Công Nghệ Di Truyền Chuyển gen ở tế bào động vật

Microsoft PowerPoint CNDT 2 Chuyá» n gen á»� tế bÀo ĒỎng váº�t Công nghệ di truyền 2 Chuyển gen ở động vật • Động vật biến đổi gen (ĐVBĐG) được sử dụng trong nghiên cứu chức năng gen in vivo và làm mô hình nghiên cứu bệnh ở người • ĐVBĐG được tạo ra ở các loài động vật có vú, chim, lưỡng cư, động vật không xương sống • Chuyển gen ở động vật thường được thực hiện trên chuột nhằm tạo ra các mô hình bệnh ở người Giới thiệu •Phân tích điều hòa biểu hiện gen ở tế bào động vật là một trong những.

Công nghệ di truyền Chuyển gen động vật Giới thiệu • Động vật biến đổi gen (ĐVBĐG) sử dụng nghiên cứu chức gen in vivo làm mơ hình nghiên cứu bệnh người • ĐVBĐG tạo lồi động vật có vú, chim, lưỡng cư, động vật khơng xương sống • Chuyển gen động vật thường thực chuột nhằm tạo mơ hình bệnh người Giới thiệu •Phân tích điều hịa biểu gen tế bào động vật hướng nghiên cứu sinh học phân tử •Khả tiếp nhận DNA ngoại lai tế bào động vật có vú biểu gen đoạn DNA chèn vào phát vào năm 1962 Szybalska Szybalski - DNA ngoại lai hình thành đồng kết tủa với calcium phosphate; vào tế bào qua chế thực bào (phagocytosis) Sinh học • Virus Hóa học • Cation polymer • Calcium phosphat • Cation lipid Vật lý • Vi tiêm • Biolistic • Xung điện • Tia laser • Sóng siêu âm • Hạt nano từ Các phương pháp chuyển gen động vật Hóa chuyển nhiễm (chemical transfection): DNA calcium phosphate đồng kết tủa màng tế bào tiếp nhận qua chế nội nhập bào (endocytosis) Hình DNA ngoại lai đưa vào tế bào phương pháp hóa chuyển nhiễm (Primrose and Twyman , 2006) Các phương pháp chuyển gen động vật – Hóa chuyển nhiễm • Đồng kết tủa calcium phosphate thường độc, số loại tế bào không hấp thu kết tủa rắn sử dụng hợp chất polycation (poly – L – lysine, polyamides, DEAE-dextran) • Một số hỗn hợp liplid tích điện dương trung hòa tạo phức hợp với DNA Phức hợp tương tác với màng tế bào sự tiếp nhận DNA qua chế nội nhập bào • Có thể sử dụng chuyển gen cách bền vững hay tạm thời chuyển đoạn DNA kích thước lớn YAC Hình Các hợp chất polycation Các phương pháp chuyển gen động vật – Phương pháp vật lý • Phương pháp chuyển nhiễm xung điện sử dụng rộng rãi, cách hiệu nhiều loại tế bào in vivo (da, hay tế bào ung thư) Ưu điểm: dễ sử dụng khả áp dụng nhiều loại tế bào • Phương pháp vi tiêm mang lại hiệu cao địi hỏi nhiều cơng sức áp dụng số loại tế bào định, giao tử cái, trứng, tế bào phơi sớm • Phương pháp bắn gen áp dụng tế bào nuôi cấy hay mô ứng dụng in vivo (cho tế bào da) Hình Vi ảnh thể cấu trúc màng tế bào hồng cầu đông lạnh thời điểm khác (t), sau truyền xung điện, (a) t= 0,5 ms, (b) 2,5 ms, (c) 40ms, (d) 5s, (e) 10s (Chang & Reese, 1990) Tạo chuột chuyển gen phương pháp vi tiêm Ở động vật có vú, sau tinh trùng vào trứng, nhân tinh trùng (nhân nguyên đực, male pronucleus) nhân trứng thực thể riêng biệt Nhân nguyên đực lớn nhân nguyên cái, phân biệt kính hiển vi Hình Vi ảnh huỳnh quang trứng/phôi thụ tinh in vitro (A, B) hay in vivo (C,D) nhuộm Hoechst cho thấy tiền nhân pronuclei hay nhân (mũi tên không tô), thể cực (đầu mũi tên), tinh trùng (mũi tên tô đậm) Thanh ngang = 50 μm A) Noãn với nhân nguyên thể cực, tinh trùng vùng suốt B)Phôi giai đoạn tế bào với nhân, thể cực tinh trùng C) Phôi giai đoạn tế bào , nhân thể cực D) Phôi giai