1 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI TIỂU LUẬN MÔN HỌC TỰ ĐỘNG HÓA VÀ THIẾT BỊ ĐO ĐẠC NÂNG CAO TRONG THIẾT KẾ HỆ THỐNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG ĐỀ TÀI NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA MÁY QUANG PHỔ UV VIS GVHD TS Nguyễn Hoài Nam Học viên 1 Nguyễn Phương Vân – 211800164 Học viên 2 Đỗ Thanh Thanh Huyền 211800159 Lớp 29KTMT Hà Nội, tháng 03 năm 2022 2 MỤC LỤC PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ 4 1 1 Đặt vấn đề 4 1 2 Tổng quan về quang phổ 5 1 2 1 Lịch sử nghiên cứu quang phổ học 5 1 2 2 Đại.
TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ
Đặt vấn đề
Hiện nay, việc ứng dụng các phương pháp phổ trong giảng dạy, học tập, nghiên cứu khoa học và sản xuất đã trở nên phổ biến và cần thiết không chỉ trong ngành hóa học mà còn ở nhiều lĩnh vực khác như hóa sinh, y dược, nông nghiệp, dầu khí, vật liệu và môi trường Kể từ những năm 80, sự tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là ngành tin học, đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp phổ về kỹ thuật thực nghiệm, kho tàng dữ liệu và cơ sở lý thuyết Điều này đã dẫn đến những thay đổi chất lượng, biến các phương pháp phổ thành công cụ ứng dụng rộng rãi và phổ biến hơn trong nhiều lĩnh vực.
Các phương pháp phân tích quang học, nổi bật với độ chính xác và độ lặp lại cao, bao gồm phương pháp hấp thụ phân tử và phát quang, dựa trên tính chất quang học của chất phân tích Ngoài ra, còn có các phương pháp khác như khúc xạ, phân cực, phổ hồng ngoại, phổ tia X và phổ Raman, chủ yếu được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc của chất Vào đầu thế kỷ 19, phương pháp trọng lượng và chuẩn độ là những phương pháp chính trong phân tích hoá học định lượng, tuy nhiên, chúng gặp khó khăn trong việc xác định các hợp chất có nồng độ thấp Điều này đã dẫn đến việc phát triển các phương pháp phân tích định lượng mới, trong đó có phương pháp so màu quang phổ, bắt đầu với phương pháp Nessler vào năm 1856, giúp phân tích hàm lượng ammonia trong nước thông qua phản ứng tạo màu với HgI2 và KI.
NH4 + Màu của mẫu sẽ được so sánh với màu của mẫu chuẩn để xác đinh nồng độ tương ứng
Phương pháp phân tích nước mặt và nước thải đã được nghiên cứu và bổ sung trong các Tiêu chuẩn Phương pháp từ cuối thế kỷ 19 Trong giai đoạn này, các phương pháp mới như hấp thu, phát xạ, tán xạ, tia cực tím và điện từ hồng ngoại bắt đầu được khám phá Sang thế kỷ 20, sự phát triển của tia X, sóng microwave và sóng radio, cũng như các hạt năng lượng như electron và ion, đã mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực này.
Phương pháp hấp thụ phân tử UV-VIS là phương pháp phổ biến nhất trong việc định lượng chất, với độ nhạy và chính xác cao, ngoại trừ các khí trơ Quá trình này bao gồm việc tách chiết chất phân tích bằng dung môi hoặc kết tủa, sau đó hòa tan và định lượng bằng phổ hấp thụ Để định lượng các cấu tử vô cơ, người ta thường sử dụng phản ứng tạo thành phức màu, trong khi các kim loại và phi kim có khả năng tạo phức chất màu hoặc tương tác với phức màu Đối với hợp chất hữu cơ, phản ứng tổng hợp chất màu được áp dụng, cũng như để định lượng một số cấu tử vô cơ như sunfua và nitrit.
Tổng quan về quang phổ
1.2.1 Lịch sử nghiên cứu quang phổ học
Quang phổ học là một lĩnh vực quan trọng trong thiên văn học, đã được ứng dụng hiệu quả trong việc nghiên cứu khí quyển của các hành tinh Khoảng 200 năm trước, Joseph von Fraunhofer (1787-1826) đã phát minh ra máy đo quang phổ tiên tiến nhất thời bấy giờ, giúp ông phát hiện nhiều đường tối trong quang phổ ánh sáng mặt trời và xác định chính xác độ dài bước sóng của nhiều loại ánh sáng.
"Fraunhofer lines" là thuật ngữ vẫn được sử dụng ngày nay, mặc dù vào thời điểm đó, ông không hiểu rõ về các cơ sở vật lý và ý nghĩa của những phát hiện mà mình đã khám phá.
Hình 1.1 Thiết bị Spektralapparat thiết kế bởi Kirchhoff và Bunsen (1833)
Vào năm 1859, một thành tựu quan trọng trong nghiên cứu “Fraunhofer lines” đã được đạt được nhờ vào sự hợp tác của nhiều nhà vật lý nổi tiếng như Gustav R Kirchhoff và Robert W Bunsen tại Heidelberg, khi họ khám phá ra nguyên lý vật lý của sự hấp thu và phát xạ Thiết bị mà họ sử dụng đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và phân tích hiện tượng này.
Máy quang phổ đã ghi nhận quá trình phát xạ đặc biệt của nhiều nguyên tố khác nhau, dẫn đến việc khám phá hai nguyên tố mới là Cossium và Rubidium, chiết xuất từ 44.000 lít nước khoáng gần núi Bad Nauheim, Đức Khám phá này đặt nền tảng cho nghiên cứu tiếp theo về sự hấp thu và phát xạ của phân tử Năm 1879, Marie Alfred Cornu phát hiện rằng bức xạ mặt trời có bước sóng ngắn bị hấp thụ bởi khí quyển khi đến bề mặt trái đất Năm sau, Walther Noel Hartley mô tả chi tiết sự hấp thụ UV của O3 với bước sóng 200 nm.
