Tài liệu Chiến lược sử dụng kháng thể để định tỷ lệ phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền pdf

Chiến lợc sử dụng kháng thể để định tỷ lệ phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền Trần Khiên Hùng Phòng Miễn dịch tế bào, Viện Pasteur tp Hồ Chí Minh Nghiờn cu nhm xõy dng cho Labo min dch mt chin lc dựng khỏng th nh t l % TCD 4 , % TCD 8 mt cỏch chớnh xỏc v r tin. Mu ca 38 ngi c chia thnh 2 nhúm: nhúm cú mu bỡnh thng: thy rừ 3 nhúm t bo lympho, mono, bch cu ht trờn ca s FSC, SSC. V nhúm cú mu bt thng: khụng thy rừ 3 nhúm t bo nh trờn. Hai b khỏng th c s dng: Vi phng phỏp 4 mu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) v vi phng phỏp 3 mu: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP). Giỏ tr % TCD 4 , %TCD8 ca tng mu c ghi nhn c 2 phng phỏp. Dựng phn mm Excell xỏc nh h s tng quan c 2 phng phỏp ca cỏc mu nghiờn cu. Kt qu: + Trong nhúm t bo bỡnh thng h s tng quan gia PP 4 mu v PP 3 mu i vi: * TCD 4 : r = 0.96. * TCD 8 : r = 0.87. + Trong nhúm cú t bo bt thng h s tng quan gia PP 4 mu v PP 3 mu i vi * TCD 4 : r = 0.66. * TCD 8 : r = 0.57. Vi nhúm t bo bỡnh thng cú s tng quan tt gia hai phng phỏp 3 v 4 mu v chỳng ta cú th x dng phng phỏp 3 mu nh t l % TCD 4 , % TCD 8 vi chớnh xỏc khụng kộm gỡ i vi phng phỏp 4 mu. iu ny dn chúng tụi n mt chin lc: Trc tiờn dựng phng phỏp 3 mu. Nu cú gỡ bt thng xy ra lỳc x lý mu (cũn nhiu hng cu sau khi ly gii), lỳc chy mu (thy nhiu mnh vn) thỡ mi chuyn sang phng phỏp 4 mu. I. T VN Trong lõm sng vic ỏnh giỏ t l % ca lympho TCD 4 , TCD 8 cú mt giỏ tr thc tin vỡ i vi HIV/AIDS thỡ nú giỳp xỏc nh bnh nhõn nhim HIV ang giai on no? Cú ch nh dựng thuc c ch men sao chộp ngc cha? Hiu qu ca vic iu tr bng thuc hay nhng liu phỏp khỏc nh th no? [1]. + i vi bnh nhõn ghộp c quan thỡ vic theo dừi nh k cỏc t l ny giỳp ta d bỏo n tỡnh trng thi ghộp [2] Trong thc t lm c vic ny, chỳng ta cú nhiu chn la khỏc nhau v cỏch thc x lý mu, loi khỏng th s dng, cỏch thc phõn tớch , tuy nhiờn trong phm vi nghiờn cu ny chỳng tụi tp 51 trung vào việc lựa chọn kháng thể để làm xét nghiệm. Với 2 loại kháng thể sau tương ứng với phương pháp 4 màu, 3 màu. + CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) {4 màu} + CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP) {3 màu} Thì độ chính xác của thử nghiệm và giá cả cũng khác nhau. Loại đầu tiên giá cho mỗi mẫu thử là 19.12 USD (theo khuyến cáo xử dụng của hãng- báo giá ngày 21- 05- 2002) và nó chính xác hơn loại kế tiếp nếu được kết hợp với phương pháp phân tích đúng…(1) Loại thứ hai thì giá tiền cho m ỗi mẫu thử chỉ có 6.44 USD nhưng kém tin cậy hơn. Mục đích nghiên cứu là nhằm đưa ra được chiến lược xử dụng kháng thể như thế nào để đảm bảo tính chính xác và rẻ tiền trong việc xác định tỷ lệ % CD4, CD8. II. VËt liÖu vµ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu: - Ống chống đông bằng EDTA- TRI K cung cấp bở i LMD Paris. - Ống nghiệm 5ml, cỡ 12 x 75mm do hãng BD cung cấp. - Kháng thể của BD: + PP 4 màu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC). + PP 3 màu: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP). - Dung dịch ly giải hồng cầu. - Máy FASCalibur của BD. - Phần mềm Cellquest, Excel - Mẫu nghiên cứu gồm 38 người lấy từ những người thấy rõ 3 nhóm quần thể lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa sổ FSC, SSC theo quy định của chúng tôi, trong nghiên cứu này gọi là nhóm bình thường và ngược lại là nhóm bất thường. LYMPH O MONO BC HAT A. B. C. Hình 1: Nhóm bình thường và nhóm bất thường. A. Nhóm bình thường thấy rõ 3 nhóm dân số lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa sổ FSC, SSC. B. Nhóm quần thể bất thường không thể xác