Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh loét trên cây chanh của hoạt chất chiết xuất từ cây giao (Euphorbia tirucalli L.) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM  NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CƯU KHẢ NĂNG ƯC CHẾ VI KHUẨN Xanthomonas sp GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY CHANH CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT TỪ CÂY GIAO (Euphorbia tirucalli L.) Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM  NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CƯU KHẢ NĂNG ƯC CHẾ VI KHUẨN Xanthomonas sp GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY CHANH CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY GIAO (Euphorbia tirucalli L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 Cán hướng dẫn: TS Võ Thị Thu Oanh PGS.TS Trần Thị Lệ Minh TP Hồ Chí Minh năm 2022 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bệnh loét chanh bệnh hại nghiêm trọng, gây ảnh hưởng đến chất lượng giá trị thương phẩm Bệnh bệnh công chủ yếu vào cành, non làm cho bị bệnh dễ rụng; bị bệnh xuất vết nứt, rắn, xù xì, khơ, nước, bị biến dạng rụng sớm Theo thống kê tỉnh Long An, mùa khô, bệnh loét gây hại từ 10 ÷ 15%, vào mùa mưa ẩm độ cao, dịch bệnh bùng phát mạnh làm bệnh lây lan nhanh diện rộng khó kiểm sốt Để phịng trừ bệnh này, nông dân thường sử dụng hỗn hợp nhiều loại thuốc BVTV hóa học để trừ lúc với nhiều đối tượng dịch hại khác nhau, hiệu khơng cao, số thuốc có độ độc cao, thời gian cách ly dài, phun nhiều lần/vụ, liều lượng sử dụng cao, số thuốc nằm danh mục cấm, hạn chế sử dụng ăn xuất khẩu, từ dẫn đến sản phẩm khơng an tồn, khơng đạt tiêu chí xuất làm tăng giá trị đầu tư Hiện nay, sản xuất nông nghiệp nước ta phát triển theo hướng hữu nên việc sử dụng tác nhân sinh học, kích kháng thảo mộc để tạo chế phẩm sinh học có hiệu cao, thân thiện với môi trường hướng nghiên cứu quan tâm hàng đầu biện pháp sinh học nhằm bước thay thuốc BVTV hóa học sản xuất nơng nghiệp hữu Cây giao (Euphorbia tirucalli L.) loại thảo mộc thuộc chi Euphorbia, sử dụng y học cổ truyền Việt Nam nước Thế giới Qua dẫn liệu nghiên cứu cho thấy, giao có chứa nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học như: alkaloids, phenolic, tannin, flavonoids terpenoids Dịch chiết từ giao có khả kháng nhiều loại vi khuẩn Gram (-), Gram (+) Trong y học, giao biết đến với tính chữa bệnh như: mụn cóc, ung thư, lậu, viêm khớp, hen suyễn, ho, đau tai, đau dây thần kinh, thấp khớp, đau răng, ….(Cataluna ctv, 1999) Ngoài ra, dịch chiết giao cịn có khả ức chế vi khuẩn X campestris pv campestris; Erwinia carotovora pv carotovora Pseudomonas solanacearum gây bệnh trồng (Liror ctv, 1998) Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ giao để phòng trừ vi khuẩn gây bệnh trồng nông nghiệp Do đó, việc nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ giao để phòng trừ bệnh loét chanh trồng khác điều cần thiết Trên sở đó, luận án “Nghiên cứu khả ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét chanh cao chiết phân đoạn từ giao (Euphorbia tirucalli L.)” Mục tiêu luận án Xác định cấu trúc hóa học, hàm lượng nhóm hoạt chất đánh giá hiệu ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri cao chiết chiết xuất từ giao, làm sở để phát triển chế phẩm sinh học có nguồn gốc thảo mộc quản lý bệnh hại có múi trồng khác có tác nhân vi khuẩn gây Những đóng góp luận án Đã xác định loài vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri gây bệnh loét chanh Long An Trình tự vùng 16S rDNA, hrpW pthA MPL Xanthomonas axonopodis pv citri đăng ký Genebank Đã xác định thành phần hợp chất định lượng nhóm hợp chất phenolic flavonoid cao chiết từ giao Đã xác định cấu trúc hàm lượng hợp chất gallic acid, scopoletin, piperic acid 