Vào năm 1880, Chappuis phát hiện ra sự hấp thụ của ozone (O3) trong vùng khả kiến từ 400 đến 840 nm, cho thấy sự hiện diện của nó trong bầu khí quyển Đến năm 1925, Dobson đã phát triển một máy quang phổ mới, sử dụng lăng kính bằng thạch anh, mang lại độ ổn định cao hơn trong việc đo lường ozone.
1.2.2 Đại cương về quang phổ
Trong quang phổ học, bức xạ bao gồm ánh sáng nhìn thấy, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia Rơnghen và sóng radio, tất cả đều được gọi là bức xạ điện từ Theo thuyết sóng, bức xạ này là dao động của cường độ điện trường và từ trường Bên cạnh đó, thuyết hạt cho thấy bức xạ bao gồm các photon, những "hạt năng lượng" chuyển động với tốc độ ánh sáng Mỗi dạng bức xạ có năng lượng photon khác nhau, và năng lượng này được lượng tử hóa, tức là không liên tục mà tỉ lệ với tần số dao động điện từ theo hệ thức Planck.
Louis de Broglie đã phát triển thuyết thống nhất giữa sóng và hạt trong ánh sáng, chỉ ra rằng ánh sáng có cả tính chất sóng lẫn tính chất hạt Khái niệm này được mở rộng hơn nữa để mô tả bức xạ với bản chất sóng-hạt Cụ thể, một hạt có khối lượng m chuyển động với vận tốc v sẽ có bước sóng liên quan là , được xác định bởi một hệ thức nhất định.
Trong đó: p = mv là động lượng của hạt λ là bước sóng (de Broglie) h = 6,625.10 -34 J.s là hằng số Planck
1.2.3 Các đại lượng đo bức xạ điện từ bao gồm:
• Bước sóng : Là quãng đường mà bức xạ đi được sau mỗi dao động đầy đủ Đơn vị: m, cm, m, nm, A o (1cm = 10 8 A o = 10 7 m 4 m)
• Tần số : Là số dao động trong một đơn vị thời gian (giây)
Trong 1 giây bức xạ đi được c cm và bức sóng cm, vậy: = c/
Lưu ý: Bức xạ truyền trong chân không với vận tốc c = 2,9979.10 8 m/s (thường lấy tròn 3.10 8 m/s) Đơn vị: CPS (vòng dây), Hz, KHz, MHz (1CPS=1Hz; 1MHz 3 KHz 6 Hz)
Năng lượng bức xạ được phát ra hoặc hấp thụ bởi các dao động tử, như phân tử, thông qua các lượng tử năng lượng, tức là các đơn vị năng lượng rời rạc Các đơn vị đo lường năng lượng này bao gồm Jun (J), Calo (Cal) và electron volt (eV).
Bức xạ điện từ là một dãy sóng điện từ có bước sóng thay đổi từ cỡ mét ở sóng rađio đến cỡ angstrom (10^-10 m) ở tia Rơnghen và thậm chí nhỏ hơn Dãy sóng này được phân chia thành nhiều vùng phổ khác nhau.
Hình 1.2 Các phổ của sóng điện từ
Mắt người chỉ có khả năng nhận diện một phần nhỏ của phổ điện từ, được gọi là vùng nhìn thấy, với bước sóng từ 396 đến 760 nm Hai vùng liền kề với vùng nhìn thấy là vùng hồng ngoại và vùng tử ngoại (UV).
1.2.5 Sự tương tác giữa vật chất và bức xạ điện từ
Các phân tử và nhóm phân tử của các chất, đơn chất hay hợp chất được cấu tạo từ các nguyên tử thông qua các liên kết hóa học nhất định giữa các điện tử hóa trị Mặc dù có nhiều loại chất, nhưng chỉ có ba loại liên kết hóa học chính: liên kết xicma (σ), liên kết pi (π) và liên kết cho nhận Nếu phân tử chứa chất dị tố, có thể xuất hiện thêm một đôi điện tử chưa liên kết, ký hiệu là n.
Trong phân tử, các liên kết sigma có năng lượng thấp nhất, tiếp theo là các liên kết pi và các đôi điện tử tự do n Dưới điều kiện bình thường, chúng tồn tại ở dạng bền và nghèo năng lượng Khi bị chiếu sáng bởi chùm sáng kích thích, các phân tử hấp thụ hoặc phát xạ năng lượng, dẫn đến việc chuyển sang trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn Theo cơ học lượng tử, trong trạng thái cơ bản, các điện tử được sắp đầy trong các obitan liên kết sigma, pi và n, tất cả đều có mức năng lượng thấp trong phân tử.
Các electron hóa trị trong các phân lớp p, d, f tham gia vào các liên kết p-p, d-d, f-f, d-p và d-f, tạo ra các liên kết loại σ và π trong phân tử Đồng thời, một số nguyên tử vẫn giữ các đôi electron tự do n, và khi bị kích thích, chúng có thể chuyển lên các mức năng lượng cao hơn.
Khi phân tử bị kích thích, năng lượng giữa hai mức năng lượng cơ bản và kích thích chính là năng lượng mà phân tử hấp thụ từ nguồn sáng kích thích Năng lượng này được tính theo công thức: ΔE = E2 – E1 = hν = (h.c/λ).
Trong đó, E1 và E2 là mức năng lượng của phân tử ở trạng thái đầu và trạng thái cuối
(hay còn gọi là trạng thái kích thích) là tần số của bức xạ điện từ bị hấp thụ hay phát xạ ra
Hình 1.3 Sự hấp thụ (A) hoặc phát xạ (B) năng lượng của một photon
- Nếu E > 0 thì xảy ra sự hấp thụ bức xạ điện từ
- Nếu E < 0 thì xảy ra sự phát xạ năng lượng
Theo thuyết lượng tử, năng lượng giữa các phân tử và bức xạ điện từ được trao đổi một cách gián đoạn, không liên tục Điều này có nghĩa là phân tử chỉ có thể hấp thụ hoặc phát xạ năng lượng theo các mức lượng tử nhất định, cụ thể là 0 hoặc 1.
NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ UV-VIS
Quang phổ UV-VIS là gì
Quang phổ UV-VIS là một kỹ thuật phân tích quan trọng, cho phép đo lường các bước sóng tia UV hoặc ánh sáng nhìn thấy được mà mẫu hấp thụ hoặc truyền qua, so với mẫu chuẩn hoặc mẫu trắng Kết quả đo này cung cấp thông tin giá trị về thành phần và nồng độ các chất có trong mẫu, giúp phản ánh chính xác tính chất của nó.
Nguyên lý hoạt động của máy quang phổ UV-VIS
Hình 2.1 Sơ đồ đơn giản của các thành phần chính trong máy quang phổ UV-Vis
Nguồn ảnh: Tiến sĩ Justin Tom
Để đảm bảo hiệu quả trong quang phổ học, cần có nguồn sáng ổn định phát ra ánh sáng trên nhiều bước sóng Chùm bức xạ từ đèn là nguồn sáng chính cho máy quang phổ, với đèn xenon thường được sử dụng cho dải UV và dải nhìn thấy Tuy nhiên, đèn xenon có giá thành cao và độ ổn định kém hơn so với đèn vonfram và đèn halogen Trong các thiết bị sử dụng hai loại đèn, đèn vonfram hoặc halogen thường chiếu sáng cho vùng nhìn thấy, trong khi đèn đơteri là nguồn phổ biến cho tia UV Do cần hai nguồn sáng khác nhau để quét cả tia UV và ánh sáng nhìn thấy, quá trình chuyển đổi nguồn sáng thường diễn ra từ 300 đến 350 nm, nơi mà ánh sáng từ cả hai nguồn tương tự nhau, giúp quá trình chuyển đổi diễn ra suôn sẻ Đèn đơteri được cấu tạo từ một sợi đốt phủ ôxit và một cực kim loại trong bóng thủy tinh chứa khí Deuteri hoặc hydro, với cửa sổ bằng thạch anh cho phép bức xạ tử ngoại phát ra.
Khi sợi đốt được đốt nóng, electron sinh ra sẽ kích thích các phân tử khí đơteri (hoặc hidro), biến chúng thành nguyên tử và phát ra photon Quá trình này tạo ra bức xạ với bước sóng từ 160 nm đến vùng khả kiến, cho thấy sự không truyền qua được của thủy tinh đối với các bước sóng này.
Bảng 2.1 Nguồn phát năng lượng trong các thiết bị quang phổ
Trong bước tiếp theo, cần chọn các bước sóng ánh sáng phù hợp với loại mẫu và chất phân tích để kiểm tra, thay vì sử dụng các bước sóng rộng từ nguồn sáng phát ra Các phương pháp hiện có cho việc này bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau.
Bộ đơn sắc có nhiệm vụ tách bức xạ đa sắc thành bức xạ đơn sắc, bao gồm các thành phần như kính lọc, lăng kính và cách tử Việc chọn bước sóng ánh sáng mong muốn thường dựa vào cách tử nhiễu xạ có thể xoay, cho phép điều chỉnh góc tới và góc phản xạ.
Cách tử là một bảng kim loại như nhôm, đồng, bạc hoặc vàng, được thiết kế với các rãnh tam giác song song Tần số rãnh của cách tử nhiễu xạ được đo bằng số rãnh trên mỗi mm, với tần số cao hơn mang lại độ phân giải quang học tốt hơn nhưng dải bước sóng sử dụng hẹp hơn Ngược lại, tần số rãnh thấp hơn cho phép dải bước sóng rộng hơn nhưng độ phân giải quang học kém hơn Đối với mục đích quang phổ UV-VIS, thường sử dụng khoảng từ 300 đến 2000 rãnh trên mm, trong đó tối thiểu là 1200 rãnh trên mm là phổ biến.
Cách tử tạo ánh sáng đơn sắc được ưa chuộng hiện nay nhờ vào những ưu điểm nổi bật như độ phân giải tốt, tán sắc tuyến tính và độ rộng dải ổn định Việc chọn bước sóng trở nên đơn giản, cùng với thiết kế gọn nhẹ và dễ chế tạo Đối với cách tử sử dụng cho UV/Vis, có khả năng đạt tới 1200 vạch/mm, với dải vạch thường dao động từ 300 đến 3600 vạch/mm, cho phép năng suất phân giải cao hơn khi số vạch tăng lên.
Lăng kính littrow (30 độ) bằng thạch anh trong máy quang phổ cho phép ánh sáng đi qua hai lần nhờ phản xạ ở mặt sau, giúp cải thiện độ chính xác trong phân tích Để giảm thiểu nhiễu của vân phổ, việc chọn bước nhảy của bước sóng (bandwidth) phù hợp với từng hợp chất là rất quan trọng.
Hình 2.2 Mức độ nhiễu ở các độ dài Bandwidth khác nhay
Bộ lọc hấp thụ thường được làm bằng thủy tinh màu hoặc nhựa được thiết kế để hấp thụ các bước sóng ánh sáng cụ thể 2
Bộ lọc lưỡng sắc, hay còn gọi là bộ lọc nhiều lớp, được chế tạo từ các lớp vật liệu điện môi, nơi diễn ra hiện tượng giao thoa giữa các lớp mỏng Những bộ lọc này có khả năng loại bỏ các bước sóng không mong muốn thông qua cơ chế can thiệp triệt tiêu, do đó chúng hoạt động như một bộ chọn bước sóng hiệu quả.