định chính xác vị trí các nhóm. C. Cũng là mẫu của nhóm quần thể bất thường nhưng được ủ với loại kháng thể 4 màu và dùng cách xử lý khác. Nên sau đó cũng phân biệt các nhóm quần thể tế bào như ở hình 1- A. 2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: +Xử lý mẫ u: *1 ml máu tươi chống đông bằng EDTA được xử lý trong vòng 4 giờ. 52 *Với PP 4 màu: ủ 5 µl kháng thể CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) với 100 µl máu toàn phần. *Với PP 3 màu: ủ 9 µl kháng thể (3 µl cho mỗi loại) CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP) với 100 µl máu toàn phần. *Hồng cầu bị ly giải bằng 1 ml dung dịch ly. *Trung hòa bằng 1ml dung dịch PBS. *Ly tâm 2000 rpm/1’ trong vòng 4 phút. Bỏ dịch nổi, thêm vào 500 µl dung dịch PBS, lắc đều và các tế bào được phân tích sau đó bằng máy FASC. +Mẫu được chạy bằng máy FASCalibur, sản phẩm của hãng BD (Hoa K ỳ). *Máy có 2 đèn laser. - Xanh: cung cấp ánh sáng ở bước sóng 488 nm. - Đỏ: cung cấp ánh sánh ở bước sóng 620 nm. *Có 6 cảm thụ quan nhận cảm ánh sáng phát xạ và những cảm thụ quan này cho ta biết được: - FSC: hình thái của tế bào. - SSC: cấu trúc của tế bào. - Fl1:bắt màu huỳnh quang FITC. - Fl2:bắt màu huỳnh quang PE. - Fl3:bắt màu huỳnh quang PerCP. - Fl4:bắt màu huỳnh quang APC. + Mẫu được phân tích bằng sơ đồ chạy trong chương trình Cellquest. % TCD4, TCD8 được xác định như sau: + Đối với phương pháp 4 màu CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) R1 R2 U R UL L R UL U R L R LYMPH O A. B. C. D. Hình 2: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 4 màu. 53 A. Dùng cửa sổ (x=SSC, y=Fl3:CD45) giới hạn bạch cầu trong khu vực R1. Loại trừ tất cả những yếu tố gây nhiễu như hồng cầu, xác tế bào… ra khỏi khu vực phân tích. B. Cửa sổ (x=FSC, y=SSC) bắt nguồn từ vùng R1. Thấy rõ 3 nhóm dân số và giới hạn vùng lympho trong khu vực R2. C. Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl2:CD8) bắt nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được quần thể T CD8 ( CD3+, CD8+) và phối hợp vớ i phần mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % T CD8 trong vùng UR của cửa sổ. D. Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl4:CD4) bắt nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được quần thể T CD4 ( CD3+, CD4+) và phối hợp với phần mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % T CD4 trong vùng UR của cửa sổ. + Đối với phương pháp 3 màu CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP): Sample ID: 210802/42856 Acquisition Date: 21-Aug-02 Gated Events: 10102 Total Events: 55255 Quad Events % Gated % Total UL 1356 13.42 2.45 UR 3450 34.15 6.24 LL 2707 26.80 4.90 LR 2589 25.63 4.69 R1 A. B. C. D. UR UR Hình 3: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 3 màu. A. Dùng cửa sổ (x=FSC, y=SSC) để phân biệt 3 nhóm quần thể và giới hạn lympho trong vùng R1. B. Cửa sổ (x=fl1:CD4, y=fl2:CD3) bắt nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể T CD4 (CD3+, CD4+) và phối hợp với phần mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % TCD 4 trong vùng UR của cửa sổ. C. Cửa sổ (x=fl2:CD3, fl3:CD8) bắt nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể TCD 8 (CD3+, CD8+) và phối hợp với phần mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % TCD 8 trong vùng UR của cửa sổ. D. Giới thiệu kết quả truy xuất của phần mềm thống kê. % gated của vùng UR là phần chúng ta quan tâm. Mỗi một cửa sổ sẽ có một kết quả truy xuất thích hợp. 54 3. Phng phỏp thng kờ: + Giỏ tr % TCD 4 , TCD 8 ca tng mu c ghi nhn c 2 phng phỏp 3, 4 mu. + i tng nghiờn cu c chia thnh 2 nhúm: *Nhúm bỡnh thng (hỡnh 1- A). *Nhúm bt thng (hỡnh 1- B). +Dựng phn mm Excell xỏc nh h s