Tài liệu Tắt (ức chế) gen thông qua các phân tử ARN nhỏ doc

TCNCYH 22 (2) - 2003 Tắt (ức chế) gen thông qua các phân tử ARN nhỏ (Inactivation of gene by small interference RNA) GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi* Các hoạt động của gen theo nhu cầu của sinh vật để có thể tiến hoá loài đợc kiểm soát và điều hoà chặt chẽ. Giải thởng Nobel năm 1962 của Jacob và Monod về điều hoà hoạt động gen ở vi khuẩn (đơn bào): vai trò của gen khởi động, gen điều hoà (tăng cờng, ức chế), gen cấu trúc, các đoạn intron, exon, transposon trong tổng hợp protein đã đợc hiểu biết cụ thể. Sự điều hoà này ở sinh vật đa bào cũng đợc nghiên cứu trong hơn 3 thập kỷ qua. Nhiều tác giả cũng đã chứng minh có 4 nhóm mô hình chi phối hoạt tính gen trong tế bào của cơ thể đa bào nh: các protein trong nhiễm sắc thể, các đoạn ADN nhắc lại, hình thể vật lý và thành phần hoá học của các nhiễm sắc thể. Các yếu tố chi phối này đợc tổ chức thành hệ thống điều hoà gồm các gen nhạy cảm và gen tiếp nhận các chất điều hoà hoạt động gen. Các tín hiệu ở ngoài vào trong tế bào liên kết với histon giàu arginin đánh thức các gen nhạy cảm. Toàn bộ hệ thống gen sẽ đợc mở và các protein acid, các polymerase chuyển tín hiệu đến gen tiếp nhận, giải phóng gen này để sao chép ra mARN, rồi mã gen đó đợc dịch ra protein Không có gen nào là không đợc kiểm soát. Vai trò của gen nhạy cảm và histon giàu arginin là quan trọng nhất trong sự điều hoà, giống vai trò của repressor trong mô hình điều hoà hoạt tính gen của Jacob và Monod ở cơ thể đơn bào. Từ 3 thập kỷ trở lại đây, nhiều tác giả đã nghiên cứu tìm cách kiểm soát hoạt tính gen theo định hớng để điều trị và phòng bệnh. Trong một bài tổng quan đăng trong tạp chí "Thông tin Y học - Đại học Y Hà nội", tiền thân của tạp chí Nghiên cứu Y học ngày nay, chúng tôi đã giới thiệu về một kỹ thuật ức chế hoạt tính gen thông qua các oligonucleotid antisense (các đoạn ADN ngắn đối mã. Đó là các đoạn ADN ngắn tổng hợp nhân tạo có khả năng lai với các mARN để ngăn cản sự biểu lộ mARN và qua đó ngăn cản sự tổng hợp các protein của các gen, đặc biệt các gen có liên quan đến các quá trình bệnh lý nh: ác tính, nhiễm virút Trong các thí nghiệm in vitro, các đoạn ADN ngắn antisense này tỏ ra có hiệu quả ức chế các gen virút (ức chế gen mã HBsAg, ức chế nhân bản HIV). Nhng trong các mô hình thực nghiệm in vitro ở động vật, vai trò của các oligo (dN) antisense này cũng tỏ ra có hiệu quả nhng yếu ớt hơn. Vấn đề khó nhất tồn tại vẫn là chứng minh tác dụng của chúng trong bệnh lý ác tính, bệnh nhiễm virút ở ngời. Trong bài bào này chúng tôi xin giới thiệu các kết quả nghiên cứu mới nhất về vai trò ức chế của các phân tử ARN nhỏ. Các tác giả đang mong muốn sẽ áp dụng đợc trong điều trị các bệnh lý ác tính hay nhiễm virút ở ngời. Đó là siRNA, các phân tử ARN nhỏ gây nhiễu (small interference RNA), gây ức chế gen biểu lộ. Mơ ớc của rất nhiều nhà sinh học phân tử trong 15 năm qua là thiết lập đợc một kỹ thuật thích hợp, thuận lợi và tin cậy để chứng minh một gen đã mất chức năng (knock - out gene) ở mức mARN, nghĩa là sau sao chép gen. Trong các cố gắng để tạo ra các tế bào hay cơ thể mất chức năng, nhiều phân tử đã đợc mò mẫm và thử thách. Ví dụ nh các trình tự oligo (dN) antisense ngắn (đã nói ở trên), các ribozym, các *Nguyên Trởng Labo trung tâm Y sinh học - Đại