Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án + Mục đích: Chọn lọc các chủng vi sinh vật tạo có khả năng phân hủy mạnh các thành phần hydrocarbon có trong nước thải nhiễm dầu và tìm được vật liệu mang phù hợp để gắn các chủng đó nhằm đánh giá được hiệu quả phân hủy một số thành phần hydrocarbon có trong nước thải nhiễm dầu. + Đối tượng nghiên cứu: Vi sinh vật phân hủy dầu, mẫu nước thải nhiễm dầu, một số thành phần hợp chất hydrocarbon có trong dầu mỏ, một số loại vật liệu mang vi sinh. 2. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 2.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của vi sinh vật; Kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật; Đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật; Phân loại và định tên nấm men bằng phương pháp so sánh trình tự đoạn ITS1 với các chủng nấm men khác trên ngân hàng gene (NCBI). 2.2. Nhóm phương pháp phân tích hóa học Lượng dầu tổng số trong nước thải được xác định bằng phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 5070:1995; Xác định hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu bằng sắc ký khí (GC), sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) và sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC); Nghiên cứu con đường chuyển hóa sec-hexylbenzene của chủng B1 bằng phương pháp phân tích các sản phẩm tạo thành sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) và sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC). 3. Các kết quả chính và kết luận Từ 9 chủng vi sinh vật được phân lập từ các mẫu nước và đất ô nhiễm dầu tại Việt Nam, chúng tôi đã tuyển chọn được 6 chủng vi sinh vật bao gồm QN1, B8, BN5, DX3, QNN1 và QN5 có khả năng tạo biofilm tốt và không có tính đối kháng lẫn nhau. Hỗn hợp các chủng này cho thấy khả năng hình thành biofilm tốt nhất trên vật liệu mang xơ dừa với mật độ vi sinh đạt 3,9*1012 CFU/cm3, trên các vật liệu sỏi nhẹ, cellulose và mút xốp mật độ vi sinh lần lượt đạt 2,1*1012, 4,25*109 và 1,65*1010 CFU/cm3 sau 36h. Khi tiến hành thử nghiệm khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu, biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang xơ dừa có hiệu quả phân hủy tốt nhất so với các vật liệu sỏi nhẹ, cellulose và mút xốp, đạt 99,8% lượng dầu tổng số, 85,56% phenol và trên 96% các thành phần PAH sau 7 ngày ở mô hình 50 lít. Từ kết quả trên chúng tôi lựa chọn vật liệu mang xơ dừa để tiếp tục đánh giá hiệu quả xử lý của biofim vi sinh vật ở quy mô thử nghiệm 300 lít và 20m3/mẻ. Trên hệ thống xử lý 300 lít, biofilm vi sinh vật cho hiệu quả xử lý tốt các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu và ở hệ thống xử lý 20 m3/mẻ, biofilm vi sinh vật cho hiệu quả xử lý đạt 99,94% hàm lượng dầu tổng số, 99,97% phenol và trên 94% các thành phần PAH, kết quả nước thải đầu ra đạt QCVN 40:2011/BTNMT tiêu chuẩn B. Chúng tôi cũng đã xác định được con đường giả định về sự phân hủy sec-hexylbenzene của chủng nấm men Trichosporon asahii B1 