Tài liệu BÁO CÁO " KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU VỀ BỆNH GẠO Ở CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) " docx

Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 262 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU VỀ BỆNH GẠO Ở CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyễn Thị Thu Hằng 1 và Đặng Thị Hoàng Oanh 1 ABSTRACT A total of 324 samples of stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) were collected from 10 grow out pond at several location in the Mekong Delta from July to December 2009. These samples were subjected to gross observation, fresh smear and histopathological analysis. Result from fresh smear observation showed that 133 fish samples displayed opalescent or milky oval shaped cysts which sizes were around 0,5-4 mm. These fish did not show any typical infected sign. Their sizes ranged from 10 g to 910 g. The number of cysts in individual fish varied greatly from 0-49 cysts/fish, but commonly about 1-5 cysts/fish. Result from histopathological analysis showed necrotic channges developed in muscle fibres and the necrotic areas were replaced by parasite stages and spores. Keywords: Striped catfish, Microsporidia, Myxobolus, Parasitic disease. Title: Preliminary results of the study on Microsporidia and Myxobolus parasitic disease on the stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) TÓM TẮT Tổng cộng có 324 mẫu cá tra được thu từ 10 ao nuôi ở một số địa phương thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long trong thời gian từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2009. Mẫu cá được quan sát dấu hiệu bệnh lý, soi tiêu bản tươi và phân tích mô bệnh học. Kết quả soi tươi cơ cá có 133/324 mẫu có chứa bào nang màu trắng đục, kích cỡ dao động từ 0,5-4 mm. Cá có chứa bào nang ở cơ không có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài đặc trưng. Kích thước cá nhỏ nhất có chứa bào nang là 10g và lớn nhất là 910 g. Các mẫu cá chứa bào nang với cường độ nhiễm khác nhau, phổ biến từ 0-5 bào nang/cá, đặc biệt có những cá thể có đến 49 bào nang. Kết quả phân tích mô học cho thấy vùng cơ cá tra bị nhiễm bào tử trùng bị mất cấu trúc và hoại tử. Vùng bị hoại tử chứa đầy các bào tử trùng. Từ khóa: Cá tra, bệnh gạo, Microsporidia, Myxobolus. 1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 263 1 GIỚI THIỆU Cá tra là một trong những đối tượng nuôi phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), tập trung nuôi nhiều nhất ở các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long. Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, thị trường trong và ngoài nước, nghề nuôi cá tra đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn nên mật độ và diện tích nuôi ngày càng tăng đáng kể. Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất. Do chi phí đầu tư thấp, mức độ thâm canh cao nên dễ sinh nhiều vấn đề dịch bệnh vì khó quản lý tốt môi trường nước ao nuôi. Bệnh thường xuất hiện ra trên cá tra do nhiều tác nhân gây ra như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm hoặc do môi trường, dinh dưỡng. Một số tác nhân gây bệnh là ký sinh trùng có thể gây thiệt hại về kinh tế cho người nuôi cá tra như trùng quả dưa, trùng mặt trời, sán lá đơn chủ, bào tử trùng Gần đây, trên cá tra xuất hiện một loại bệnh mới do ký sinh trùng gây ra. Do hình thái bào nang của ký sinh trùng có hình tròn hoặc bầu dục, màu trắng sữa giống hạt gạo nên người nuôi cá gọi là bệnh “gạo”. Bệnh “gạo” không làm cho cá chết hàng loạt nhưng làm cá gầy yếu và làm giảm giá trị thương phẩm, đặc biệt là sản phẩm thịt cá không tiêu thụ được. Hơn nữa, nếu tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm “gạo” cao cũng có thể gây chết cá và làm thiệt hại lớn. Hiện nay còn rất ít thông tin và hầu như chưa có một nghiên cứu đầy đủ nào về bệnh gạo trên cá tra ở Việt Nam. Trong báo cáo này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu bước đầu về bệnh gạo ở cá tra cung cấp thông tin cho các nghiên cứu phòng trị bệnh gạo một cách khoa học và hiệu quả. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu mẫu Mẫu cá được thu ngẫu nhiên tại các ao nuôi ở Vĩnh Long, Hậu Giang và Cần Thơ từ tháng 7-12/2009. Số lượng mẫu thu từ 10-15 con/ao (giai đoạn cá giống đến cá thịt). Cá được vận chuyển sống về phòng thí nghiệm bằng thùng nhựa hoặc thùng xốp có chứa một ít nước và sục khí. Đối với cá vừa mới chết thì trữ lạnh bằng nước đá, vậ n chuyển về phòng thí nghiệm và phân tích trong ngày. 2.2 Phương pháp phân tích mẫu 2.2.1 Lấy mẫu cơ cá Dùng kim mũi giáo hủy não cá, cân trọng lượng và đo chiều dài cá. Đặt cá nằm trên thớt, dùng dao cắt một đường ngang sau phần đầu cá, tiếp tục cắt dọc theo thân cá, từ đầu xuống đuôi theo vết cắt đầu tiên. Cẩn thận cắt sát phần cơ gần xương sống theo chiều từ mặt lưng xuống mặt bụng và cắt rời phần cơ này ra khỏi cơ thể cá. Thực hiện tương tự với phần cơ còn lại. Dùng dao cắt bỏ phần da và rửa sạch mẫu. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 264 2.2.2 Phương pháp soi tươi và nhuộm tiêu bản Phân tích mẫu cá tra bệnh gạo bằng phương pháp soi tươi và nhuộm tiêu bản theo phương pháp của Tonguthai et al., (1999). 2.3 Kiểm tra ký sinh trùng 2.3.1 Soi tươi Dùng đĩa petri φ16 ép mẫu cơ cá, tiến hành quan sát mẫu cơ dưới ánh sáng đèn neon hoặc ánh sáng mặt trời để tìm các bào nang màu trắng sữa lẫn trong cơ cá. Đối với mẫu cá lớn, cần cắt lát mỏng phần cơ ra để d ễ quan sát. Trường hợp mẫu cá có những bào nang nhỏ, khó thấy thì quan sát dưới kính hiển vi soi nổi. Đếm số lượng bào nang ký sinh trong cơ. Thu bào nang, loại bỏ các phần cơ xung quanh để lên lam sạch. Dùng kim mũi giáo chọc thủng bào nang. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X để xác định giống loài. 2.3.2 Làm tiêu bản nhuộm thích bào tử trùng Myxosporea Thu bào nang của bào tử trùng để lên lame sạch. Dùng kim mũi giáo chọc thủng bào nang. Để tiêu bản khô ở nhiệt độ phòng rồi nhuộm với thuốc nhuộm nitrat bạc AgNO 3 (có thể gắn tiêu bản không nhuộm). Gắn tiêu bản bằng glycerol-jelly. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở ở vật kính 10X, 40X. 2.3.3 Làm tiêu bản nhuộm vi bào tử trùng Microsporidia Nghiền phần cơ bị nhiễm bào nang Microsporidia trong nước muối sinh lý. Lấy 1 giọt huyền phù đã nghiền cho lên lam và đậy lame lại. Để khô ở nhiệt độ phòng. Nhuộm dung dịch Giemsa (Tonguthai, 1999). Cho glycerol-jelly vào cạnh của lame. Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X và 100X. 2.4 Phương pháp mô bệnh học Dùng dao tiểu phẫu cắt rời phần cơ có chứa bào nang, cố định mẫu trong lọ nhựa có chứa Formol 10% theo tỉ lệ formol: cơ là 10:1 trong 24 giờ. Sau đó tiến hành rửa mẫu dưới vòi nước trong thời gian 5 phút, chuyển mẫu sang dung dịch ethanol 70% cho đến khi phân tích mô học. Mẫu được cắt với độ dày từ 5- 7 µm và xử lý qua các giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Sau đó mẫu được đúc khối, cắt và dán lên lame r ồi nhuộm Haematoxylin & Eosin. Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở độ phóng đại 10X, 40X và 100X và chụp hình tiêu bản đặc trưng. 2.5 Xử lý số liệu Mức độ nhiễm bệnh gạo được tính bằng tỉ lệ nhiễm [(tổng số cá nhiễm bệnh/tổng số cá kiểm tra) x 100] và cường độ nhiễm (số bào nang/cơ cá). Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 265 3 KẾT QUẢ 3.1 Tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm bào nang Kết quả soi tươi 324 mẫu cá tra đã phát hiện 133 mẫu cá nhiễm bào nang (bệnh gạo) của ký sinh trùng ở nhiều mức độ khác nhau. Qua 4 đợt thu mẫu trong các ao nuôi ở Hậu Giang đã thu được 77 mẫu cá, trong đó có 31 cá bị bệnh gạo (chiếm 40%) và 46 cá không bệnh. Kích cỡ trung bình cá bị bệnh gạo là 85,5 g. Cường độ nhiễm trung bình 3 bào nang/cá. Cá biệt ở đợt thu mẫu tháng 8 đã thu được 1 cá bệnh với cường độ nhiễm đến 49 bào nang và các bào nang có kích thước khác nhau. Tổng số cá thu ở Vĩnh Long qua 5 đợt thu mẫu là 128 cá, trong đó có 61 cá bệnh (chiếm 47,6%) và 67 cá khỏe. Kích cỡ trung bình cá nhiễm bệnh gạo là 395 g. Cường độ nhiễm trung bình 4 bào nang/cá. Một số cá nhiễm bệnh gạo với cường độ nhiễm dày đặc cao nhất là 27 bào nang/cá, các bào nang lớn hình tròn hay hình bầu dục có chiều dài 2-3 mm. Những cá này còn có biểu hiện vàng da bên ngoài với các mức độ nặng nhẹ khác nhau. Khi mổ cá để phân tích nhận thấy phần cơ thịt phân hủy rất nhanh và có mùi hôi. Ở Cần Thơ, qua 5 đợt thu mẫu ở Thới Lai với tổng số mẫu cá thu được là 78 mẫu, trong đó có 31 cá bệnh và 47 cá khỏe. Trọng lượng trung bình cá bị bệnh là 450 g. Tỷ lệ nhiễm trung bình là 57,5% và cao nhất ở tháng cuối vụ nuôi là 85,7%. Cường độ nhiễm trung bình 3 bào nang/cá. Riêng 2 đợt thu mẫu từ ao ương cá giống ở Ô Môn có 41 mẫu cá, trong đó có 10 cá bệnh (chiếm 24,3%) với kích cỡ cá từ 10-70 g. Kết quả phân tích mẫu đã phát hiện những cá bị bệnh gạo ở kích cỡ khá nhỏ (10,5 g). Tuy nhiên mức độ nhiễm trung bình thấp, với tỷ lệ nhiễm 15% và cường độ nhiễm 1 bào nang/cơ cá. Một số mẫu cá 60 g có cường độ nhiễm cao nhất là 9 bào nang/cơ cá. 3.2 Dấu hiệu bên ngoài của cá tra bệnh gạo So với cá không nhiễm bệnh gạo, cá nhiễm bệnh gạo ở giai đoạn sớm thường không có dấu hiệu bệnh rõ ràng bên ngoài cơ thể. Một số cá có da bị sần và có những chấm hay vệt đen tập trung nhiều ở chỗ có vùng da mỏng như vùng bụng. Khi mổ cá, hầu hết các bào nang tồn tại trong cơ có dạng những túi tròn hay những vệt dài kích thước dao động từ 0,5-4 mm, bên trong chứa một chất lỏng hơi sệt màu trắng sữa (Hình 1). Đặc biệt là ở những cá nhiễm nặng, các bào nang thường có xu hướng tập trung nhiều ở phần cơ chính giữa gần cơ quan đường bên của cá. Khi các bào nang bệnh gạo ký sinh gây bệnh trên