Bộ lọc ngắt cho phép ánh sáng với bước sóng nhất định đi qua, có thể là ánh sáng ở dưới (đường tắt) hoặc ở trên (đường dài) Thường thì, các bộ lọc này được chế tạo bằng cách sử dụng các bộ lọc nhiễu.
Bộ lọc thông dải cho phép truyền qua một dải bước sóng nhất định bằng cách kết hợp các bộ lọc thông ngắn và thông dài.
Bộ khuếch đại đơn sắc là thiết bị phổ biến nhất trong quá trình quang phổ nhờ tính linh hoạt cao Để nâng cao độ chính xác của phép đo và cải thiện tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, các bộ lọc thường được sử dụng kết hợp với bộ đơn sắc nhằm thu hẹp các bước sóng ánh sáng được chọn.
Dù bạn chọn bước sóng nào cho máy quang phổ, ánh sáng sẽ truyền qua mẫu Đối với tất cả các phép phân tích, việc đo mẫu chuẩn là rất quan trọng.
Mẫu trắng là yếu tố bắt buộc trong các thí nghiệm quang phổ UV-VIS Khi sử dụng dung dịch đệm trong nước chứa mẫu để đo, cần đảm bảo rằng dung dịch đệm không chứa chất cần quan tâm làm chuẩn Đối với việc kiểm tra môi trường nuôi cấy vi khuẩn, môi trường nuôi cấy vô trùng sẽ được dùng làm mẫu chuẩn Tín hiệu mẫu chuẩn này sẽ được thiết bị tự động sử dụng để thu thập các giá trị độ hấp thụ thực của chất phân tích Việc nắm rõ các vật liệu và điều kiện thí nghiệm là rất quan trọng; chẳng hạn, cuvet bằng nhựa không thích hợp cho nghiên cứu hấp thụ tia cực tím do khả năng hấp thụ của nó Thủy tinh có thể hoạt động như bộ lọc, hấp thụ phần lớn UVC và UVB nhưng cho phép một số tia UVA đi qua, trong khi cuvet thạch anh cho phép bức xạ từ 190 nm trở lên đi qua.
Không khí hoạt động như một bộ lọc ánh sáng, hấp thụ các bước sóng ngắn hơn 200 nm do oxy phân tử Để đo các bước sóng này, cần một thiết lập đặc biệt và tốn kém, thường sử dụng hệ thống quang học chứa khí argon tinh khiết Ngoài ra, còn có các hệ thống không cuvet cho phép phân tích các mẫu rất nhỏ, như trong nghiên cứu DNA hoặc RNA.
Sau khi ánh sáng đi qua mẫu, một máy dò (detector) sẽ chuyển đổi ánh sáng thành tín hiệu điện tử có thể đọc được Máy dò này sử dụng lớp phủ quang điện hoặc chất bán dẫn để đo tín hiệu ánh sáng trước và sau khi đi qua dung dịch trong cuvet Tín hiệu từ detector sẽ được khuếch đại bởi bộ xử lý tín hiệu (signal processor), sau đó lưu trữ và xử lý trên máy tính Có hai loại detector chính: bộ cảm biến photon (photon transducer) và bộ cảm biến nhiệt (thermal transducer).
Bảng 2.2 Đặc tính của một số bộ chuyển đổi tín hiệu (transducer)
Trình tự phép đo quang phổ UV-VIS
Phổ hấp thụ phân tử trong vùng UV-VIS (200 - 800nm) phản ánh khả năng hấp thụ ánh sáng của các chất tan trong dung dịch đồng thể, bao gồm các dung môi như nước, methanol, benzen, toluen và chloroform Ngoài ra, một số chất như khí CH4 và NH3 cũng có thể được phân tích ở trạng thái hơi Để thực hiện phép đo phổ này, cần tuân thủ các bước chuẩn bị và thực hiện cụ thể.
Để tiến hành phân tích bằng phương pháp phổ hấp thụ UV-VIS, chất phân tích cần được hòa tan trong dung môi phù hợp, như phenol, naphtalen, anthracene cho các chất hữu cơ, hoặc I2, muối cromat, pemanganat cho các chất vô cơ Nếu chất cần xác định không có phổ UV-VIS, có thể sử dụng thuốc thử R trong điều kiện thích hợp để tạo hợp chất phức, giúp tăng độ nhạy trong phép đo Đối với mẫu khí, cần đưa vào ống cuvet kín để thực hiện đo trong buồng quang phổ.
Khi chiếu một chùm tia sáng có năng lượng phù hợp vào cuvet chứa dung dịch mẫu, các hợp chất phân tích hoặc sản phẩm phức sẽ hấp thụ bức xạ, từ đó tạo ra phổ hấp thụ phân tử.
Ánh sáng từ nguồn sáng được chiếu qua cuvet, sau đó phân ly phổ để chọn một hoặc hai bước sóng hấp thụ cực đại của chất phân tích Tiếp theo, cường độ hấp thụ quang A của chất đó được đo trong các điều kiện đã được xác định trước.
Để ghi lại giá trị độ hấp thụ quang, có thể sử dụng nhiều công cụ khác nhau như đồng hồ đo năng lượng hấp thu và máy tự ghi.
Các thế hệ máy phổ hiện nay được kết nối với máy tính, giúp việc ghi phổ trở nên dễ dàng nhờ các chương trình đo tự động Người dùng có thể lưu trữ, đối chiếu và so sánh phổ khi cần thiết Để đảm bảo độ tin cậy và tính thực tiễn, việc lặp lại các thí nghiệm và phép đọc quang phổ là rất quan trọng.
Khi thực hiện kiểm tra UV-Vis, cần lặp lại ít nhất ba lần để đảm bảo độ chính xác và chất lượng cao của các phép đo Đối với một số lĩnh vực cụ thể, có thể cần nhiều lần lặp lại hơn Kết quả thường được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình kèm theo độ lệch chuẩn, giúp xác định nồng độ của mẫu chưa biết Độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối và hệ số biến thiên là những chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ chính xác của hệ thống đo lường Độ lệch hoặc biến thiên thấp cho thấy độ tin cậy và chính xác cao hơn trong các kết quả thu được.