3,3’,4-tri-Omethylellagic acidtrong cao chiết EA từ giao, hợp chất piperic acid chất cô lập cao chiết EA Đã xác định hoạt tính ức chế cao chiết EA từ giao vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri phịng thí nghiệm hiệu cao chiết EA phòng trừ bệnh loét chanh điều kiện nhà lưới đồng Bố cục luận án Luận án thức gồm 121 trang (khơng bao gồm phụ lục), có chương, 25 bảng số liệu 41 hình Luận án tham khảo tổng cộng 151 tài liệu tài liệu tiếng Việt 147 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Xanthomonas axonopodis gây bệnh loét chanh Bệnh loét có múi gây chi Xanthomonas, có hai nhóm di truyền Một nhóm bắt nguồn từ châu Á Xanthomonas axonopodis pv citri nhóm bắt nguồn từ Nam Mỹ X axonopodis pv aurantifolii Nhóm châu Á gây bệnh loét dạng A tất có múi Nhóm có mặt khắp nơi giới gây thiệt hại nặng nề Ngược lại, tất chủng Nam Mỹ lại giới hạn số ký chủ, X axonopodis pv aurantifolii gây bệnh loét dạng B dạng C chanh Mexico, cam chua, bưởi chùm (Gottwald ctv, 2001) Triệu chứng gây bệnh ký chủ mẫn cảm giống Ngoài ra, Oman, Ả Rập Saudi, Iran, Ấn Độ báo cáo có hai chủng gây bệnh phụ X axonopodis pv citri A* (Vernière ctv, 1998) X axonopodis pv citri AW tìm thấy Florida năm 1999 Hai chủng gây bệnh có phổ ký chủ giống với chủng aurantifolii đặc điểm di truyền giống với citri Vì vậy, chúng khơng ưu tiên xếp vào nhóm hai nhóm (Sun ctv, 2004) 1.2 Một số kết nghiên cứu giới nước vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri bệnh loét vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri có múi Cubero Graham (2002) cho rằng, dựa vào vùng trình tự rDNA với cặp mồi 2/3 đủ để xác định hai nhóm lồi X axonopodis: nhóm (X axonopodis pv citri) gây bệnh loét dạng A nhóm (X axonopodis pv aurantifolii) gây bệnh loét dạng B C Dựa vào vùng trình tự pthA phát nhanh xác vi khuẩn X axonopodis pv citri Việc kết hợp hai cặp mồi 2/3 Jpth1/Jpth2 khắc phục thiếu sót phát chủng AW Cặp mồi J-RXg/JRXc2 không phù hợp để phát X axonopodis pv citri mẫu thực vật Sáu mươi bốn dòng vi khuẩn từ chanh Saudi Arabian phân lập định danh phương pháp giải trình tự vùng 16S rDNA với cặp mồi 27R 1492R Kết quả, so sánh với trình tự vùng 16S rDNA Genbank giới, dòng vi khuẩn phân lập xác đinh X citri subsp citri (Al-Saleh ctv, 2014) Cũng với cặp mồi 27F/1492R nhận diện vùng trình tự 16S rDNA, mẫu phân lập trái cam có kết band PCR với kích thước 1500 bp, so sánh với trình tự Genebank giới tương đồng với X citri subsp citri (CP008989), mức tương đồng 99% (Li ctv, 2015) Ngoài ra, để nhận diện nhanh xác vi khuẩn X axonopodis pv citri, Park ctv (2006) cho sử dụng cặp mồi chuyên biệt XacF/XacR để nhận diện vùng gene hrpW Manyam Nargund (2020) sử dụng cặp mồi Xc-lipF/Xc-lipR để định danh loài mẫu phân lập gây bệnh loét từ có múi dựa vào vùng gene estA Kết PCR thu với kích thước 777 bp, xác định mẫu phân lập X axonopodis pv citri Nhìn chung, lồi vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh loét chanh xác đinh dựa vùng 16S rDNA với cặp mồi 27R 1492R Ngoài ra, vùng gene pthA, hrpW estA sử dụng để định danh loài vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh loét chanh Theo Cubero Graham (2002), việc kết hợp giải trình tự vùng 16S rDNA vùng trình tự gene pthA với cặp mồi Jpth1/Jpth2 xác định nhanh, xác loài X axonopodis pv citri khắc phục thiếu sót định danh đến lồi 1.3 Thành phần hóa học giao (E tirucalli) Theo nghiên cứu trước cho thấy, phận E tirucalli (rễ, thân, mủ) có chứa nhiều nhóm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học như: terpenoids, triterpenes, polyphenols, serine proteases, steroids, flavonoids, isoflavonoids, acids and esters Tuy nhiên, thành phần tỷ lệ hợp chất thứ cấp phụ thuộc vào vị trí địa lý, mùa vụ (Upadhyay ctv, 2010) Theo Yoshida ctv (1991), dịch chiết E tirucalli Nhật Bản có