học Y Hà Nội 89 TCNCYH 22 (2) - 2003 đoạn oligonucleotid tạp lai (chimeric) mà sự sử dụng loại phân tử nào là tuỳ gen đích. Hơn nữa, tác dụng rất khó tiên đoán và thờng chỉ có tác dụng ức chế gen yếu [2]. Rất ngẫu nhiên các nhà thực vật học đã thu đợc thắng lợi lớn bất ngờ trong lĩnh vực này. Năm 1990, lần đầu tiên hai nhóm nghiên cứu của Napoli và Stuitje thông báo về sự đồng ức chế của hiện tợng biểu hiện quá mức chalcone synthase (CHS) ở thực vật. Trong khi cố gắng tạo ra nhiều cây thuốc lá dại màu tím, đôi khi họ có đợc các kết quả bất ngờ, không chờ đợi: đó là có đợc nhiều hơn các cây thuốc lá dại màu trắng. Cơ chế của hiện tợng trên vẫn là bí ẩn. Nhiều tác giả nghĩ rằng có đợc nhiều sản phẩm không chờ đợi có lẽ là do sự giáng hoá của vùng dsRNA (double strand RNA) trong gen CHS gây ra sự im lặng của gen sau sao chép (post - transcriptional gene silencing (PTGS)). [5,3]. Trong chủng nấm Neurosporci Crassa, các tác giả cũng gây đợc sự câm lặng của gen sau sao chép, một hiện tợng đợc xem nh là hiện tợng đàn áp, dập tắt [4]. (xem bảng 1). Năm 1998, Andy Fire ở viện Carnegie và Craig Mello ở Đại học Tổng hợp Massachusetts lần đầu tiên chứng minh rằng dsRNA trong giun Caenorhabditis elegans có thể ức chế đặc hiệu và chọn lọc sự biểu lộ gen với hiệu quả cực đại. Fire gọi hiện tợng này là hiện tợng nhiễu, giao thoa của ARN: RNAi (RNA interference). Cơ chế này làm gen câm lặng mạnh mẽ đã đợc chứng minh trong nhiều chủng loại của sinh giới. Cơ chế tắt gen của RNAi: RNAi bắt đầu khi enzym dicer bắt gặp dsRNA và cắt dsRNA ra nhiều mảnh nhỏ gọi là siRNA (small interfering RNA). Enzym dicer là do Hannon và Emily Bernstein phát hiện, thuộc gia đình RNA III nuclease. Một phức hợp protein thu nhặt các RNA nhỏ này giữ lại và sử dụng mã của chúng trong một trình tự giống nh thế, ví dụ mRNA đích. Akashi và cs 2001, Willecke và cs 2002 đã mô tả mô hình cập nhật của RNAi nh ở hình 1. Trong mô hình này, hiện tợng khởi động xảy ra trùng khớp với sự xuất hiện trong tế bào các gen sao chép, các gen chuyển (transposon), các virút và các RNA hay các sợi đơn RNA bất thờng. Trong trờng hợp của sợi đơn RNA bất thờng thì các RNA polymerase phụ thuộc RNA sẽ sản xuất các dsRNA. Các bớc tiếp theo bớc khởi động có thể tóm tắt ở hình 2. ứng dụng RNAi ở động vật có vú: RNAi hoạt động rất mạnh ở nhiều loài không xơng sống để chống lại các tác nhân ở bệnh lý. ở các loài có xơng sống, có vú đã phát triển đợc rất nhiều cơ chế bảo vệ khác nhau để chống lại sự nhiễm virút nên cơ chế RNAi ít đợc sử dụng. Ngoài ra khi RNA virút có mặt với nồng độ cực thấp sẽ khởi động đáp ứng interferon mà ta gọi là đáp ứng pha cấp (acute-phase response) và đáp ứng protein kinase với ds RNS (responsive protein kinase - PKR). PKR phosphoryl hoá và bất hoạt yếu tố dịch mã EIF2a rồi gây hoạt hoá 2', 5' oligoadeylate synthetase, và cuối cùng là hoạt hoá RNAse L. Chuỗi phản ứng này gây ức chế không đặc hiệu sự dịch mã, từ đó cũng sẽ khởi động apoptosis. (xem hình 3). Năm 2000, RNA đợc thử nghiệm lần đầu tiên trên phôi chuột nhắt. Wianny và Zernicka - Goetz đã chứng minh rằng tiêm dsRNA ức chế đặc hiệu 3 gen MmGFP dới sự kiểm soát của yếu tố elongator factor 1a. E-cadherin và c-mos trong tế bào noãn chuột nhắt và phôi sớm. Nh thế sẽ có ngừng dịch mã. Còn khi phôi phát triển bình thờng thì đáp ứng PKR không xảy ra