của 02 chủng Tên chủng Axít axetic (mg/L) Axít axetolactic (mg/L) Diaxetyl (mg/L) 2,3 Butanediol (mg/L) Trƣớc MLF Sau MLF Trƣớc MLF Sau MLF Trƣớc MLF Sau MLF Trƣớc MLF Sau MLF NT9 216 405 1,15 1,48 0,21 0,25 234 345 NT12 221 251 1,17 1,78 0,32 0,31 231 415
Hình 3.5 So sánh hàm lƣợng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng
chủng tạo ra nhiều axít bay hơi axêtic khơng mong muốn (405mg/L), Chủng NT12 là chủng tạo ra nhiều cấc chất bay hơi mong muốn như axít axêtolactic là 1,78mg/L, diaxêlyl là 0,32mg/L và 2,3 butanediol là 415 mg/L). Theo Jan Clair Nielsen và Marianne Richelieu, 1999, trong nghiên cứu kiểm soát sự phát triển của hương thơm rượu vang trong và sau quá trình lên men malolactic bởi O.oeni đã cho thấy
hàm lượng các chất thơm của rượu vang như axít axetic là 320g/L, axít axctolactic là 1,8mg/L, diaxetyl chỉ là 0,07mg/L và 2,3 butandiol là 420mg/L [37]. Diaxetyl là một trong những chất bay hơi quan trọng nhất cua lên men malolactic. Diaxetyl tạo ra cho rượu vang mùi thơm đặc trưng của bơ hoặc lạc. Trong quá trình lên men malolactic, axít axetolactic, diaxetyl và axetoin đều là sản phẩm trung gian của sự phân huỷ axít citric thành 2,3 butandiol. Các tác giả này cũng cho thấy hàm lượng axít L-malic và citric của rượu vang sau q trình lên men malolactic tương ứng là 0,01g/L và l0 mg/L. Trước đó, Martineau và cộng sự, 1995, đã chỉ ra rằng ngưỡng cảm nhận được mùi thơm của diaxetyl thay đổi từ 0,2mg/L trong rượu vang Chardonnay tới 0,9mg/L trong rượu vang Pinot noir và 2,8mg/L trong rượu vang Cabemet Sauvignon.
Từ các nhận xét trên chúng tôi chọn Chủng NT12 cho các nghiên cứu tiếp theo vì Chủng NT12 có 1 số đặc tính sau.
- Khả năng chịu SO2 là tốt nhất trong các chủng phân lập được: K2S2O5 100mg/l - Khả năng lên men malolactic trên môi trường rượu vang non là tốt nhất trong các chủng phân lập được.
- Khả năng tạo chất thơm tốt nhất trong trong các chủng phân lập được.
3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic
O.oeni NT12
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic malolactic
Tính chất của rượu vang non được trình bày trong bảng 3.10 như 2.2.1 syrô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khơ 250Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá trình này
Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rƣợu
TT Thành phần Đơn vị Hàm lƣợng
1 Etanol % v/v 12,8
2 pH 3,4
3 Axít tổng số g/l H2SO4 5,39
4 Axít bay hơi (axít axetic) g/l 0,23
5 Đường sót g/l 5,2
6 Tỷ trọng 0,981
7 SO2 tổng số g/l 35
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, kết thúc quá trình lên men rượu, thành phần các chất dinh dưỡng trong mơi trường rất nghèo nàn, chứng tỏ q trình lên men kiệt. Đối với vi khuẩn lactic, các yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hiệu quả và tốc độ của quá trình lên men là pH, nồng độ etanol, nồng độ SO2 và nhiệt độ. Các yếu tố này không chỉ tác động riêng rẽ mà cịn có tác động hiệp lực. Chủng NT12 có khả năng lên men được trên môi trường rượu vang non như ở mục 2.2.1 từ chủng nấm men S. cerevisiae SH09 khơng chỉ có nồng độ ethanol và SO2 cao mà pH cịn rất thấp (3,4). Ngồi ra trong dịch rượu vang cịn rất nghèo dinh dưỡng (đường sót 5,2 g/l), hàm lượng axít tổng số cao đáng kể (5,39 g/l H2SO4). Dưới điều kiện lên men khắc nghiệt như vậy, việc bổ sung các chất dinh dưỡng vào dịch lên men giúp cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn lactic là rất cần thiết vì vi khuẩn lactic không thể dự trữ hoặc tổng hợp được tất cả các axít amin quan trọng. Để làm rõ tác dụng này, thí nghiệm đã được tiến hành lên men malolactic trên 3 mẫu sử dụng chất dinh dưỡng bổ sung (chế phẩm Essentials Oenos) và 01 mẫu đối chứng. Nhiệt độ lên men được ổn định ở 25oC. Kết quả phân giải axít malic sau q trình lên men malolactic ở các mẫu được minh họa ở bảng 3.11 và hình 3.6
Bảng 3.11 Hàm lƣợng axít malic (g/l) đƣợc phân giải trong q trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác nhau theo thời gian
Ngày Nồng độ EO 0 5 10 15 20 25 0 g/l 2,15 1,8 1,6 1,2 0,8 0,55 0,025 g/l 2,15 1,7 1,4 1 0,12 0,1 0,05 g/l 2,15 1,6 1,3 0,9 0,12 0,1 0,075 g/l 2,15 1,5 1,25 0,86 0,12 0,1
Ghi chú: Mẫu 0 mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos Mẫu có bổ sung Essentials Oenos (EO)
Hình 3.6 Hàm lƣợng axít malic đƣợc phân giải trong q trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác nhau theo thời gian.