chứa 22 hợp chất: quercitrin; 5-o-caffeoylquinic acid; 3,3’,4-tri-o-methyl-4’-orutinosyl-ellagic acid; tellimagrandin II; genaiin; euphorbin A; tirucallin A; prostratin A; cornusiin B; oenothein C; tirucallin B; corilagin; punicafolin; euphorbin F (21); phenazine derivative; euphorbin E; 1,2,3,4,6-penta-o-galloyl-β-D-glycose Trong đó, dịch chiết giao thu nhận Trung Quốc có chứa hợp chất: 3,3',4-tri-O-methyl-4-O-rutinosyl ellagic acid, gallic acid, 1-O-galloyl-β-D-glucoside, 1,2,3-tri-Ogalloyl-β-D-glucoside, corilagin, pedunculagin, casuariin, quercitrin, putranjivain B, putranjivain A, 3,3'-di-O-methyl gallic acid; 2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside, rutin 5-desgalloylstarchyurin (Lin ctv, 2001) Ở Brazil, dịch chiết E tirucalli có chứa quercetin (1,47 μg/mL), rutin (0,49 μg/mL), gallic acid (30,52 μg/mL), caffeic acid (15,61 μg/mL), chlorogenic acid (12,37 μg/mL), kaempferol (3,45 μg/mL), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) (3,12 μg/mL) (Machado ctv, 2016), malic acid glycoside, ellagic acid (phenolics), mono-caffeoylquinic acid (phenylpropanoid), 2,3-(S)-Hexahydroxydiphenoyl-D-glucose (ellagitannin), acid triterpene (triterpene) (Caxito ctv, 2017) Các hợp chất α-chaconine; linamarin, myricetin, isatin gypsogenin báo cáo có mặt dịch chiết E tirucalli Nam Phi (Choene Motadi, 2016) Ở Malaysia, dịch chiết E tirucalli Malaysia có chứa hợp chất: 4hydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, 4H-Pyran-4-one,2,3dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-pyran-4(4H)-one, 5hydroxymethyl-2-furaldehyde, (E)-2-methoxy-4-(prop-1-enyl) phenol, megastigmatrienone, 2-hydroxy-1-(4isopropylphenyl)-2-methyl-1-propanone, tetradecanoic acid, hexadecanoic acid, linoleic acid, octadecanoic acid, 9,12octadecadienoic acid, ethyl linoleate, spinacene, Vitamin E, ergost-5-en-3-ol,(3β)-, lanosta-8,24-dien-3-ol,(3β), (23S)ethylcholest-5-en-(3β)-ol, liminalol Trong đó, bốn hợp chất có tỷ lệ cao lanosta-8,24-dien-3-ol, (3β)-(13,60%), (23S)-ethylcholest-5-en-(3β)-ol (7,02%), linoleicacid (2,96%), viminalol (2,57 %) (Yusoff ctv, 2017) Ở Việt Nam, Le ctv (2019) phân lập hợp chất từ giao thu nhận Hàm Thuận Bắc, Tỉnh Bình Thuận gồm: arjunolic acid, eriodictyol, quercitrin, afzelin, scopoletin, 3,3’,4’-O-trimethylellagic acid gallic acid 1.4 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh trồng dịch chiết giao (E tirucalli) Bên cạnh đa dạng thành phần hóa học, ứng dụng y học để chữa số bệnh như: mụn cóc, ung thư, lậu, viêm khớp, hen suyễn, ho, đau tai, đau dây thần kinh, thấp khớp, đau răng, … (Gupta ctv, 2013), giao cịn báo cáo có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh cho trồng Năm 1998, Lirio ctv báo cáo dịch chiết nước E tirucalli có khả ức chế năm loại vi khuẩn gây bệnh trồng (X campestris pv campestris; Erwinia carotovora pv carotovora Psuedomonas solanacearum) Theo nhóm tác giả, dịch chiết từ E tirucalli ứng dụng làm thuốc bảo vệ thực vật Dịch chiết nước, ethanol methanol từ thân E tirucalli ức chế vi khuẩn X citri với đường kính vịng ức chế tương ứng 11, 13 17 mm Điều chứng tỏ, hiệu ức chế vi khuẩn chiết xuất E tirucalli dung môi cao nhiều so với nước (Jadhav ctv, 2010) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU 2.1 Nội dung nghiên cứu 1) Phân lập xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét chanh theo hình thái, đặc điểm sinh hóa, trình tự vùng 16S rDNA, hrpW pthA 2) Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp cao chiết phân đoạn từ giao điều kiện in vitro 3) Đánh giá hiệu bệnh loét vi khuẩn X axonopodis gây cao chiết phân đoạn từ giao nhà lưới đồng 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Luận án tiến hành từ tháng 07 năm 2017 đến tháng năm 2021 Thu thập mẫu bệnh loét tiến hành