tng quan c 2 phng phỏp cho 2 nhúm i tng. III. KT QU + Trong nhúm i tng bỡnh thng h s tng quan gia phng phỏp 4 mu v phng phỏp 3 mu i vi: * TCD 4 : r = 0.96. * TCD 8 : r = 0.87. + Trong nhúm i tng bt thng h s tng quan gia phng phỏp 4 mu v phng phỏp 3 mu i vi: * TCD 4 : r = 0.66. * TCD 8 : r = 0.57. IV. BN LUN Trong nhúm dõn s bỡnh thng, cú s tng quan tt gia 2 phng phỏp. c bit tt i vi qun th T CD4, iu ny d hiu vỡ thc cht qun th TCD 4 l qun th tỏch bit rừ gia nhúm dõn s õm tớnh (khụng cú CD4 b mt t bo) v nhúm dõn s dng tớnh (cú CD4 b mt t bo). Trỏi li vi qun th T CD8 li l qun th liờn tc, khú thy ranh gii gia 2 nhúm dõn s õm v dng. Vỡ th trong phõn tớch i vi dõn s TCD 8 , chỳng ta khú loi tr ht nhng tớn hiu nhiu do ú s cú sai s gia 2 phng phỏp [1]. Cũn trong nhúm bt thng thỡ s tng quan kộm hn nhiu. Hm ý rng chỳng ta cú th s dng phng phỏp 3 mu nh t l % TCD 4 , T CD8 vi chớnh xỏc khụng kộm gỡ i vi phng phỏp 4 mu v iu ny ch gii hn trong nhúm dõn s bỡnh thng. Mt yu t rt quan trng, theo thng kờ ca chỳng tụi ti vin Pasteur TP.HCM t 4- 2002 n 2- 2003. Cú khong 1581 trng hp lm % TCD 4 , %TCD 8 , trong ú ch cú 8 trng hp bt thng (vi t l tng ng < 0.51%, mt t l rt thp). Bt thng cú ngha l hng cu khụng ly gii hon ton, cũn nhiu mnh v t bo trong mu cn phõn tớch. Chỳng tụi ó th bng nhiu cỏch nh tng th tớch dung dch ly gii, ly gii lp i lp li nhiu ln u khụng th lo i tr c ht hng cu ra khi mu. Trong nhng trng hp bt thng nh th, x dng phng phỏp 4 mu v dựng CD 45 loi tr hng cu, mnh v t bo nh t l % TCD 4 , TCD 8 thỡ chớnh xỏc hn phng phỏp 3 mu. Vỡ vi phng phỏp 3 mu chỳng ta khụng th no loi tr c cỏc yu t gõy nhiu k trờn. T nghiờn cu trờn, hin nay chỳng tụi cú chin lc dựng khỏng th nh sau: Trc tiờn dựng phng phỏp 3 mu. Nu cú gỡ bt thng xy ra lỳc x lý mu (cũn nhiu hng cu sau khi ly gii), lỳc chy mu (thy nhiu mnh vn) thỡ lp tc chỳng tụi chuyn sang phng phỏp 4 mu. V. Kết luận Kết quả nghiên cứu cho chúng tôi có các kết luận về chiến lợc sử dụng kháng thể trong việc xác định tỷ lệ % TCD4 và TCD8. Đầu tiên chỉ cần dùng phơng pháp 3 mầu với bộ kháng thể CD4/CD3/CD8. Nếu có tế bào bất thờng mới chuyển sang phơng pháp 4 màu với bộ kháng thể CD3/CD8/CD45/CD4. Tỷ lệ đối tợng có tế bào bất thờng của chúng tôi thấp (<0,51%). TI LIU THAM KHO 1.Marilyn A Owens, Michael R Loken. Principles for clinical laboratory practice. Wiley- Liss. 73- 108. 55 2.Carl A Burtis, Edward R Ashwood; Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Part 3; W B Saunders Company; p1338. Summary The strategy use antibodies for quantity the percentage of lympho TCD 4 , TCD 8 accurately and low- cost The samples were obtained from the 38 peoples that can be divided in two groups: + Normal samples group: can see clearly three populations (lymphocyte, monocyte, granulocyte) on the window SSC, FSC. + Abnormal samples group: can’t difference those populations. There are two types of antibodies used for each method. + 4 colors method: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC). + 3 colors method: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP). Obtained results: shown that the correlation coeficients of the % TCD 4 and TCD 8 between two methods were: + With normal samples: * TCD 4 : r = 0.96. * TCD 8 : r = 0.87. + And with abnormal samples: * TCD 4 : r = 0.66. * TCD 8 : r = 0.57. It means that we can use 3 colors method to quantify a accurately the % of TCD 4 and TCD 8 . 56 . Chiến lợc sử dụng kháng thể để định tỷ lệ phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền Trần Khiên Hùng Phòng. cứu là nhằm đưa ra được chiến lược xử dụng kháng thể như thế nào để đảm bảo tính chính xác và rẻ tiền trong việc xác định tỷ lệ % CD4, CD8. II. VËt