Kết quả minh họa ở bảng 3.11 và hình 3.6 cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos và các mẫu thí nghiệm bổ sung Essentials Oenos về cả khả năng phân giải axít malic và thời gian lên men. Ớ
lượng axít malic ở ngày thứ 25 vẫn còn là 0,55 g/l, chứng tỏ quá trình lên men malolactic chưa hoàn thành. Tiếp tục cho mẫu này lên men trong 3 ngày tiếp theo nhưng hàm lượng axít malic giảm xuống không đáng kể, chỉ là 0,52 g/l (số liệu khơng trình bày). Trong khi đó, ở cả 3 mẫu bổ sung Essentials Oenos, quá trình lên men malolactic đều kết thúc ở 20 ngày, với hàm lượng axít malic còn lại rất thấp, là 0,12 g/l. Sự khác nhau giữa 3 mẫu này chỉ thể hiện là ở hai mẫu có nồng độ Essentials Oenos cao hơn (0,05 và 0,075 g/l) thì sự khởi động của vi khuẩn lactic trong những ngày đầu nhanh hơn nhưng cũng phải cần đến 20 ngày thì sự phân giải axít malic mới gần như cạn kiệt (0,12 g/l). Vì vậy, có thể lựa chọn nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là 0,025 g/l để bổ sung cho quá trình lên men malolactic.
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic
Theo Henick - Kling và nhiều tác giả, q trình lên men malolactic khơng chỉ đơn thuần là một q trình chuyển axít malic thành axít lactic mà nó cịn có ảnh hưởng lớn đển chất lượng cảm quan của rượu vang. Chất lượng cảm quan của rượu cao hay thấp không chỉ phụ thuộc vào quá trình lên men rượu mà phụ thuộc rất nhiều vào q trình lên men malolactic, trong đó phải kể đến các yếu tố chủng vi khuấn lựa chọn, điều kiện của quá trình lên men [33]. Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tiến trình lên men malolactic. Tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu lên men malolactic bổ sung vi khuẩn lactic tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả về thời gian lên men malolactic cũng như sự hình thành một số tính chất quan trọng của rượu vang được trình bày ở bảng 3.12
Kết quả bảng 3.12 cho thấy lên men malolactic ở nhiệt độ 15°C là không phù hợp bởi vì sau 45 ngày lên men, hàm lượng axít malic còn lại khá nhiều ở rượu vang (1,45 g/l). Số lượng quần thể vi khuẩn malolactic đạt được ngay từ đầu quá trình lên men có ý nghĩa quan trọng đối với lên men malolactic. Nhiệt độ thấp 15°C đã không thúc đẩy được sự phát triển của vi khuẩn và do vậy không đủ sinh khối tạo enzym chuyển hóa axít malic thành axít lactic.