cơ thể cá thường gây ra hiện tượng hoại tử vùng cơ xung quanh bào nang. Các vùng hoại tử này có xu hướng phát triển theo kích cỡ của bào nang và tạo thành khoảng trống bên trong cơ cá. Theo Lom et al. (1999), khi nghiên cứu về sự phá hủy tế bào ký chủ của nhóm Microsporidia cho thấy, một số loài có các giai đoạn phát triển được bao quanh bởi một vùng cơ bị phân hủy hoàn toàn. Trong các loài mới phát hiện thuộc nhóm này có sự tồn tại hoạt động của một Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 266 enzym có cơ chế phân hủy và hóa lỏng cơ của tế bào ký chủ giống như những loài thuộc nhóm Myxosporean gây ra ở cá biển. Hình 1: Cơ cá tra nhiễm bào tử trùng, bào nang có dạng màu trắng sữa, giống như hạt gạo. 3.3 Đặc điểm bào tử bên trong bào nang Khi lấy bào nang trong cơ ép trên lam và quan sát dưới kính hiển vi ở các độ phóng đại khác nhau thấy có rất nhiều bào tử nhỏ bên trong Một số bào nang có chứa cả hai loại bào tử với hai kích cỡ khác nhau. Những bào tử có kích cỡ lớn gấp 10 lần bào tử nhỏ chiếm số lượng rất ít (4-5 bào tử/TT). Khi quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi (Hình 2B) ở vật kính 40X có thể nhìn thấy rõ bào tử nhỏ có dạng hình quả lê (Hình B-a) tương tự cấu trúc củ a nhóm Microsporidia và bào tử lớn có 2 cực nang (Hình B-b) thuộc giống Myxobolus (Lom và Dykova, 1992). Hình 2: (A) (Æ) Bào tử Myxobolus trong bào nang (tiêu bản tươi), 10X; (B) Bào tử quan sát ở vật kính 40X: (Æa) Bào tử Microsporidia; (Æb) Bào tử Myxobolus. A B a b Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 267 Khi nhuộm tiêu bản mẫu bào nang bệnh gạo bằng thuốc nhuộm Giemsa và quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy các bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm ở phần cực nang (Hình 3C). Khi nhuộm với thuốc nhuộm nitrat bạc các bào tử bắt màu nâu nhạt (Hình 3D). Hình 3: (C) Thích bào tử trùng Myxobolus bắt màu xanh ở phần cực nang khi nhuộm Giemsa (D) và bắt màu nâu nhạt khi nhuộm AgNO 3 (40X) (a: vi bào tử trùng Microsporedia; b: thích bào tử trùng Myxobolus). 3.4 Đặc điểm mô bệnh học của cơ cá tra bị bệnh gạo Ở cá tra khỏe, cơ vân phân bố dọc hai bên thân cá, cơ nằm dưới lớp hạ bì của da. Khi quan sát mặt cắt dọc của lớp da cơ từ ngoài vào trong ta thấy đầu tiên là lớp biểu bì của da kế đến là lớp hạ bì và trong cùng là lớp cơ. Ở mặt cắt dọc quan sát thấy các sợi cơ chạy dọc và bên trong có một nhân (Hình 4A). Ở mặt cắt ngang quan sát thấy các bó cơ có hình đa giác hoặc hình tròn nhưng không thấy nhân. Giữa các bó cơ này là mô liên kết (Hình 4B). Hình 4: (A) Bó cơ khỏe (H&E, 40X) (lát cắt dọc); a. Các sợi cơ; b. Nhân tế bào. (B) Bó cơ khỏe (H&E, 40X), (lát cắt ngang) a. Các bó cơ, b. Mô liên kết C D A B a b Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 268 Kết quả phân tích mô bệnh học ghi nhận được hình dạng bào nang và bên trong là vùng cơ đã bị hoại tử (Hình 5), ngoài bào nang có một lớp màng mỏng mô liên kết để bao bọc những bào tử (Hình 6). Hình 5: Vùng cơ bị mất cấu trúc (H&E). A. vùng cơ bị hoại tử (mẫu M-P4-S2) (40X). B. vùng cơ bị hoại tử (mẫu M-P2-S2) (40X) Hình 6: Mô liên kết (Æ) bên ngoài bào nang (mẫu M-P6-S2) (H&E, 400X) Khi thích bào tử trùng Myxobolus và vi bào tử trùng