thông qua các sản phẩm trung gian bao gồm benzoic acid, 2-phenylpropionic acid, 3-phenylbutyric acid, 5-phenylhexanoic acid, ß-methylcinnamic acid, acephenone và 2,3-dihydroxybenzoic. Đây là những công bố đầu tiên tại Việt Nam về khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật phân hủy dầu trên các vật liệu mang và ứng dụng trong xử lý nước thải nhiễm dầu, cũng như đề xuất được con đường giải định về sự phân hủy sec-hexylbenzene của chủng nấm men Trichosporon asahii B1 phân lập tại Việt Nam.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Đỗ Văn Tuân NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY MỘT SỐ THÀNH PHẦN HYDROCARBON CÓ TRONG NƯỚC THẢI NHIỄM DẦU CỦA MÀNG SINH HỌC TỪ VI SINH VẬT ĐƯỢC GẮN TRÊN VẬT LIỆU MANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 1: TS Lê Thị Nhi Công - Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đồng Văn Quyền - Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: …………………………………… Phản biện 2: …………………………………… Phản biện 3: …………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ….’, ngày … tháng … năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, với phát triển cơng nghiệp tồn giới, tình hình nhiễm mơi trường gia tăng đến mức báo động mà nguyên nhân hoạt động xả thải trình sản xuất Một nguồn thải phổ biến nước thải nhiễm dầu, khơng riêng hoạt động khai thác, vận chuyển dầu, kể hoạt động động cơ, máy móc sử dụng nguồn lượng từ dầu, hoạt động sục rửa, vụ rò rỉ, tràn dầu gây nên ô nhiễm nguồn nước nhiễm dầu Nước nhiễm dầu làm thay đổi tính chất hóa lý nước, tăng độ nhớt, giảm lượng oxy hịa tan ảnh hưởng nghiêm trọng đến mơi trường sinh vật sống Hiện có nhiều biện pháp xử lý nước thải nhiễm dầu hiệu dựa phương pháp hóa học phương pháp vật lý hầu hết có chi phí cao, vận hành phức tạp khơng phù hợp với nước có điều kiện kinh tế khó khăn, loại bỏ dầu lại gây tác động xấu tới môi trường hệ sinh thái Trong năm gần đây, ngày có nhiều công bố khả phân huỷ hợp chất hữu khó phân hủy nước thải nhiễm dầu tác nhân vi sinh vật, đặc biệt nhóm vi sinh vật có khả tạo màng sinh học (biofilm) Màng sinh học nghiên cứu ứng dụng số nước giới xử lý nước thải, có xử lý nước thải nhiễm dầu mang lại hiệu khả quan với chi phí thấp Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu khả tạo màng nhóm vi sinh vật, đánh giá khả phân giải thành phần hydrocarbon nhóm vi sinh vật nước thải nhiễm dầu chưa nhiều, việc ứng dụng lại hạn chế Xuất phát từ sở đề xuất tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khả phân hủy số thành phần hydrocarbon có nước thải nhiễm dầu màng sinh học từ vi sinh vật gắn vật liệu mang” nhằm chọn lọc chủng vi sinh vật có khả phân hủy mạnh thành phần hydrocarbon có nước thải nhiễm dầu đánh giá khả xử lý chúng gắn vật liệu mang phù hợp Mục tiêu nghiên cứu luận án Chọn lọc chủng vi sinh vật tạo màng sinh học có khả phân hủy mạnh thành phần hydrocarbon có nước thải nhiễm dầu tìm vật liệu mang phù hợp để gắn chủng nhằm đánh giá hiệu phân