Bảng 3.12 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trong q trình lên men malolactic
Nhiệt độ lên men (0C) Axit malic (g/1) Axit lactic (g/1)
Axít bay hơi (g/1) axít
axetic)
Thời gian lên men malolactic (ngày) 15 1,45 0,92 0,28 45 20 0,12 1,80 0,30 23 25 0,12 1,81 0,35 20 30 0,11 1,82 0,46 19
Từ bảng 3.12 cho thấy ở tất cả các mẫu lên men từ 20 - 30°C đều có khả năng chuyển hố axít malic thành axít lactic tương đối triệt để, chỉ khác nhau về thời gian lên men malolactic. Điểm khác biệt lớn nhất giữa lên men ở 20, 25 và 30°C là thời gian lên men malolactic nhanh hơn được 2 ngày. Tuy nhiên, sự khác biệt về hình thành các axít bay hơi và lại khá lớn ở 3 mẫu này. Lên men ở nhiệt độ 20°C cho hàm lượng axít bay hơi thấp nhất (0,30 g/1) nhưng ở nhiệt độ 30°C, hàm lượng axít là 0,46 g/1. Mặc dù lên men malolactic ở nhiệt độ thấp 20°C làm chậm thời gian so với 25°C là 2 ngày nhưng rõ ràng là axít malic vẫn được chuyển hóa triệt để, hàm lượng axít bay hơi tạo ra lại giảm hơn nhiều. Chỉ tiêu axít bay hơi biểu thị mạnh mẽ độ giảm chất lượng của rượu vang. Mặt khác, theo nhiều nghiên cứu, lên men ở nhiệt độ thấp còn làm giảm nguy cơ bị nhiễm. Do vậy, nhiệt độ của quá trình lên men malolactic được chọn là 20°C.
Tiến hành lên men malolactic ở điều kiện nhiệt độ 20°C, có bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, sau đó xác định thành phần của rượu vang kết quả được trình bày ở bảng 3.13
Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy rõ ràng là hàm lượng axít tổng số giảm đi, hàm lượng axít bay hơi tăng lên nhưng khơng nhiều, axít malic và axít lactic là hai thành phần bị thay đổi nhiều nhất, dư lượng của axít malic cịn lại trong dịch lên men là khơng đáng kể nhưng hàm lượng axít lactic lại tăng lên đến 1,78 g/1. Điều này góp
phần quan trọng vào tính chất cảm quan của sản phẩm, làm rượu trở nên mềm mại và ổn định hơn.
Bảng 3.13 Thành phần của rƣợu vang sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic
Thành phần Trƣớc lên men
malolactic
Sau lên men malolactic
Etanol (%v/v) 12,8 12,3
Axít tổng số (g/1 H2SO4) 5,39 4,9
Axít bay hơi (g/1 axít axetic) 0,23 0,28
Axít malic (g/1) 2,04 0,12
Axít lactic (g/1) 0,45 1,78
pH 3,4 3,5
Từ những kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận sau
Quá trình lên men malolactic của chủng trên mơi trường rượu vang non đạt hiệu quả cao nhất với hàm lượng axít malic chỉ cịn lại 0,12 g/1 ở điều kiện bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, nhiệt độ lên men 20°C và thời gian lên men là 23 ngày.
3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang
Theo Henick-Kling và nhiều tác giả, quá trình lên men malolactic khơng chỉ đơn thuần là một quá trình chuyển axít malic thành axít lactic mà nó cịn có ảnh hưởng lớn đến chất lượng cảm quan của rượu vang. Chất lượng cảm quan của rượu cao hay thấp không chỉ phụ thuộc vào quá trình lên men rượu mà phụ thuộc rất nhiều vào quá trinh lên men nialolactic, trong đó phải kể đến các yếu tố chủng vi khuẩn lựa chọn, điều kiện của quá trình lên men [33]. Để quá trình lên men malolactic thành cơng, thời điểm chính xác để bổ sung vi khuẩn lactic là rất quan trọng. Xung quanh vấn đề này có nhiều quan điểm cịn tranh cãi. Các ý kiến tán thành cho việc bổ sung vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu cho rằng vi khuẩn có thể phát triển tốt với nguồn dinh dưỡng dồi dào và điều này có thể cho
phép quá trình lên men malolactic kết thúc trước quá trình lên men rượu (Beelman, 1982, 1985). Tuy nhiên, Gallander và Lafon-Lafourcade lại báo cáo rằng vi khuẩn phát triển chậm hơn và sir khử axít malic trở nên kém hơn do sự tương tác của nấm men. Sự cấy vi khuẩn lactic vào giai đoạn kết thúc q trình lên men cồn cũng có những bất lợi như: môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, hàm lượng rượu etanol cao. Cả hai điều kiện này làm chậm trễ quá trình lên men malolactic (Lafon-Lafourcade, 1983). Một quan điểm khác tán thành việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điêm khi lên men rượu đã được một phần với lý do là vi khuẩn vừa tận dụng được nguồn dinh dưỡng trong môi trường mà không ảnh hưởng đến tiến trình lên men rượu (Fornairon, 2001).