Microsporidia xâm nhập vào cơ của cá tra tạo ra những bào nang trong cơ cá gây hủy hoại tế bào vùng ký sinh và khi số lượng bào tử phát triển quá mức sẽ làm vỡ bào nang, tạo điều kiện cho bào tử lan sang những vùng khác, lúc đó sẽ có nhiều vùng cơ mà chúng ký sinh bị mất cấu trúc. Những vùng cơ khỏe thì từ những bó cơ lớn sẽ chuyển thành những bó cơ nhỏ hơn (Hình 5) và dần dần những bó cơ đó sẽ được thay thế bằng những bào tử (Hình 6). Một số tiêu bản của mẫu cá bệnh khi quan sát thì vùng cơ xung quanh thấy có dấu hiệu bị Microsporidia sp. tấn công. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Lom và Dykova (2000) về sự biến đổi mô học của cơ cá tra nhiễm Microsporidia sp thu ở Bangkok, Thái Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 262-269 Trường Đại học Cần Thơ 269 lan. Những thay đổi chính về mô học gây ra bởi Microsporidia sp được tìm thấy ở cơ bên, cơ lưng, cơ bụng. Hầu hết các khối cơ bên bị che kín bởi các bào tử. Những thay đổi nghiêm trọng về cấu trúc trong mô cơ đi kèm với sự nhân lên của Microsporidia sp. và sự lây lan của sự truyền nhiễm đều chiếm ưu thế trong các mẫu được quan sát. Thêm vào đó sự thay đổi về cấu trúc của những sợi cơ đặc trưng như sự mất đi của những sợi cơ, hoại tử cơ được quan sát ở tất cả các giai đoạn phát triển cũng như ở ngoại vi thay vào đó tập hợp các bào tử khổng lồ, tổng thể này lớn lên tăng kích thước hoặc ít tỏa tròn hơn. 4 KẾT LUẬN Cá giống có khối lượng khoảng 10 g đã nhiễm bào nang (bệnh gạo) của ký sinh trùng, mức độ nhiễm khác nhau theo kích cỡ cá. Một số mẫu nhiễm bào nang chứa 2 loại bào tử có kích thước khác nhau, một loại bào tử có kích thước lớn có 2 cực nang thuộc giống Myxobolus chiếm số lượng ít và 1 loại có kích thước nhỏ có 1 cực nang thuộc nhóm Microsporidia chiếm số lượng rất nhiều. Khi bị bệnh gạo, vùng cơ cá tra bị nhiễm bệnh bị mất cấu trúc và hoại tử. Vùng bị hoại tử được thay thế bằng các bào tử của ký sinh trùng. LỜI CẢM TẠ Tác giả xin chân thành cảm ơn đến sinh viên Hồ Hữu Trọng và Lê Thu Hồng lớp Bệnh học Thủy sản 32 đã tham gia phân tích mẫu nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lom, J and I. Dykova, 2000. Histopathology of kabatana arthuri (Microspora) infection in sutchi catsfish, Pangasius sutchi. Folia parasitologica 47: 161- 166. Lom, J and I. Dykova. 1992. Protozoan parasite of fish. Developments in Aquaculture and Fisheries Science, Vol. 26. Elsevier, Amsterdam 1992, 315 pp. Lom, J. I. Dykova and K. Tonguthai. 1999. Kabataia gen.n., a new genus proposed for icrosporidium spp. infecting trunk muscles of fishes. Diseases of Aquatic Organisms. Vol. 38: 39-46. Tonguthai, K., S. Chinabut, T. Somsiri, P. ChanratChakoo and S. Kanchanakhan. 1999. Diagnostic Procedures for Finish Diseases. Aquatic Animal (Health Research institute (AAHRI). Department of fisheries kasetsart University campus Bangkok, Thailand. . nghiên cứu đầy đủ nào về bệnh gạo trên cá tra ở Việt Nam. Trong báo cáo này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu bước đầu về bệnh gạo ở cá tra. Thơ 262 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU VỀ BỆNH GẠO Ở CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyễn Thị Thu Hằng 1 và Đặng Thị Hoàng Oanh 1 ABSTRACT A