và sự dịch mã sẽ xảy ra. Phải đến năm 2001, các nhà nghiên cứu của hãng Ribopharma AG (Kulmbach Germany đã đợc giải thởng sáng tạo - patent) đã chứng 90 TCNCYH 22 (2) - 2003 minh lần đầu tiên chức năng của RNAi trong tế bào động vật có vú. Họ chứng minh rằng các dsRNA nhỏ hơn, tơng tự các mẫu do DICER cắt dsRNA ra có thể khởi động apoptosis. Bằng cách sử dụng các RNA ngắn (20 - 24bp), đợc Ribopharma gọi là các Sirplex, có thể dập tắt gen đặc hiệu ngay cả trong tế bào ngời mà không gây đáp ứng pha cấp. Nh thế theo họ SIRPLEX thích hợp cho gen đích và sử dụng trong trị liệu dập tắt gen bệnh ở nhiều loài, kể cả loài ngời. Từ đó các SIRPLEX trở thành các RNAi a thích có hiệu lực, đợc sử dụng trong nghiên cứu chức năng gen trong nhiều phòng thí nghiệm, với hy vọng trong trị liệu một số bệnh lý ở vật và ở ngời trong tơng lai. Bảng 1. Các cơ chế tắt gen sau sao chép. Ngành Chủng Cơ chế Chất tác động Tài liệu tham khảo Fungi Neutospord quelling Transgenes Cogoni and Maciano, 1997 Plamts Arobidopsis PTGS Transgenes Elmayan et al., 1998. Petunia Dehio an Schell, 1994. Nicotiana Transcriptional gene silencing Transgenes, virus Funer et, al., 1998. Invertebrales C. elegans RNAi dsRNA Ketting et al., 1998. Misquilla and Palerson, 1999. Transcriptional gene silencing Transgenes Kelly and Fine, 1998. Drosophila RNAi dsRNA Misquilla and Palerson, 1999. shRNA Paddison et al., 2002. Co-suppression Transgenes Pal. Bhadra et al., 1999. Paramecium Homology-dependent silencing Transgenes Ruiz et al., 1998. Trypanosoma RNAi dsRNA Wang et al., 2000. Vertbrates Danio retio RNAi dsRNA Wargelus et al., 1999 Mus musculus RNAi dsRNA Wianny and Zernicka-Goetz, 2000. Bảng 2. Các ví dụ về RNAi ở một vài chủng loại Chủng Tài liệu tham khảo Coenorhabditis elegans Nematode Fire et al., 1998; Tavemarakis et al., 2000 Danio rerio Zebrafish Wargelius et al., 1999 Tryanosoma brucei Unicellulor Wang et al, 2000 Hydra magnipopillata Cnidarion Lohmann et al., 1999 Schmidtea meditteonea Plonarian Alvarado and Newmark, 1999 Escherischia coli Bacteria Ichurikov et al, 2000 Neerospora crassa Fungus Cogoni and Mocino, 1999 91 TCNCYH 22 (2) - 2003 Drosophila melanogaster Frut-lly Bernstein et al., 2001 Mus musculus Mammals Wianny and Zemicka-Goetz, 1999 Arabidopsis tholioano Plants Akashi et al., 2001 Tµi liÖu tham kh¶o 1. Phan ThÞ Phi Phi (1995), Th«ng tin Y häc, tËp 2 (6). 2. Braasch DA, Corey DR (2002), Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry, 41 (14): 4503-10 3. Jorgensen RA, Cluster PD et al.(1996), Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs antisense and single-copy vs complex T- DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5): 57- 73. 4. Romanio N., Macino G. Quelling (1992): transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbil., 6 (22): 3343-53. 5. Van der Krol AR, Mur LA et al. (1990), Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of genecopies may lead to a suppression of gene expression. Plant cell 2 (4): 291-9. 92 . Tắt (ức chế) gen thông qua các phân tử ARN nhỏ (Inactivation of gene by small interference RNA) GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi* Các hoạt động của gen. mARN để ngăn cản sự biểu lộ mARN và qua đó ngăn cản sự tổng hợp các protein của các gen, đặc biệt các gen có liên quan đến các quá trình bệnh lý nh: ác