, 2005 19 Edwards CG, Beelman CE, McConnell AL (2000), “Production of decanoic acid and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinification”, Am J Enol Vitic 41, pp 48-56 20 European Brewing Convention (1999), “Dertermination of sulfite content in vin”, Analytical EBC Methods 9-12, pp 31-132 21 Garde-Cerdan T., Rodriguez-Mozaz S., and Ancin-Azpilicueta C., (2002), “Volatile composition of aged wine in used barrels French oak and of American oak”, Food Research International, 35, pp 603-610 22 Gerbaux C.V., Villa A., Monamy C., and Bertand A (1997), “Use of lysozyme to inhibit malolactic fermentation and stabilize wine after malolactic fermentation”, Am J Enol.Vitic., 48, pp 49-54 23 Graca Da Silveira M, Golovina EA, Hoekstra FA, Rombouts FM, Abee T (2003), “Membrane fluidity adjustments In etanol-stressed Oenococcus oeni cells”, Appl Environ Microbiol 69, pp 5826-5832 24 Guzzo J, Jobin MP (1998), “Increase of sulphite tolerance in Oenococcus oeni by means of acidic adaptation”, FEMS Microbiol Lett 160, pp 43-47 25 Gvilang H, Winge M, Korch c (1998), “Regulation of S02 formation during fermentation”, European Brewery convention In: Proceedings of the 22nd Congress, Zurich, pp 347-354 26 Henick-Kling T (2005), “pH and regulation of malolactic activity in Leuconostoc oenos”, In: Actualités Orelogiques 89 Comptes rendus du 4e Symposium International d’Oenologie (Bordeaux, 1989), 320-325, Institut d’OEnologie Université de BordeauxDun.od, Paris 27 Henick-Kling T (2003), “Phage infection of malolactic fermentation”, In: Lee T H., (Ed) Malolactic fermentation Pro Semina, 16 August 1984, Melbourne The Australian Wine Research Institute, Glen Osmond, South Australia, pp 58 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 128-143 28 Henick-Kling T (2007), “Malolactic fermentation”, In: Fleet G H., (Ed) Wine microbiology and biotechnology, Harwood Academic Publishers, pp 289-326 29 Henick-Kling T., and Park H Y (1994), “Considerations for the use of yeast and bacterial starter cultures: SO2 and timing of inoculation”, Am J Enol Vitic., 45, pp 464-469 30 Holm, E.H., Nissen, P (2003), “Red wine extract creates long-life fruit”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 18, pp 728-824 31 Jackson R.S (1994) Wine Science, Principles and Applications, Academic Press, San Diego 32 Laurent M H., T Henick and T E Acree (2004), “Changes in the aroma and odour of Chadonnay wine due to malolactic fermentation”, Vitic Enol Sci., 49, pp.3-10 33 Liu S.-Q (2002), “Malolactic fermentation in wine - beyond acidification”, J Appl.Microbiol., 92, pp 589-601 34 Liu JWR and Gallander J.F (2001), “Effect of pH and sulphur dioxide on the rate of malolactic fermentation in red table wines”, Am J Enol Vitic., 34, pp 44-46 35 Lonvaud-Funel A, Joyeux A, Dessens c (2001), “Inhibition of malolactic fermentation of wines by products of yeast metabolism”, J Sci Food A OTIC.,44, pp 183-191 36 Nelson Somogy, (1992), “Dertemination of ruducing surgar in beer”, J Biol Chem., 25, pp 151-255 37 Nielsen J C., and M Richekieu, (1999), “Control of flavour development in wine during and after malolactic fermentation”, Appl Environ Microbiol., 65, pp 470- 475 38 P Ribéreau-Gayon, Y Glories, A Maujean and D Dubourdieu (2000), “Handbook of Enology”, Volume 2: The chemistry of wine and stabilization and treatments, John Wiley & Sons Ltd, pp 43 59 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 39 Ramos A A., J S Lolkema, W N Konings, and H Santos (1995), “Enzymebasis for pH regulation of citrate and pyruvat metabolism by Leuconostoc oenos”, Appl Environ Microbiol., 61, pp 1303-1310 40 Rapp A., Mandery H., (1986), “Wine aroma”, Experientia, 42, pp 873-884 41 Ribéreau-Gayon J., Peynaud E., Sudraud P and Ribéreau-Gayon P ,(1982), “Sciences et Techniques du Vin” , Vol 1: Analyse et Contrôle du Vin, 2nd edn Dunod, Paris 42 Romano P., Suzzi G., Domizio P and Fatichenti F (1997), “Secondary products formation as a tool for discrimination non-Saccharomyces wine strains”, Antonie van Leeuwenhoek, 71, pp 239-242 43 Swiegers J.H and Pretorius I.S (2005), “Yeast modulation of wine flavor”, Adv Appl Microbiol., 57, pp 131-175 44 Todd B.E.N (1995), “Enhancing the sensory properties of wine using glycosidase activity of wine micro-organisms”, Aust Grapegrow Winemaker 382, pp 22-23 45 Van Vuuren, H J J., and L M T Dicks (1991), “Leuconostoc oenos: A review”, Am J Enol Vitic., 44, pp 99-112 46 Vaughan-Martini A and Martini A (1995), “Facts, myths and legends on the prime industrial microorganism”, J Indust Microbiol., 14, pp 514- 522 47 Wibowo D, Fleet GII.Lee TH, Eschenbrush RE (1988), “Factors affecting the induction of malolactic fermentation in red wines with Leuconostoc oenos”, J Appl Bacteriol 64, pp 421-428 48 Zoecklein B W., Fugelsang K C., Gump B H., Nury F S (1989), “Sampling, fermentation, and production analysis”, In: Zoecklein B W., Fugelsang K C., Gump B H., Nury F S., (Eds), Production wine analysis Van Nostrand Reinhold, New York, pp 9-181 60 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƢỢU VANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI... hướng nghiên cứu cho công nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao Vi? ??t Nam giải vấn đề thực tiễn ngành sản xuất rượu vang nước.Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn. .. thuộc vào điều kiện môi trường [14] 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni Mặc dù có nhiều lồi vi khuẩn malolactic sử dụng sản xuất rượu vang O oeni loài vi khuẩn lựa chọn đa số nhà sản xuất rượu vang