hủy số thành phần hydrocarbon có nước thải nhiễm dầu Các nội dung nghiên cứu luận án (1) Chọn lọc chủng vi sinh vật vừa có khả tạo màng sinh học vừa có khả phân hủy tốt thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu (2) Lựa chọn chất mang thử nghiệm gắn chủng vi sinh vật lên số loại vật liệu mang rẻ tiền, sẵn có Việt Nam (3) Thử nghiệm đánh giá khả phân hủy thành phần hợp chất có nước thải nhiễm dầu mơ hình 50 lít để chọn loại vật liệu mang thích hợp (4) Thử nghiệm nhằm đánh giá khả phân hủy thành phần hợp chất có nước thải nhiễm dầu với vật liệu mang mơ hình 300 lít (5) Ứng dụng thử nghiệm mơ hình xử lý nước thải nhiễm dầu kho xăng dầu Đỗ Xá, Hà Nội (6) Nghiên cứu đường phân hủy sec-hexylbenzene chủng nấm men Trichosporon sp B1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nước thải nhiễm dầu Hiện tượng nước bị nhiễm dầu ngày trở nên phổ biến quốc gia, ngồi ngun nhân khách quan khơng thường xun tượng tràn dầu tự nhiên hoạt động sản xuất người thường xuyên thải môi trường lượng lớn nước thải nhiễm dầu Các nguồn phát sinh nước thải nhiễm dầu dạng, có lĩnh vực hoạt động phát sinh bao gồm: Các nguồn phát sinh nước thải nhiễm dầu cửa hàng kinh doanh xăng dầu, nguồn phát sinh từ hoạt động khai thác, chế biến dầu phát sinh từ nước mưa vị trí đường ống dẫn dầu bị rị rỉ, cố vận chuyển dầu hoạt động máy móc hoạt động sản xuất sử dụng sản phẩm dầu Nước thải nhiễm dầu chứa thành phần hydrocarbons dầu, ngồi cịn có rác, cặn lắng, … Tùy thuộc vào nguồn phát sinh mà đa dạng thành phần hàm lượng chất nước thải nhiễm dầu có khác Nước thải nhiễm dầu không gây nên tác hại nghiêm trọng tới môi trường, mà tác động mạnh mẽ tới hệ sinh vật, sức khỏe người kinh tế xã hội Nước thải nhiễm dầu làm thay đổi tính chất hóa lý nước, lớp dầu mặt nước làm giảm oxygen hòa tan dẫn đến giảm khả tự làm nước Lớp dầu ngăn cản bốc nước làm suy giảm lượng mưa, ảnh hướng đến khí hậu khu vực Các thành phần cặn dầu lắng xuống nguyên nhân gây nên ô nhiễm đất Không vậy, nước ô nhiễm dầu nguyên nhân gây nên thiệt hại kinh tế đặc biệt ngành khai thác, nuôi trồng thủy, hải sản du lịch 1.2 Một số công nghệ ứng dụng xử lý nước thải nhiễm dầu 1.2.1 Tuyển Công nghệ tuyển ứng dụng phổ biến xử lý nước thải nhiễm dầu nhà máy giới Các báo cáo cho thấy công nghệ tuyển có khả loại bỏ 90% thành phần nhũ tương dầu việc sử dụng tiền xử lý với alunium sulfate ferric sulphate Công nghệ tuyển có khả loại bỏ tốt thành phần dầu tự do, dầu dạng nhũ tương lại hiệu việc loại bỏ thành phần dầu dạng hịa tan dạng nhũ tương với kích thước hạt nhỏ, việc sử dụng loại chất đông tụ để đảm bảo hiệu xử lý dẫn đến nguy ô nhiễm thứ cấp dư lượng chất tồn nước thải sau xử lý 1.2.2 Công nghệ lọc màng Công nghệ màng lọc sử dụng vật liệu có cấu trúc đặc biệt, có tính xốp cao có khả giữ lại hạt chất ô nhiễm để loại bỏ chúng khỏi nước thải Hiện công nghệ lọc màng nghiên cứu ứng dụng xử lý nước thải nhiễm dầu nhà máy lọc dầu đem lại hiệu cao, với việc loại bỏ 98% hàm lượng