huyện trồng chanh Bến Lức, Đức Huệ Thạnh Hóa Long An Thu thập mẫu giao (Euphorbia tirucalli L.) Phan Thiết, Bình Thuận; Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh; Cujut, Đắk Nơng Tiến hành thí nghiệm phịng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật khoa Khoa học Sinh học, Trường ĐH Nông Lâm, Tp HCM; Bộ mơn Hóa hữu cơ, Trường ĐH Sư phạm Tp HCM; Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam; trung tâm Công nghệ Việt Đức, Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm Tp HCM; khu thực nghiệm, khoa Nông học, Trường ĐH Nông Lâm, Tp HCM; vườn chanh xã Bình Hịa Nam, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An 2.3 Vật liệu nghiên cứu Môi trường phân lập tác nhân thí nghiệm sinh học: NA (Nutrient agar), NB (Nutrient broth), MT gelatin, MT Tween 80, MT casein, MT Urea broth Các loại hóa chất phân tử tách chiết DNA PCR: tinh sản phẩm PCR Gene JET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) Các loại hóa chất thực HPLC: Dung mơi hóa chất tách chiết mẫu: methanol, acid formic Chất chuẩn: acid gallic, độ tinh khiết 97%; scopoletin, độ tinh khiết 99%; acid piperic, độ tinh khiết 97% hãng Sigma 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phân lập xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét chanh theo hình thái, đặc điểm sinh hóa, trình tự vùng 16S rDNA, hrpW pthA 2.4.1.1 Xác định lồi vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh theo hình thái đặc tính sinh hóa Mẫu chanh khơng hạt chanh giấy có triệu chứng bệnh loét thu thập từ vườn huyện Bến Lức, Đức Huệ, Thạnh Hóa, tỉnh Long An, Việt Nam cách tiến hành lấy mẫu theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-141: 2013/BNNPTNT Việc phân lập tác nhân gây bệnh từ mẫu lá, cành chanh có biểu loét thực theo phương pháp Roger Dean (2005) Các đặc điểm sinh hóa khảo sát tiêu chí định danh theo hướng dẫn Schaad ctv (2001), EPPO (2005), ISPM (2014) 2.4.1.2 Kiểm chứng vi khuẩn gây bệnh sau phân lập theo phương pháp chủng bệnh nhân tạo (quy tắc Koch’s) Lá, cành chanh không hạt (C latifolia) chanh giấy (C aurantifolia) chủng bệnh theo phương pháp chủng bệnh nhân tạo (quy tắc Koch’s) Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất bệnh, Tỷ lệ vết bệnh (%), Kích thước vết bệnh chụp SEM 2.4.1.3 Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp dựa vào trình tự vùng 16S rDNA, hrpW pthA Ba cặp primer: 27F (5'AGATTTGATCCTGGCTCAG-3’) 1492R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3') (Lane, 1991); XacF (5’- 10 tương ứng Hiệu suất thu hồi cao chiết phân đoạn từ giao thu nhận ba vùng (Bình Thuận, Đắk Nơng Tp HCM) tính theo cơng thức (Upadhyay ctv, 2010) 2.4.2.3 Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis cao chiết phân đoạn từ giao (Euphorbia tirucalli L.) phịng thí nghiệm Hoạt tính ức chế cao chiết phân đoạn từ giao đánh giá mức 1,25 mg/mL (0,125%), 2,5 mg/mL (0,25%), 5,0 mg/mL (0,5%), 7,5 mg/mL (0,75%) 2.4.2.4 Định tính nhóm hoạt chất cao phân đoạn Đánh giá định tính nhóm chất: alkaloid, flavonoid, tannin, saponin, terpenoid 2.4.2.5 Định lượng phenolic tổng flavonid tổng cao chiết phân đoạn Hàm lượng phenolic flavonoid xác định phương pháp Folin - Ciocalteu theo Waterm Mole (1994) phương pháp tạo màu với AlCl3 môi trường kiềm - trắc quang (Zhishen ctv, 1999) 2.4.2.6 Xác định hợp chất cao phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis Xác định tên hợp chất diện phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 2.4.2.7 Xác định hàm lượng hợp chất có cao chiết phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn X axonopodis cao Hàm lượng hợp chất cao chiết từ giao xác định kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) theo phương pháp Mira ctv (2008) Singh ctv (2010) 2.4.3 Đánh giá hiệu bệnh loét vi khuẩn X