đoạn tế bào với nhân thể cực Hình Vi ảnh huỳnh quang trứng/phôi thụ tinh in- vitro (A, B) hay in vivo (C,D) nhuộm Hoechst (http://www.biolreprod.org/content/67/1/256/F1.expansion) Tạo chuột chuyển gen phương pháp vi tiêm Sau vi tiêm, 20 - 30 trứng cấy vào chuột mẹ ni có chữa giả (giao phối với chuột đực cắt ống dẫn tinh) Ở chuột, giao phối phương pháp để chuẩn bị tử cung cho việc cấy tuần sau cấy chuột mẹ nuôi sinh chuột từ trứng tiêm vào Xác định DNA chuyển chuột DNA từ chóp chuột phân tích Southern Blot hay PCR để phát gen chuyển Chọn lọc cá thể mang gen chuyển tế bào sinh dục Tạo chuột chuyển gen phương pháp vi tiêm Hạn chế - Đoạn DNA chuyển vào gắn ngẫu nhiên - Nhiều gen gắn chỗ gây biểu gen mức, rối loạn sinh lý Hiệu 66% hợp tử sống sót sau tiêm 25% hợp tử phát triển thành chuột 25% chuột chuột chuyển gen Trong 1000 trứng thụ tinh tiêm, khoảng 30 – 35 chuột chuyển gen Tạo chuột chuyển gen phương pháp Cải biến tế bào gốc phôi Các tế bào giai đoạn túi phơi phơi chuột phát triển phát triển mơi trường ni cấy có khả biệt hóa (kể phát triển thành tế bào dịng sinh dục) gọi tế bào gốc phôi (Embryonic stem, ES) Tính tế bào ES khơng thay đổi dùng thao tác gen Gen chuyển cài vào vị trí đặc biệt gen tế bào ES Thiết lập dịng tế bào gốc phơi (ES) ni cấy Vector mang gen mục tiêu chuyển vào tế bào gốc phôi nuôi cấy Tế bào gốc phơi mang trình tự gen chuyển nhiễm sắc thể tiêm vào phôi nang chuột Phôi nang chuyển vào chuột mẹ mang thai hộ Chuột thể khảm sinh ra, giao phối với chuột thường sinh chuột mang tính trạng qui định gen từ tế bào gốc phơi Hình 10 Chuyển gen vào tế bào gốc phôi chuột http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=cooper&part=A483 Chọn lọc dương – âm tính Biến đổi gen hệ tái tổ hợp Cre - loxP •Hệ tái tổ hợp Cre – loxP xuất xứ từ yếu tố di truyền thực khuẩn thể P1 •Sự cài nhập gen P1 tùy thuộc vào sản phẩm gen cre (circular recombinase/ Cre recombinase), cắt đặc hiệu tái tổ hợp DNA loxP (locus of crosing over [x] in P1) •Kỹ thuật sử dụng nhiều nghiên cứu hậu sinh học bất hoạt gen đặc hiệu mơ nhằm thiết lập mơ hình bệnh người Quá trình tạo tế bào ES với gen bị bất hoạt Thymidine kinase (tk) • Marker chọn lọc âm tính cho phép chọn lọc tế bào hay mang gen marker • Mã hóa gen tk virus herpes phosphoryl hóa dạng nucleoside hiệu ganciclovir Nucleotide tạo sử dụng DNA polymerase đóng vai trị dấu hiệu kết thúc chuỗi • Các tế bào biểu gen tk bị loại ni mơi trường chứa ganciclovir Chuyển gen với vector dung lượng lớn • • • • BAC – NST nhân tạo vi khuẩn PAC - dẫn xuất từ thực khuẩn thể P1 YAC – NST nhân tạo nấm men MAC – nhiễm sắc thể động vật có vú Các NST mang DNA gen từ 100 tới 1000 kb Phương pháp chuyển gen: vi tiêm ... việc chuyển gen vào tế bào động vật có vú việc cấy chuyển nhân sinh dưỡng vào tế bào trứng nhân cho phép thực tạo dịng vơ tính động vật biến đổi gen Các bước tạo động vật biến đổi gen động vật. .. expression) • Ở phần nhỏ tế bào chuyển nhiễm, DNA xác nhập vào gen tế bào nhận, tái tạo dòng tế bào biến đổi gen bền vững (stable expression) Các tế bào chọn lọc marker http://blog.addgene.org/... thành tế bào dòng sinh dục) gọi tế bào gốc phơi (Embryonic stem, ES) Tính tế bào ES không thay đổi dùng thao tác gen Gen chuyển cài vào vị trí đặc biệt gen tế bào ES 1 Thiết lập dịng tế bào gốc