dầu nước thải Tuy công nghệ lọc màng khơng có khả loại bỏ thành phần dầu hòa tan xử lý nước thải nhiễm dầu, hệ thống màng dễ bị tắc nghẽn thành phần kỵ nước nước thải thông lượng xử lý thấp 1.2.3 Cơng nghệ oxy hóa nâng cao Cơng nghệ oxy hóa nâng cao (advance oxidation process – AOPs) cơng nghệ xử lý hóa học nước thải thông qua phản ứng gốc hydroxyl (OH-) với chất ô nhiễm để tạo thành phân tử vơ nhỏ Các gốc hydroxyl tạo từ hay nhiều chất oxy hóa ozone, hydrogen peroxide, … hay nguồn lượng tia cực tím, điện hóa Cơng nghệ AOPs sử dụng phổ biến xử lý nước thải công nghệ, sinh hoạt nước thải nhiễm dầu Các báo cáo cho thấy khả xử lý 99% thành phần dầu thời gian ngắn Công nghệ AOPs công nghệ đem lại hiệu xử lý cao, thân thiện với môi trường, nhiên nghiên cứu giới cịn chưa hồn thiện công nghệ để ứng dụng rộng rãi xử lý nước thải nhiễm dầu, công nghệ AOPs mặc dù đem lại hiệu xử lý đáng kể với chi phí cao việc vận hành cơng nghệ đòi hỏi kỹ thuật cao 1.3 Biofilm ứng dụng xử lý ô nhiễm dầu Biofilm cấu trúc phức tạp hình thành vi sinh vật thiết lập tồn chúng bề mặt chất rắn lỏng Một biofilm tự nhiên gồm thành phần chính: Thành phần tế bào mạng lưới hợp chất ngoại bào EPS bao quanh tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm Biofilm ứng dụng giới xử lý ô nhiễm dầu đạt hiệu cao, kết nghiên cứu cho thấy biofilm mang nhiều đặc tính quan trọng giúp tăng hiệu xử lý vật chất ô nhiễm mà thân thiện với môi trường Các nghiên cứu mặc dù cùng sử dụng tác nhân vi sinh vật xử lý công nghệ biofilm đem lại hiệu xử lý cao hẳn so với phương pháp sinh học ứng dụng Biofilm chủng nấm men Candida tropicalis vật liệu mang sỏi có khả phân hủy nhanh hiệu thành phần dầu diesel, hiệu xử lý đạt 98% sau 10 ngày cao hẳn so với nấm men dạng tự hiệu xử lý đạt 80% cùng thời gian xử lý Tác giả Chavan & Mukherji sử dụng biofilm đơn chủng vi khuẩn Burkholderia cepacia xử lý nước thải nhiễm dầu diesel, kết cho hiệu xử lý 95% thành phần nankanes từ C9-C20 sau 15 ngày xử lý Ở Việt Nam nay, nghiên cứu ứng dụng biofilm xử lý nước thải nhiễm dầu phạm vi phịng thí nghiệm Những nghiên cứu thực vài năm gần cho thấy tiềm phong phú chủng loại vi sinh vật vừa tạo màng sinh học vừa phân huỷ chuyển hố hydrocarbon mẫu đất nước bị nhiễm dầu Việt Nam CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu nước đất ô nhiễm dầu lấy kho xăng dầu Đỗ Xá, huyện Thường Tín, thành phố Hà Nội Các chủng vi sinh vật sử dụng từ sưu tập chủng vi sinh vật phân hủy dầu Phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường, Viện Cơng nghệ sinh học phân lập từ mẫu nước đất ô nhiễm dầu Việt Nam Chủng Acinetobacter calcoaceticus P23 có khả tạo biofilm tốt cung cấp nhóm nghiên cứu GS.TS Masaaki Morikawa, Đại học Hokkaido, Nhật Bản sử dụng làm đối chứng dương Môi trường nuôi cấy sử dụng MPA, HKTS vi khuẩn môi trường Hansen nấm men Các vật liệu mang sử dụng nghiên cứu loại vật liệu có diện tính bề mặt lớn, bề mặt thơ ráp, rẻ tiền phổ biến Việt Nam bao gồm: Mút xốp, sỏi