axonopodis gây cao chiết phân đoạn từ giao nhà lưới đồng 12 2.4.3.1 Xác định liều lượng ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis điều kiện nhà lưới cao chiết phân đoạn từ giao nồng độ khác Hiệu giảm bệnh loét chanh nhà lưới đánh giá mức: 0,25; 0,5; 0,75 1,0% 2.4.3.2 Đánh giá hiệu phòng trị bệnh loét chanh cao chiết phân đoạn từ giao đồng Hiệu giảm bệnh loét chanh nhà lưới đánh giá mức: 0,5; 0,75, 1,0 1,25% 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu tỷ lệ vết bệnh tổng hợp phần mềm Microsoft Excel Tất số liệu đường kính vịng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp phịng thí nghiệm cao chiết từ giao, hàm lượng phenolic tổng, hàm lượng flavonoid tổng, hiệu xử lý bệnh loét cao chiết từ giao nhà lưới, kích thước trung bình vết bệnh nhà lưới, tỷ lệ bệnh loét, số bệnh loét hiệu lực phòng trừ bệnh lt thử nghiệm ngồi đồng phân tích ANOVA trắc nghiệm phân hạng kiểu DUCAN phần mềm SPSS 20.0 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét chanh theo hình thái, đặc điểm sinh hóa, trình tự vùng 16S rDNA, hrpW pthA 3.1.1 Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh theo hình thái đặc điểm sinh hóa Kết định danh cho thấy, có lồi Xanthomonas gây bệnh lt lá, cành chanh Long An Đặc điểm 75 MPL Xanthomonas gây bệnh loét chanh Long An mô tả chi tiết hình thái sinh hóa nghiên cứu này: Khuẩn lạc trịn, nhỏ, màu vàng nhạt, nhơ, bóng nhầy, bìa ngun mơi trường Nutrient agar (NA) sau 13 72 ni cấy (Hình 3.2 A, B) Trên mơi trường YDC 28oC, khuẩn lạc có màu vàng sáp sau 24 nuôi cấy Khuẩn lạc tiếp tục phát triển gia tăng kích thước, màu vàng đậm, bóng nhày nâng nhiệt độ lên 33oC môi trường YDC (Hình 3.2 C) Theo Schaad ctv (2001), vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas Xylophilus có chung đặc điểm có màu vàng mơi trường YCD 28oC Tuy nhiên, vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas có đặc điểm sau nuôi ủ 28oC 48 chuyển lên nhiệt độ 33oC môi trường YDC, khuẩn lạc tiếp tục phát triển gia tăng kích thước vi khuẩn thuộc chi Xylophilus khơng có đặc điểm Tất MPL có khả chịu mơi trường chứa 1, 3% muối, dương tính với thử nghiệm catalase, thủy phân tinh bột, casein, tween 80, gelatin, âm tính với thử nghiệm oxidase, urea 3.1.2 Kết khảo sát khả gây bệnh MPL theo quy tắc Koch’s Tất MPL có tỷ lệ biểu bệnh 100% Trong đó, MPL BLKL1, BLKQ1 THKQ1 có tỷ lệ biểu bệnh 100% thời điểm NSC A B C 14 D E F Hình 3.3 Triệu chứng bệnh X axonopodis (BLKQ1) gây NSC 15 NSC 15 NSC (A: Quả đối chứng; B: Quả NSC; C: Quả 15 NSC; D: Lá đối chứng; E: Mặt lá; F: Mặt lá) 3.1.3 Xác định loài Xanthomonas sp dựa vào trình tự vùng gene 16S rDNA, hrpW pthA 3.1.3.1 Xác định lồi Xanthomonas sp dựa vào trình tự vùng gene 16S rDNA DNA MPL Xanthomonas nghiên cứu sau tinh sử dụng để khuếch đại vùng 16S rDNA kỹ thuật PCR với cặp primer 27F - 1492R Sản phẩm PCR với primer 27F - 1492R sau điện di gel agarose 1,5% có kích thước khoảng 1500 bp so sánh với thang DNA phù hợp với báo cáo Li ctv (2015) (Hình 3.5) Trình tự vùng 16S rDNA MPL đăng ký trực tiếp ngân hàng liệu Genebank số đăng ký MPL từ MT328595.1 - MT328603.1 15 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR MPL Xanthomonas axonopodis với cặp primer 27F - 1492R (M: thang mẫu chuẩn 250 bp; (-): đối chứng âm; Lane 1-9: BLKQ1, BLKC3, BLKL1, DHHL2, DHHQ2, DHKQ4, THKQ1, THKL1, THKC4) Sơ đồ phân nhóm di truyền MPL nghiên cứu xây dựng theo phương pháp Maximum Composite Likelihood dựa trình tự vùng 16S rDNA thể qua Hình 3.6 Kết phân tích cho thấy có khác biệt di truyền vùng trình tự 16S rDNA MPL nghiên cứu Mặc dù khác biệt không đáng kể phân MPL X axonopodis pv citri nghiên cứu thành nhóm nhỏ sơ đồ phân nhóm Sự biến động nhỏ trình tự 16S rDNA đột biến điểm đột biến nhỏ chèn hay nucleotide xảy vùng 16S rDNA trình tiến hóa cá