Một số phương pháp định lượng bằng phổ hấp thụ phân tử UV-VIS
2.4.1 Phương pháp dãy tiêu chuẩn
Chuẩn bị 10 – 15 ống nghiệm so màu có đường kính và chất lượng thủy tinh đồng nhất, sau đó cho dung dịch chuẩn của cấu tử cần định lượng vào các ống nghiệm với các lượng khác nhau và pha loãng đến thể tích giống nhau Thêm lượng thuốc thử như nhau vào tất cả ống nghiệm và tiến hành chế hoá để chuyển cấu tử thành hợp chất màu Dung dịch nghiên cứu cũng được chuẩn bị tương tự So sánh màu của dung dịch nghiên cứu với các dung dịch chuẩn; nếu màu của dung dịch nghiên cứu trùng với một dung dịch chuẩn, lượng chất X trong đó sẽ bằng lượng chất X trong dung dịch chuẩn Nếu không trùng màu mà nằm giữa hai dung dịch chuẩn, hàm lượng chất X trong dung dịch phân tích sẽ gần bằng giá trị trung bình cộng của hai dung dịch chuẩn.
Để đạt được kết quả chính xác hơn trong một số trường hợp, cần chuẩn bị một dãy dung dịch tiêu chuẩn trung gian Dãy dung dịch này được pha chế tương tự như trước, với hàm lượng chất X trong dung dịch chuẩn thay đổi trong khoảng giữa hai dung dịch có màu gần giống với dung dịch phân tích Sau đó, tiến hành so sánh màu sắc như đã thực hiện trước đó.
Phương pháp này yêu cầu dung dịch tiêu chuẩn có màu sắc bền Tuy nhiên, màu sắc của các dung dịch thường bị phai theo thời gian, do đó cần phải pha lại dãy dung dịch chuẩn.
23 thường xuyên Để khắc phục nhược điểm này người ta dùng các dung dịch màu giả và bộ kính thuỷ tinh màu chuẩn
Phương pháp dãy tiêu chuẩn là một kỹ thuật hữu ích để xác định các dung dịch có sự hấp thu ánh sáng không tuân theo định luật Beer, với ưu điểm là thực hiện nhanh chóng và không cần dụng cụ phức tạp Tuy nhiên, nhược điểm lớn của phương pháp này là chỉ cung cấp nồng độ gần đúng của dung dịch nghiên cứu Ngoài ra, các dung dịch chuẩn thường không bền, dẫn đến việc phải thay thế bằng các dung dịch giả, gây khó khăn trong việc lựa chọn màu sắc phù hợp với hàm lượng chất cần phân tích Phương pháp này chủ yếu được áp dụng để phân tích hàng loạt mẫu.
Khi phân tích hàng loạt mẫu, dùng phương pháp đường chuẩn sẽ cho phép phân tích và tính toán kết quả khá nhanh
Trước hết phải pha chế một dãy dung dich chuẩn rồi tiến hành đo D của dãy dung dịch và lập đồ thị D = f(C) gọi là đường chuẩn
Sau khi hoàn thành việc lập đồ thị chuẩn, tiến hành pha chế các dung dịch cần xác định trong điều kiện tương tự như khi xây dựng đường chuẩn Sau đó, đo mật độ quang của các dung dịch này dưới cùng điều kiện đo đã sử dụng để tạo ra đường chuẩn Dựa vào các giá trị Dx đo được, có thể sử dụng đồ thị chuẩn để tính toán kết quả.
Đường chuẩn này có thể sử dụng trong thời gian dài, nhưng cần được hiệu chỉnh hàng ngày để đảm bảo phù hợp với điều kiện thí nghiệm của mỗi ngày.
Phương pháp này nhanh chóng, kinh tế và cho kết quả chính xác nhờ khả năng xác định hàng loạt mẫu Tuy nhiên, để đo D, cần sử dụng máy móc, và độ chính xác của máy càng cao thì độ tin cậy của kết quả càng lớn, đồng thời sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch phải tuân theo định luật Beer.
Để xác định hàm lượng chất nghiên cứu Cx trong dung dịch, tiến hành phản ứng hiện màu với thuốc thử R dưới điều kiện đã chọn, sau đó đo mật độ quang thu được giá trị Dx.
Lấy một lượng dung dịch nghiên cứu, sau đó thêm một lượng xác định dung dịch chuẩn của chất nghiên cứu (Ca) Tiến hành phản ứng hiện màu và đo mật độ quang trong các điều kiện giống như trước đó để thu được giá trị Da.
Theo định luật Beer ta có: Dx = bCx Da = b(Cx + Ca)
Phương pháp này giúp loại bỏ ảnh hưởng của các ion lạ trong dung dịch nghiên cứu và thường được sử dụng để xác định khi hàm lượng chất X thấp Đặc biệt, nó còn hỗ trợ kiểm tra độ lặp lại của phương pháp.
Chuẩn bị một loạt dung dịch chứa lượng chất phân tích X đồng nhất, sau đó bổ sung các lượng khác nhau từ dung dịch chuẩn chứa chất phân tích đó Tiến hành thực hiện phản ứng tạo màu trong điều kiện tối ưu đã xác định Cuối cùng, đo mật độ quang của các dung dịch để thu thập dữ liệu.
Dựng đồ thị D theo hàm lượng C1, C2, C3, C4, C5 Ngoại suy ta sẽ tính được Cx
2.4.5 Phương pháp đo quang vi sai
Việc đo mật độ quang ở giá trị A lớn có thể dẫn đến sai số lớn trong xác định nồng độ Để khắc phục tình trạng này, người ta sử dụng phương pháp đo vi sai, trong đó mật độ quang của dung dịch cần đo không được so sánh với dung môi hay dung dịch trống Thay vào đó, dung dịch so sánh là dung dịch có nồng độ biết trước Css, với mật độ quang của Css phải lớn hơn dung môi hoặc dung dịch trống, nhưng vẫn nhỏ hơn mật độ quang của dung dịch cần đo.