Thí nghiệm dưới đây trình bày các kết quả của quá trình lên men mallolactic được thực hiện với các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau. Quá trình lên men được thực hiện như ở mục 2.2.1 nho sau khi nghiền và xử lý với K2S2O5 và enzym Pectinex, được lên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn
lactic J được cho vào các thời điểm trước, giữa và sau quá trình lên men rượu, cụ thể: Mẫu F: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu. Mẫu M: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h. Mẫu E: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu vừa kết thúc.
Mẫu ĐC: Lên men MLF tự phát, khơng bổ sung malolactic.
Q trình lên men malolacti được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 20°C. Kết quả về sự chuyển hố axít Malic và thời gian lên men malolactic được trình bày trong bảng 3.14
Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lƣợng axít malic, axít lactic sau q trình lên men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau Mẫu Axít malic (g/1) Axít lactic (g/1) Thời gian lên men (ngày)
ĐC 0,10 1,64 23
F 0,09 1,68 14
M 0,09 1,66 12
E 0,09 1,69 14
Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy:
Khả năng phân giải axít malic
- Mẫu ĐC hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch lên men còn cao nhất (0,10 g/l).
- Mẫu F, M, E hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch lên men còn lại là (0,09 g/l).
Khả năng tạo ra Axít lactic
- Mẫu ĐC hàm lượng axít lactic còn dư trong dịch lên men còn thấp nhất (1,64 g/l).
- Mẫu M hàm lượng axít lactic cịn dư trong dịch lên men còn là (1,66 g/l). - Mẫu F hàm lượng axít lactic cịn dư trong dịch lên men cịn là (1,68 g/l). - Mẫu E hàm lượng axít lactic cịn dư trong dịch lên men cịn cao nhất là (1,69 g/l).
Mẫu đối chứng (ĐC) lên men tự phát có thời gian lên men malolactic dài nhất trong tất cả các mẫu nghiên cứu. Sau khi quá trình lên men rượu kết thúc, đến ngày thứ tám, quá trình lên men malolactic mới bắt đầu và kết thúc vào thời điểm 16 ngày sau đó. Tổng q trình lên men malolactic là 23 ngày.
Mẫu M, bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h của quá trình lên men rượu, khi hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% có thời gian lên men malolactic
Mẫu E, bổ sung vi khuẩn lactic vào giai đoạn cuối của quá trình lên men rượu có thời gian lên men malolactic là 14 ngày.
Tuy nhiên, vì bổ sung lactic ở các giai đoạn khác nhau của quá trình lên men rượu nên có sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn, do vậy ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu, đặc biệt đến sự tạo thành etanol và hàm lượng đường sót, sự ảnh hưởng này được trình bày ở bảng 3.15 và hình 3.7
Bảng 3.15 Rƣợu etanol đƣợc tạo thành và hàm lƣợng đƣờng sót sau q trình lên men malolactic
Mẫu Etanol (%v/v) Đƣờng sót (g/1)
ĐC 12,8 5,9
F 12,1 7,2
M 12,9 5,9
E 12,8 5,9
Hình 3.7 So sánh sự tạo thành rƣợu etanol sau quá trình lên men malolactic
Kết quả, ở bảng 3.15 và hình 3.7 cho thấy mẫu bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điểm đầu quá trình lên men rượu đã khiến cho quá trình lên men cồn được thực
hiện khơng hồn tồn, thể hiện ở hàm lượng đường sót cịn tương đối cao (7,2 g/1), hàm lượng cồn tạo thành tương đối thấp. Tuy nhiên, hàm lượng cồn thấp của mẫu này còn thế là do vi khuẩn lactic đã tiêu thụ một phần đường để lên men. Mẫu bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h lên men (mẫu M) có hàm lượng cồn tạo ra và hàm lượng đường sót tương tự như các mẫu lên men cồn mà khơng có sự tham gia của vi khuẩn lactic (mẫu ĐC và mẫu E).
Việc bổ sung lactic ở các giai đoạn khác nhau của quá trình lên men rượu nên có sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn, do vậy ảnh hưởng đến q trình lên men rượu, cịn ảnh hưởng đến sự tạo thành các chất bay hơi, sự ảnh hưởng này được trình bày ở bảng 3.15 và hình 3.8
Bảng 3.16 Sự tạo thành 1 số chất bay hơi đƣợc tạo thành sau quá trình