thể quần thể Chín MPL X axonopodis pv citri tách rời với mẫu giới cho thấy có đồng di truyền mẫu vi khuẩn phân lập 16 62 29 26 19 56 36 40 52 91 92 100 65 0.08 0.06 0.04 0.02 MT328603 X axonopodis strain THKL1 MT328600 X axonopodis strain DHKQ4 MT328597 X axonopodis strain BLKL1 MT328602 X axonopodis strain THKQ1 MT328595 X axonopodis strain BLKQ1 MT328596 X axonopodis strain BLKC3 MT328598 X axonopodis strain DHHL2 MT328599 X axonopodis strain DHHQ2 NR 104963.1 X citri pv aurantifolii (USA) MN584920.1 X citri pv fuscans (Belgium) MK382439.1 X citri pv citri (New Zealand) MK121207.1 X citri pv citri (China) KY271340.1 X axonopodis (Brazil) JQ513818.1 X campestris pv viticola (Brazil) HQ875739.1 X axonopodis pv citri (Thailand) MT328601 X axonopodis strain THKC4 KP756924.1 Pseudomonas sp (Germany) MPL 0.00 Hình 3.6 Sơ đồ phân nhóm di truyền MPL Xanthomonas axonopodis xây dựng theo phương pháp Maximum Composite Likelihood dựa trình tự vùng 16S rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh Mẫu KP756924 (Psuedomonas sp.) sử dụng loài xa 3.1.3.2 Xác định loài vi khuẩn X axonopodis dựa vào vùng gene hrpW Kết Hình 3.7 cho thấy, tất MPL X axonopodis nghiên cứu có đoạn gene hrpW với chiều dài khoảng 561 bp sản phẩm PCR phân tích gel agarose 1,5% Kết nghiên cứu tương đồng với kết Park ctv (2006) nghiên cứu di truyền vi khuẩn X axonopodis có múi Kết Hình 3.8 so sánh trình tự vùng hrpW MPL X axonopodis với mẫu Xanthomonas giới cho thấy, tương đồng trình tự MPL nghiên cứu với mẫu X citri pv citri từ Mỹ mẫu X axonopodis pv citri từ Brazil giống hoàn toàn 100% (Bảng 2.3; Phụ lục 2) 17 500 bp Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR MPL Xanthomonas axonopodis với cặp primer XacF - XacR (M: thang chuẩn 100 bp; (-): đối chứng âm; Lane 1-9 (A): BLKQ1, BLKC3, BLKL1, DHHL2, DHHQ2, DHKQ4, THKQ1, THKL1, THKC4) Sự tương đồng trình tự cao với mẫu xác định X axonopodis pv citri Chín MPL X axonopodis pv citri nghiên cứu xếp nhóm lồi với X citri pv citri có nguồn gốc từ Mỹ (6 mẫu), X axonopodis pv citri có nguồn gốc từ Brazil (1 mẫu) Kết phân tích trình tự nucleotic gene hrpW cho thấy vùng hrpW MPL X axonopodis pv citri khơng có khác biệt so với mẫu có nguồn gốc từ Mỹ mẫu có nguồn gốc từ Brazil (Hình 3.1; Phụ Lục 3) Những kết định danh loài dựa trình tự vùng 16S rDNA hrpW củng cố cho kết luận MPL nghiên cứu thuộc loài X axonopodis pv citri 18 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% DHKQ2 DHKQ4 DHKL2 THKL1 MPL THKQ1 THKC4 BLKL1 BLKC3 BLKQ1 CP009007.1 X citri subsp citri (USA) CP009007.1 X citri subsp citri (USA) CP023285.1 X citri pv citri (USA) CP009010.1 X citri subsp citri (USA) CP009031.1 X citri pv citri (USA) CP003778.1 X citri pv citri (USA) AE008923.1 X axonopodis pv citri (Brazil) Hình 3.8 Sơ đồ phân nhóm di truyền MPL Xanthomonas axonopodis, xây dựng theo phương pháp Maximum Composite Likelihood dựa trình tự gene hrpW Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh 3.1.3.3 Xác định loài vi khuẩn X axonopodis dựa vào vùng gene pthA Kết PCR cho thấy, MPL nghiên cứu (BLKQ1, BLKC3, BLKL1, DHHL2, DHHQ2, DHKQ4, THKQ1, THKL1) tạo sản phẩm có kích thước khoảng 198 bp phân tích gel agarose 1,5% (Hình 3.9) Riêng MPLTHKC4 phân lập từ cành chanh khơng hạt Thạnh Hóa, Long An khơng cho sản phẩm band PCR Kết có vài điểm khác vị trí liên kết bắt cặp primer 19 500 bp 200 bp Hình 3.9 Sản phẩm PCR khuếch đại gene pthA MPL Xanthomonas axonopodis với cặp mồi J-pth1/J-pth2 (M: thang chuẩn 100 bp;(-): đối chứng âm; Lane 1-8 (A): BLKQ1, BLKC3, BLKL1, DHHL2, DHHQ2, DHKQ4, THKQ1, THKL1) Kết sơ đồ phân nhóm lồi dựa trình tự vùng pthA Hình 3.10 cho thấy, MPL X axonopodis pv citri nghiên cứu nằm nhóm có quan hệ di truyền gần gũi với X axonopodis pv citri Trung Quốc (CP004400.1), X citri pv citri Nhật Bản (AB021365.1) X citri pv citri Mỹ (U28802.1) Tám MPL X axonopodis pv citri nghiên cứu nằm nhóm với cho thấy đồng di truyền mẫu vi khuẩn phân lập So sánh trình tự vùng pthA MPL X axonopodis pv citri với mẫu X axonopodis pv citri giới cho thấy, MPL X axonopodis pv citri nghiên cứu tương đồng với mẫu X axonopodis pv citri có nguồn gốc từ Trung Quốc, mẫu X axonopodis pv citri có nguồn gốc từ Đài Loan, mẫu X citri pv citri có nguồn gốc từ Mỹ, mẫu có nguồn gốc từ Argentina mẫu X citri pv citri có nguồn gốc từ Nhật Bản 100% 20 100% 100% 0.0025 0.0020 0.0015 0.0010 0.0005 AB021365.1 X citri (Japan) U28802.1 X citri (USA) CP004400.1 X axonopodis (China) BLKQ1 BLKC3 BLKL1 THKQ1 THKL1 DHHL2 DHHQ2 DHKQ4 GU181333.1 X axonopodis pv citri (Taiwan) GU181332.1 X axonopodis pv citri (Taiwan) EF473087.1 X citri pv citri (USA) MK425211.1 X citri pv citri (Argentina) 0.0000 Hình 3.10 Sơ đồ phân nhóm di truyền MPL Xanthomonas axonopodis, xây dựng theo phương pháp Maximum Composite Likelihood dựa trình tự gene pthA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh 3.2 Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp hoạt chất chiết từ giao điều kiện phịng thí nghiệm 3.2.1 Kết tạo cao chiết toàn phần cao phân đoạn từ giao (Euphorbia tirucalli L.) Mẫu 6,5 kg bột khô giao (E tirucalli) thu thập vùng Phan Thiết, Tp Hồ Chí Minh ĐắK Nơng có độ ẩm tương ứng 8,73% ± 0,74; 8,86% ± 0,69; 8,67% ± 0,87 chiết với ethanol 96% phương pháp ngâm dầm, tỷ lệ dung môi nguyên liệu 6:1 (v/w) Kết cho thấy, giao thu nhận Phan Thiết, Bình Thuận có hiệu suất chiết cao toàn phần cao đạt 9,48% thấp giao thu nhận Tp HCM (8,67%) Giữa cao phân đoạn, hiệu suất 21 chiết cao ethyl acetate từ giao Bình Thuận cao (18,64%), khác biệt không đáng kể so với giao thu Đắk Nông (18,34%) 3.2.2 Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis strain BLKQ1 cao chiết phân đoạn Ở nồng độ 5,0 mg/mL, tất cao chiết phân đoạn từ giao thu nhận vùng có khả ức chế vi khuẩn X axonopodis Trong đó, hiệu ức chế vi khuẩn cao chiết phân đoạn từ giao Bình Thuận > Đắk Nơng > Tp HCM Ở nồng độ 7,5 mg/mL, cao chiết phân đoạn EA (ethyl acetate) từ giao thu nhận Bình Thuận có đường kính vịng vơ khuẩn cao (17,67 ± 0,57 mm) giá trị MIC đạt 0,156 mg/mL 3.2.3 Kết định tính nhóm hoạt chất có cao chiết phân đoạn từ giao Kết định tính nhóm hoạt chất cao chiết phân đoạn giao thu nhận từ Bình Thuận Đắk Nơng Trong đó, cao chiết phân đoạn từ giao Bình Thuận Đắk Nơng có chứa nhóm flavonoid khơng có diện nhóm saponin, nhóm chất có chứa nhiều thành phần có độc tính báo cáo nghiên cứu trước Cao chiết phân đoạn EA (ethyl acetate) phân đoạn Bu (butanol) có chứa alkaloid tannin phân đoạn He (n-hexan) có chứa flavonoid terpenoid Giữa cao chiết phân đoạn hai vùng thu nhận, phân đoạn EA sở hữu nhiều nhóm hoạt chất 3.2.4 Hàm lượng phenolic tổng flavonoid tổng cao chiết phân đoạn từ giao (E tirucalli) Cây giao thu nhận hai vùng Bình Thuận Đắk Nơng có chứa phenolic flavonoid Trong đó, cao chiết EA (ethyl acetate) từ giao thu nhận Bình Thuận có hàm lượng phenolic flavonoid cao tương ứng 106,32 mgGAE/g 450,83 μgQE/g 22 3.2.5 Kết phân lập hợp chất Từ cao phân đoạn ethyl acetate (cây giao Bình Thuận) phân lập hợp chất: gallic acid, scopoletin piperic acid Từ cao phân đoạn ethyl acetate (cây giao ĐắK Nông) phân lập hợp chất: gallic acid, scopoletin 3,3’,4’-triO-methylellagic acid 3.2.6 Hàm lượng hợp chất có cao chiết phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn X axonopodis cao Hàm lượng scopoletin cao toàn phần từ giao cao 21,81 mg/g cao chiết, tiếp đến acid gallic acid piperic với hàm lượng tương ứng 14,86 mg/g cao chiết 13,52 mg/g cao chiết 3.3 Đánh giá hiệu bệnh loét vi khuẩn X axonopodis gây cao chiết phân đoạn từ giao nhà lưới đồng 3.3.1 Đánh giá hiệu bệnh