Các nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luận Lambert-Beer
Định luật Bouguer-Lambert-Beer được biểu diễn qua công thức A = εlC, trong đó A phụ thuộc vào các yếu tố như bước sóng ánh sáng (λ), độ dày của cuvet (l) và nồng độ dung dịch (C) Khi sử dụng cuvet có bề dày l cm không đổi, các yếu tố này sẽ ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch phức màu.
1 Do ánh sáng không đơn sắc:
Giả sử dòng sáng tới có cường độ I0 không phải là tia đơn sắc mà là một chùm tia với bốn tia I01, I02, I03, I04, thì I0 = I01 + I02 + I03 + I04 Nếu chất nghiên cứu chỉ hấp thụ I02 và không hấp thụ các tia còn lại, thì khi ánh sáng ra khỏi dung dịch, ta có I = I01 + I03 + I04.
Nếu tăng nồng độ C lên I2 sẽ giảm và nếu tăng C tới mức độ hấp thụ hoàn toàn I02 tức là
I2 = 0, khi đó độ hấp thụ quang A của dung dịch không đổi mặc dù C tăng
Đường biểu diễn A = f(C) sẽ không còn tuyến tính, do đó, các máy đo quang chính xác cần có nguồn sáng phát ra dải sóng tập trung quanh một bước sóng cụ thể Việc chọn lựa bước sóng phù hợp tại đỉnh hấp thụ của chất nghiên cứu là điều tối ưu.
2 Các điều kiện đo A, như bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt cuvet không thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ, như tán xạ hấp phụ …
3 Các yếu tố làm sai lệch nồng độ C thực của chất cần đo độ hấp thụ quang, nguyên nhân của các sai lệch này có thể:
Sự phân li của các phân tử chất đo quang phụ thuộc vào nồng độ, với độ phân li α = f(C), điều này có nghĩa là khi nồng độ C thay đổi, độ phân li α cũng sẽ thay đổi Để khắc phục vấn đề này, các hợp chất đo quang cần phải là những hợp chất hoặc phức chất rất bền, nhằm đảm bảo rằng sự phân li của chúng là rất nhỏ và không đáng kể.
Môi trường pH của dung dịch màu có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành, độ bền và sự tồn tại của các hợp chất, đặc biệt là những hợp chất chứa gốc axit hoặc bazơ yếu Chẳng hạn, phức Fe(CNS)3 chỉ bền và tồn tại trong môi trường axit với nồng độ từ 0,01M đến 2M Khi pH lớn hơn 3, phức này sẽ bị thủy phân thành muối bazơ và Fe(OH)3, dẫn đến việc dung dịch mẫu trở thành hỗn hợp của phức Fe(CNS)3 và Fe(OH)3.
Muối bazơ của sắt như Fe(OH)(CNS)2 và Fe(OH)2(CNS) có thể gây sai số lớn trong kết quả đo Mỗi hợp chất phức màu chỉ ổn định trong các điều kiện nhất định, với thành phần và giá trị xác định, tồn tại trong một khoảng pH thích hợp Sự ổn định này liên quan đến hằng số phân li Ka hoặc Kb của thuốc thử R Nếu R là gốc của các axit hoặc bazơ yếu, thì pH (nồng độ H+) sẽ ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành phức XnRm Thuốc thử R thường là các axit yếu, vì vậy có thể kiểm soát nồng độ R bằng cách thiết lập giá trị pH, và giá trị pH cần thiết có thể được tính toán dựa trên hằng số phân li của axit HR.
Để đảm bảo phản ứng tạo phức giữa thuốc thử R và chất phân tích X diễn ra hoàn toàn, thường cần thêm một lượng dư thuốc thử R Tuy nhiên, nếu lượng dư quá nhiều, có thể dẫn đến phản ứng phụ, tạo ra các hợp chất không mong muốn hoặc làm mất chất phân tích, gây sai số lớn trong phép định lượng Do đó, việc khảo sát cụ thể để xác định lượng thuốc thử dư tối ưu cho từng phản ứng là rất cần thiết.
Sự hiện diện của các ion và chất lạ trong dung dịch mẫu có thể ảnh hưởng đến quá trình tạo phức của XR và khả năng hấp thụ ánh sáng của nó Những ảnh hưởng này thể hiện qua việc các chất lạ có thể tạo ra phổ hấp thụ chen lấn, tạo phức tương tự với chất phân tích, hoặc làm giảm khả năng hình thành phức cần đo Để loại trừ những chất có phổ ảnh hưởng, có thể áp dụng một số biện pháp thích hợp.
Thêm chất che vào mẫu giúp giảm khả năng hấp thụ của các chất gây ảnh hưởng, hoặc chuyển dịch sự hấp thụ ra vùng xa, nơi không còn phổ của chất nhiễu Các chất che có thể tạo ra phản ứng như tạo phức, kết tủa để lọc bỏ, hoặc sử dụng phản ứng oxi hóa khử để thay đổi dạng ion tồn tại, từ đó tạo ra các chất có hóa trị khác không gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
- Chọn pH Thay đổi môi trường pH của dung dịch mẫu, để hạn chế sự hấp thụ của các chất khác
- Đổi dung môi hòa tan mẫu Thay đổi dung môi hòa tan mẫu đo phổ, như chiết chất phân tích hay phức của nó vào một dung môi khác…
Khi lựa chọn vùng đo khác cho chất phân tích, có thể gặp phải độ hấp thụ kém, tuy nhiên điều này sẽ không bị ảnh hưởng bởi phổ của các chất khác có trong mẫu.