nhẹ, cellulose xơ dừa Các thiết bị sử dụng phịng thí nghiệm: Phịng CNSH mơi trường, Viện Cơng nghệ sinh học; Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học; Viện Hóa cơng nghiệp, Bộ Cơng thương; Phịng Sinh thái vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐH Quốc Gia Hà Nội 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các bước thí nghiệm Các bước thí nghiệm luận án tiến hành sau: (1) Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả tạo biofilm tốt (2) Thử nghiệm tính đối kháng chủng vi sinh vật (3) Đánh giá khả hình thành biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang (4) Đánh giá khả phân hủy thành phần hydrocarbon biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang quy mô 50 lít (5) Đánh giá khả phân hủy thành phần hydrocarbon biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang quy mô 300 lít (6) Đánh giá khả phân hủy thành phần hydrocarbon biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang quy mô 20 m3 (7) Định danh nghiên cứu đường chuyển hóa sechexylbenzene biofilm chủng nấm men Trichosporon sp B1 2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu vi sinh vật - Khả tạo biofilm chủng vi sinh vật đánh giá theo phương pháp O’Toole cs (2006) - Tính đối kháng chủng vi sinh vật thực theo mô tả Nguyễn Lân Dũng cs (1981) - Mật độ tế bào vi sinh vật xác định theo phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc CFU - Chủng nấm men Trichosporon sp B1 phân loại sơ hình thái Kit chuẩn sinh hóa API 20 C AUX theo mơ tả Maria cs (1997) Sau tiếp tục giải trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 so sánh ngân hàng gen công cụ BLAST 2.2.2 Nhóm phương pháp phân tích hóa học - Lượng dầu tổng số nước thải xác định phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 5070:1995 - Các thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu xác định sắc ký khí (GC), sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) sắc ký lỏng hiệu (HPLC) 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý phương pháp thống kê sinh học sử dụng công cụ Microsoft Excel 2013 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khả tạo biofilm chủng vi sinh vật So với chủng P23 đối chứng dương (∆OD570 đạt 11,04), chủng QN1 B8 cho khả hình thành biofilm mức tốt sau 24h nuôi cấy, số ∆OD570 đạt từ 9,58 đến 12,06 Đặc biệt 04 chủng BN5, DX3, QNN1 B1 có khả hình thành biofilm tốt với ∆OD570 đạt từ 15,23 đến 27,4 Hai chủng HY1 QNB3 có 11 pháp Khi cùng điều kiện giống nhau, mật độ cao vi sinh vật yếu tố thuận lợi để đẩy nhanh hiệu thời gian xử lý chất ô nhiễm 3.4 Khả phân hủy dầu DO hydrocarbon thơm biofilm vi sinh vật vật liệu mang 3.4.1 Khả phân hủy dầu DO hydrocarbon thơm biofilm vi sinh vật vật liệu mang mút xốp Biofilm vi sinh vật vật liệu mang mút xốp có khả phân hủy tốt dầu DO với hiệu suất phân hủy đạt 90,85% sau ngày Các thành phần phenol hydrocarbon thơm phân hủy 87,36% phenol, 55,59% napthalene, 68,35% anthracene, 95,77% pyren 72,51% flourene 