loét vi khuẩn Xanthomonas axonopodis cao chiết EA từ giao nồng độ khác nhà lưới Tại thời điểm 21 NSP lần 3, nồng độ cao chiết EA từ giao từ 0,75% trở lên có hiệu giảm bệnh loét chanh lớn 50% Trong đó, cao chiết EA từ giao nồng độ 0,75% có hiệu giảm bệnh loét chanh vi khuẩn X axonopodis 54,92%, nồng độ 1,0% đạt hiệu 67,84% Xử lý cao chiết EA (1,0%), 21 NSP lần 3, kích thước trung bình vết bệnh nhỏ 0,91 mm, mẫu đối chứng 1,9 mm 3.4.2 Hiệu phòng trừ bệnh loét vi khuẩn Xanthomonas gây chanh cao chiết ethyl acetate từ giao nồng độ khác đồng 3.4.2.1 Hiệu phòng trừ bệnh loét chanh cao chiết ethyl acetate nồng độ khác 23 Tại thời điểm NSP, tỷ lệ bệnh cao (13,7 %) xử lý cao chiết EA 0,5% thấp (8,7%) xử lý cao chiết EA 1,25% cao chiết EA (1,25%) có hiệu giảm bệnh loét cao (63,75%), tiếp đến cao chiết EA (1,0%) (46,40%) Cao chiết EA (0,5%) có hiệu giảm thấp (21,50%) 3.4.2.1 Hiệu phòng trừ bệnh loét chanh cao chiết ethyl acetate nồng độ khác Tại thời điểm NSP, tỷ lệ chanh bị bệnh chịu ảnh hưởng rõ rệt nồng độ cao chiết EA (0,5; 0,75; 1,0 1,25%) Tỷ lệ bệnh cao (20,1%) phun cao chiết EA 0,5% thấp (15,4%) phun cao chiết EA 1,25% Cao chiết EA từ 1,0% trở lên có hiệu giảm bệnh cao đạt 50% Cao chiết EA từ 1,25% có hiệu giảm bệnh cao đạt 61,29% CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Theo đặc điểm sinh hóa giải trình tự vùng gen 16S rDNA, hrpW pthA xác định nguyên nhân gây bệnh loét chanh không hạt chanh giấy Long An, Việt Nam vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri gây Trình tự MPL vi khuẩn đưa vào Genebank với mã số MT328595 - MT328603 Trong vùng nguyên liệu Đắk Nơng, Tp Hồ Chí Minh Bình Thuận, hiệu suất cao toàn phần ethanol (EtOH) thu nhận từ nguồn giao Bình Thuận cao đạt 9,48% Trong cao chiết phân đoạn ethyl acetate (EA) có diện nhóm hợp chất alkaloid, flavonoid, tannin, terpenoid khơng có diện nhóm saponin Hàm lượng phenolic tổng flavonoid tổng thu cao chiết EA cao nhất, tương ứng 106,32 mgGAE/g 450,83 μgQE/g Cao chiết EA nồng độ 0,75% có khả ức chế vi 24 khuẩn X axonopodis pv citri cao với đường kính vịng vơ khuẩn lớn 17,67mm Trong cao phân đoạn EA có diện chất scopoletin, gallic acid piperic acid với hàm lượng 21,81 mg/g; 14,86 mg/g, 13,52 mg/g cao chiết có hoạt tính ức chế vi khuẩn X axonopodis pv citri gây bệnh loét chanh Trong đó, hợp chất piperic acid chất thu cao chiết từ giao Bình Thuận Trong thử nghiệm nhà lưới, hiệu lực phòng trừ bệnh loét thời điểm 21 NSP lần cao chiết EA nồng độ 0,75 1,0% 54,9 67,84%, kích thước vết bệnh giảm 0,7 mm so với đối chứng (nước lã) Trong thử nghiệm đồng, thời điểm 14 NSP, hiệu lực giảm bệnh loét chanh cao chiết EA nồng độ 1,25% đạt 63,75% Tại thời điểm 21 NSP, hiệu lực giảm bệnh loét chanh cao chiết EA nồng độ 1,0 1,25% tương ứng 50,87 61,29% 4.2 Đề nghị Tiếp tục đánh giá hiệu phòng trừ bệnh loét vi khuẩn Xanthomonas axonopodis gây chanh cao chiết ethyl acetate (EA) nồng độ 1,25% tăng nồng độ khảo sát để tăng hiệu phịng trừ bệnh ngồi đồng Tiếp tục nghiên cứu chế tác động hợp chất diện cao chiết ethyl acetate đến vi khuẩn Xanthomonas axonopodis 25 ... HCM  NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CƯU KHẢ NĂNG ƯC CHẾ VI KHUẨN Xanthomonas sp GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY CHANH CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY GIAO (Euphorbia tirucalli L.) Chuyên ngành: Công nghệ... ? ?Nghiên cứu khả ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét chanh cao chiết phân đoạn từ giao (Euphorbia tirucalli L.)? ?? Mục tiêu luận án Xác định cấu trúc hóa học, hàm lượng nhóm hoạt chất đánh... chiết từ giao để phịng trừ vi khuẩn gây bệnh trồng nơng nghiệp Do đó, vi? ??c nghiên cứu ứng dụng dịch chiết từ giao để phòng trừ bệnh loét chanh trồng khác điều cần thiết Trên sở đó, luận án “Nghiên