Nếu các biện pháp đã áp dụng không mang lại kết quả khả quan, việc tách bỏ các chất gây ảnh hưởng khỏi mẫu là cần thiết trước khi tiến hành xác định.
4 Ảnh hưởng của yếu tố thời gian:
Nhiều hợp chất phức màu cho thấy độ hấp thụ UV-VIS tăng theo thời gian và đạt đến mức ổn định, trong khi một số chất khác lại giảm nhanh sau một thời gian Một số hợp chất có khả năng hấp thụ tốt ngay từ đầu nhưng lại mất đi khả năng này chỉ sau một thời gian ngắn Do đó, việc chọn thời gian đo phù hợp cho từng chất là rất quan trọng Để làm điều này, cần khảo sát sự phụ thuộc của mật độ quang A vào thời gian t, từ đó xác định thời gian đo tối ưu sau khi phản ứng tạo phức màu xảy ra.
5 Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến cường độ hấp thụ UV-VIS của các chất, nhưng mức độ ảnh hưởng này không lớn Trong khoảng nhiệt độ từ 25-40 độ C, nhiều chất thường có phổ hấp thụ UV-VIS ổn định Khi nhiệt độ tăng, độ hấp thụ ban đầu có tăng nhưng chậm, và sau một giá trị nhất định sẽ không đổi; nếu tiếp tục tăng, khả năng hấp thụ có thể bị mất Yếu tố nhiệt độ chủ yếu ảnh hưởng đến độ bền của các hợp chất phức, vì khi nhiệt độ tăng, các phức, đặc biệt là các phức của ion kim loại với phối tử hữu cơ, thường dễ bị phân hủy hoặc thay đổi dạng Do đó, cần kiểm soát nhiệt độ ổn định trong quá trình thí nghiệm.
6 Ảnh hưởng của chất nền của mẫu:
Các chất nền có thể ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của chất phân tích hoặc hợp chất phức đo quang, với sự tác động này thường được thể hiện qua hai yếu tố chính.
• Tạo ra phổ nền và gây nhiễu làm giảm độ nhạy của chất chính
Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp quang phổ UV-VIS
Kỹ thuật quang phổ UV-VIS không hoàn hảo, nhưng nó sở hữu một số ưu điểm nổi bật khiến nó trở nên phổ biến Những điểm mạnh này bao gồm khả năng phân tích nhanh chóng, độ nhạy cao và tính linh hoạt trong ứng dụng, góp phần vào việc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và công nghiệp.
• Kỹ thuật này không phá hủy, cho phép sử dụng lại mẫu hoặc tiếp tục xử lý hoặc phân tích thêm
• Các phép đo có thể được thực hiện nhanh chóng, cho phép dễ dàng tích hợp vào các giao thức thử nghiệm
• Các công cụ rất dễ sử dụng, yêu cầu người dùng ít đào tạo trước khi sử dụng
• Phân tích dữ liệu thường yêu cầu xử lý tối thiểu, một lần nữa có nghĩa là cần ít đào tạo người dùng
• Thiết bị này thường không đắt để mua và vận hành, giúp nhiều phòng thí nghiệm có thể sử dụng được
Mặc dù điểm mạnh của kỹ thuật này có vẻ áp đảo, nhưng cũng có một số điểm yếu nhất định:
Ánh sáng lạc hướng là một yếu tố quan trọng cần xem xét trong thiết bị đo quang học Các bộ chọn bước sóng không hoàn hảo có thể cho phép một lượng nhỏ ánh sáng từ dải bước sóng rộng truyền qua, dẫn đến sai số đo nghiêm trọng Ngoài ra, ánh sáng lạc hướng cũng có thể xuất phát từ môi trường xung quanh hoặc từ các thành phần lắp lỏng trong thiết bị, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả đo.
Tán xạ ánh sáng là hiện tượng xảy ra khi các chất rắn lơ lửng trong mẫu chất lỏng, có thể dẫn đến sai số nghiêm trọng trong đo lường Sự hiện diện của bong bóng trong cuvet hoặc mẫu cũng gây ra tán xạ ánh sáng, làm cho kết quả không thể thu được.
Sự giao thoa giữa nhiều loài hấp thụ dẫn đến việc một mẫu có thể chứa nhiều loại diệp lục sắc tố xanh lục Các chất diệp lục khác nhau sẽ tạo ra các phổ chồng lên nhau khi được kiểm tra cùng nhau trong cùng một mẫu Để thực hiện phân tích định lượng chính xác, cần phải tách riêng từng loại hóa chất ra khỏi mẫu và kiểm tra chúng một cách riêng lẻ.
Khi sử dụng thiết bị, việc chú ý đến yếu tố hình học là rất quan trọng, vì vị trí không chính xác của bất kỳ bộ phận nào, đặc biệt là cuvet chứa mẫu, có thể dẫn đến kết quả sai lệch Tất cả các thành phần trong thiết bị cần được căn chỉnh và đặt ở cùng một vị trí cho mỗi phép đo để đảm bảo độ chính xác Do đó, người sử dụng cần được đào tạo cơ bản nhằm tránh những sai sót trong quá trình sử dụng.
Ứng dụng của phương pháp quang phổ trong phân tích
Định tính là phương pháp thường được sử dụng để xác định các chất hữu cơ bằng cách so sánh giá trị λmax và ɛ giữa chất chuẩn và mẫu Để nâng cao độ chính xác trong quá trình xác định, cần kết hợp thêm các phương pháp phân tích khác như phổ hồng ngoại và khối phổ.
Định lượng là phương pháp quan trọng trong việc phân tích định lượng các chất trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, môi trường, sinh học và công nghiệp Phương pháp hấp thu quang được ứng dụng rộng rãi trong các ngành này, giúp xác định nồng độ các chất một cách chính xác và hiệu quả.