3.4.2 Khả phân hủy dầu DO hydrocarbon thơm biofilm vi sinh vật vật liệu mang cellulose So với vật liệu mút xốp, cellulose cho khả hình thành biofilm thấp với mật độ vi sinh đạt 109 CFU/cm3 sau 36h Kết thử nghiệm khả phân hủy dầu DO thành phần hydrocarbon thơm cho thấy, biofilm vi sinh vật vật liệu mang cellulose cho khả xử lý tốt thành phần dầu DO loại hydrocarbon thơm thử nghiệm Sau ngày xử lý biofilm vi sinh vật vật liệu mang cellulose có khả phân hủy 79,54% hàm lượng dầu DO, hiệu đạt 93,41% sau ngày Các hàm lượng hydrocarbon thơm cho thấy suy giảm hàm lượng đáng kể trình xử lý Hiệu suất phân hủy đạt 89,12% phenol, 57,11% napthalene, 70,32% anthracene, 97,33% pyren 76,61% flourene sau ngày xử lý 12 3.4.3 Khả phân hủy dầu DO hydrocarbon thơm biofilm vi sinh vật vật liệu mang xơ dừa Trên vật liệu mang xơ dừa, biofilm vi sinh vật cho khả hình thành tốt với mật độ vi sinh đạt 1012 CFU/cm3 Sau ngày xử lý, biofilm vật liệu mang xơ dừa cho hiệu suất phân hủy dầu DO đạt 99,98% Biofilm vật liệu mang xơ dừa cho khả phân hủy tốt thành phần phenol, pyrene flourene với hiệu suất đạt 98,23% phenol 100% pyrene flourene sau ngày xử lý 3.4.4 Khả phân hủy dầu DO hydrocarbon thơm biofilm vi sinh vật vật liệu mang sỏi nhẹ Trên vật liệu mang sỏi nhẹ, biofilm hình thành với mật độ đạt cao lên tới 1012 CFU/cm3 Sau ngày xử lý, hiệu suất phân hủy biofilm vật liệu dầu DO 99,95% Các thành phần phenol hydrocarbon thơm phân hủy tốt với hiệu suất đạt 92,32% phenol 59% thành phần napthalene, anthracene, pyrene flourene 3.5 Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm hỗn hợp chủng VSV vật liệu mang 3.5.1 Chất lượng nước thải nhiễm dầu Mẫu nước thải từ bể chứa nước thải kho xăng dầu Đỗ Xá, Thường Tín, Hà Nội, chúng tơi thu thập lấy vị trí khác nhau, có váng dầu có mùi hắc Mẫu nước thải phân tích tiêu nước thải đầu vào Viện Hóa Học, Viện KH&CN Việt Nam Viện Hóa học Cơng nghiệp, kết phân tích trình bày bảng 3.3 13 Bảng 3.3 Kết phân tích tiêu thử nghiệm nước thải kho xăng dầu Đỗ Xá- Thường Tín- Hà Nội TT Chỉ tiêu thử nghiệm ĐVT Mẫu ban đầu QCVN 40:2011/BTN MT(Cột B) 8,5 5,5-9 pH SS (Chất rắn lơ lửng) mg/l 374 100 o BOD5 (20 C) mg/l 13345 50 COD mg/l 26686 150 N (Tổng nitơ) mg/l 694,1 40 P (Tổng phospho) mg/l 20,22 Tổng dầu mỡ khoáng mg/l 631950 10 Phenol mg/l 910 0,5 PAH mg/l - Acenaphthylene - Fluorene - Phenanthrene - Anthracene - Fluoranthene - Pyrene - Benzo(k)fluoranthene 1159 2005 802 57 1070 47,8 16,8 Nước thải nhiễm dầu bể chứa nước thải kho xăng dầu Đỗ Xá chưa xử lý có tiêu vượt QCVN 40:2011/BTNMT (Cột B), đặc biệt hàm lượng tổng dầu mỡ khoáng vượt 67.556 lần, hàm lượng phenol vượt 1.820 lần Với thành phần dầu cao nước thải, đặc biệt hàm lượng phenol PAH có độc tính cao, nước thải nhiễm dầu cần xử lý để tránh tác động xấu tới môi trường xung quanh 14 Nước thải nhiễm dầu tiến hành pha loãng 10 lần để phù hợp với ngưỡng thích nghi sinh trưởng chủng vi sinh vật trước tiến hành thử nghiệm đánh giá khả phân hủy thành