- Hàm lượng P tổng trong mẫu phân bón, hàm lượng Ti trong mẫu sơn, hàm lượng
Nd trong mẫu thủy tinh, hàm lượng Mn, Ti trong thép
- Hàm lượng kim loại nặng (nhôm, asen, cadmi, crom, sắt, chì, mangan…), ion vô cơ (amoni, nitrat, phosphat…) trong nước và nước thải
- Hàm lượng thiomersal, nhôm, formaldehyde tồn dư, protein, phenol… trong vắc xin và sinh phẩm
Phân tích DNA và RNA
Xác minh nhanh chóng độ tinh khiết và nồng độ của RNA và DNA là ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu sinh học Bảng 2.3 tóm tắt các bước sóng sử dụng trong phân tích RNA và DNA, cùng với ý nghĩa của chúng Khi chuẩn bị mẫu DNA hoặc RNA cho các ứng dụng như giải trình tự, cần đảm bảo rằng không có sự nhiễm bẩn từ các nguồn khác, bao gồm protein hoặc hóa chất từ quá trình phân lập.
Tỷ lệ hấp thụ 260 nm/280 nm (260/280) là chỉ số quan trọng để xác định mức độ nhiễm bẩn trong các mẫu axit nucleic DNA tinh khiết có tỷ lệ 260/280 khoảng 1,8, trong khi RNA tinh khiết có tỷ lệ này là 2,0 Sự khác biệt này xuất phát từ việc thymine trong DNA có tỷ lệ 260/280 thấp hơn uracil trong RNA Ngoài ra, nếu mẫu bị nhiễm protein, tỷ lệ 260/280 sẽ giảm do sự hấp thụ cao hơn ở bước sóng 280 nm.
Bước sóng được sử dụng trong phân tích độ hấp thụ tính bằng nanomet
Sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng này cho thấy sự hiện diện của cái gì?
Nguyên nhân nào gây ra hiện tượng hấp thụ tia cực tím ở bước sóng này?
260 DNA và RNA Adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil
280 Protein Chủ yếu là tryptophan và tyrosine
Bảng 2.3 Tóm tắt độ hấp thụ UV hữu ích khi xác định tỷ lệ độ hấp thụ 260/280 và 260/230
Tỷ lệ hấp thụ Giá trị điển hình
260/280 - 1,8 tỷ lệ độ hấp thụ đặc trưng cho DNA tinh khiết
- Tỷ lệ hấp thụ 2.0 điển hình cho RNA tinh khiết
260/230 - Tỷ lệ hấp thụ thay đổi; 2,15 đến 2,50 điển hình cho RNA và DNA
Bảng 2.4 Tóm tắt tỷ lệ hấp thụ UV dự kiến cho phân tích DNA và RNA
Quang phổ UV-VIS là một công cụ quan trọng trong ngành dược phẩm, cho phép xác định các hợp chất dược phẩm ở nồng độ microgam trên mililit thông qua việc xây dựng hàm hiệu chuẩn cho từng chất Ví dụ, benzocaine và chlortetracycline có thể được xác định đồng thời trong các công thức bột thú y thương mại bằng cách áp dụng dẫn xuất toán học đầu tiên cho phổ độ hấp thụ, cho phép định lượng chính xác cả hai hợp chất trên dải nồng độ này.
Quang phổ UV-VIS là công cụ phổ biến trong nuôi cấy vi khuẩn, với phép đo OD được thực hiện nhanh chóng ở bước sóng 600 nm để ước lượng nồng độ tế bào và theo dõi sự phát triển Bước sóng 600 nm được ưa chuộng nhờ vào các đặc tính quang học của môi trường nuôi cấy vi khuẩn, đồng thời giúp bảo vệ mẫu khỏi hư hại trong các thử nghiệm tiếp theo.
Quang phổ UV-VIS là công cụ hữu ích để xác định các hợp chất trong đồ uống, đặc biệt là hàm lượng caffein, cần tuân thủ các giới hạn pháp lý Phương pháp này cũng cho phép nhận diện các chất màu như anthocyanin trong quả việt quất, mâm xôi và anh đào bằng cách so sánh với các bước sóng hấp thụ đỉnh đã biết, từ đó hỗ trợ kiểm soát chất lượng rượu vang thông qua độ hấp thụ UV-VIS.
Phát hiện tạp chất là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để xác định tạp chất trong các phân tử hữu cơ Qua việc quan sát các đỉnh bổ sung xuất hiện trong mẫu, ta có thể so sánh với đỉnh của nguyên liệu thô tiêu chuẩn Bên cạnh đó, việc đo độ hấp thụ tại một bước sóng cụ thể cũng giúp phát hiện các tạp chất.
Làm sáng tỏ cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
Quang phổ hấp thụ UV rất hữu ích trong việc làm sáng tỏ cấu trúc của các phân tử hữu cơ, giúp phát hiện sự không bão hòa và sự hiện diện của các dị nguyên tử Ngoài ra, phương pháp này còn được sử dụng để xác định định lượng các hợp chất hấp thụ bức xạ UV.
Một số thiết bị trong đo trong quang phổ UV-VIS
Máy so màu đi hiện trường Máy so màu 1 chùm tia Máy so màu 2 chùm tia
Cuvet thạch anh Cuvet thủy tinh Cuvet nhựa
Phương pháp trắc quang là kỹ thuật phân tích dựa trên hiệu ứng hấp thụ khi phân tử tương tác với bức xạ điện từ, chủ yếu trong vùng tử ngoại gần và khả kiến với bước sóng từ 200 đến 800nm Hiện tượng hấp thụ này tuân theo định luật Bouger – Lam bert – Beer, cho phép xác định nhiều hợp chất trong nồng độ rộng nhờ các cải tiến trong thủ tục phân tích Phương pháp này được ưa chuộng vì tính đơn giản và độ tin cậy cao, thường được áp dụng trong kiểm tra sản xuất hóa học, luyện kim, cũng như trong nghiên cứu hóa sinh, môi trường và nhiều lĩnh vực khác.