phần hydrocarbon biofilm vật liệu mang quy mơ pilot 50 lít hệ thống 300 lít 3.5.2 Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang quy mơ 50 lít Sau 36h tạo biofilm vật liệu mang, tiến hành bổ sung 50 lít nước thải nhiễm dầu pha loãng 10 lần vào pilot 50 lít vận hành hệ thống sục khí đảo trộn điều kiện phịng, thí nghiệm đối chứng triển khai mơ hình bao gồm module vật liệu mang khơng có biofilm vi sinh vật Các mẫu nước thải xác định hàm lượng thành phần sau 3, ngày xử lý Biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật loại vật liệu mang thử nghiệm bao gồm: mút xốp, cellulose, sỏi nhẹ xơ dừa cho khả xử lý tốt nước thải nhiễm dầu với hiệu xử lý lên tới 90% hàm lượng dầu tổng số sau ngày Các thành phần phenol đạt hiệu suất xử lý 70% PAH 69% (Hình 3.16, 3.17) Tuy nhiên, biofilm vi sinh vật vật liệu mang xơ dừa cho hiệu phân hủy tốt thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu, đạt 99,8% dầu tổng số, 85,56% phenol 96% thành phần PAH sau ngày xử lý Hiệu xử lý cao biofilm vật liệu mang xơ dừa phù hợp với kết mật độ vi sinh vật vật liệu Khi biofilm hình thành tốt vật liệu mang với mật độ vi sinh cao đem lại hiệu xử lý cao so với vật liệu có mật độ vi sinh thấp Hiệu suất phân hủy (%) 15 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 99.80 86.45 93.16 84.34 91.26 82.71 42.09 39.18 37.54 95.54 85.09 ngày 40.60 ngày ngày Mút xốp Xơ dừa Cellulose Sỏi nhẹ Vật liệu mang Hình 3.16 Khả phân hủy dầu tổng số biofilm vi sinh vật Hiệu suất phân hủy (%) loại vật liệu mang 100 80 85.56 72.77 76.6 Mút xốp Cellulose 78.68 60 40 20 Xơ dừa Sỏi nhẹ Vật liệu mang Hình 3.17 Khả phân hủy phenol sau ngày biofilm vi sinh vật vật liệu mang Với khả phân hủy tốt thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm vật liệu mang xơ dừa, tiếp tục thiết kế hệ thống 300 lít để đánh giá khả xử lý nước thải nhiễm dầu biofilm hệ thống lớn để làm tiền đề cho việc đánh giá khả ứng dụng xử lý nước thải nhiễm dầu triển khai mơ hình ngồi thực tế 16 3.5.3 Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang hệ thống 300 lít 3.5.3.1 Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm vi sinh vật hệ thống 300 lít/mẻ Vật liệu mang sau 36h tạo biofilm với mật độ vi sinh đạt 3,9*1012 CFU/cm3, hệ thống bổ sung 300 lít nước thải nhiễm dầu vận hành xử lý Trại thực nghiệm sinh học, Cổ Nhuế, Hà Nội Kết phân tích hàm lượng hydrocarbon nước thải nhiễm dầu cho thấy, biofilm vi sinh vật vật liệu mang có khả phân hủy 85,36% 99,76% hàm lượng dầu tổng số sau 14 ngày xử lý Các hàm lượng phenol phân hủy lên tới Hiệu suất phân hủy (%) 85,89%, 97% thành phần PAH sau 14 ngày xử lý 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 99.76 85.36 Biofilm 40.38 0.12 ngày Đối chứng 0.42 ngày 0.85 14 ngày Thời gian xử lý Hình 3.18 Khả phân hủy dầu tổng số biofilm vi sinh vật vật liệu mang xơ dừa hệ thống 300 lít/mẻ Bảng 3.12 Khả phân hủy phenol PAH nước thải nhiễm dầu biofilm vật liệu xơ dừa hệ thống 300 lít/mẻ Hàm lượng (mg/l) Chỉ tiêu Ban đầu 14 ngày Hiệu suất phân hủy(%) 17 Hàm lượng (mg/l) Chỉ tiêu Hiệu suất Ban đầu 14 ngày phân hủy(%) 90,7+1,53 12,8+1,1 85,89+1,43 Acenaphthylene 115,47+0,67 100 Fluorene 200,6+1,75 6,01+0,87 97+0,44 Phenanthrene 80,44+0,74 100 Anthracene 5,76+0,12 100 107,14+1,07 100 Pyrene 4,8+0,04 100 Benzo(k)fluoranthene 1,62+0,02 100 Phenol Fluoranthene 3.5.3.2 Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm vi sinh vật hệ thống 300 lít/ngày Vật liệu mang xơ dừa xử lý sơ sau gắn vào khung giữ vật liệu tạo thành module hồn chỉnh có kích thước 85*85*15cm Các module lắp vào bể chứa tiến hành tạo biofilm vật liệu Vật liệu mang sau 36h ni cấy, biofilm hình thành vật liệu với mật độ đạt 3,9*1012 CFU/cm3 Tiếp hệ thống xử lý vận hành với tốc độ đầu 300 lít/ngày Kết sắc ký GC mẫu nước thải cho thấy hệ thống 300 lít/ngày có khả xử lý 100% thành phần n-alkane C9, C12, C13, C19 C20 sau 14 ngày Các thành phần C10, C11, C14-18 xử lý 97% so với nồng độ ban đầu Biphenyl sử dụng làm chất chuẩn để đánh giá hàm lượng thành phần n-alkane thời điểm khác Hiệu suất phân hủy (%) 18 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Đối chứng sau 14 ngày 14 ngày C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 Alkane Hình 3.21 Khả phân hủy thành phần n –alkane biofilm vi sinh vật vật liệu mang xơ dừa quy mơ 300 lít/ngày Kết phân tích GCMS cho thấy, sau 14 ngày xử lý biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang xơ dừa có khả phân hủy lên tới 98,9% thành phần hydrocarbon no, 95,03% hydrocarbon thơm 95% nhựa aspaten 3.5.4 Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang hệ thống 20m3 So với thời điểm lẫy mẫu ban đầu để tiến hành thí nghiệm đánh giá khả xử lý nước thải nhiễm dầu quy mơ 50 lít 300 lít điều kiện phịng, hàm lượng dầu nước thải có biến động tăng nhẹ, tiêu tổng hàm lượng dầu thành phần phenol, PAH có thay đổi khơng đáng kể Các tiêu phân tích chất lượng mức cao gấp nhiều lần so với quy chuẩn nước thải Việt Nam theo tiêu chuẩn QCVN 40:2011/BTNMT (Cột B) Để thuận lợi cho thích nghi chủng vi sinh vật phân hủy 19 dầu, nước thải tiến hành xử lý sơ 01 hệ thống tuyển áp lực DAF, thời gian xử lý 24h Sau xử lý sơ bộ, nước thải tiến hành phân tích tiêu, kết trình bày bảng 3.14 Bảng 3.14 Chất lượng nước thải nhiễm dầu đầu vào cho xử lý sinh học TT Chỉ tiêu thử nghiệm Đơn vị Hàm lượng pH SS (Chất rắn lơ lửng) mg/l 154,83+1,06 o BOD5 (20 C) mg/l 5872,4+4,85 COD mg/l 15239,5+3,98 N (Tổng nitơ) mg/l 342,5+0,7 P (Tổng phospho) mg/l 98,2+0,95 Tổng dầu mỡ khoáng mg/l 31950+1,53 Phenol mg/l 723+6,7 PAH mg/l 7,9+0,02 - Acenaphthylene 559,2+6,21 - Fluorene 205,5+4,79 - Phenanthrene 402,1+2,16 - Anthracene 57,3+1,23 - Fluoranthene 107,7+1,57 - Pyrene 48,3+0,63 -Benzo(k)fluoranthene 16,8+0,25 Sau 36h ni cấy, biofilm hình thành vật liệu mang xơ dừa với mật độ vi sinh đạt 2,1*1012 CFU/cm3 Các module vật liệu mang sau lắp đặt vào bể xử lý cấp 20m3 nước thải, hệ thống đảo trộn sục khí vận hành suốt trình xử lý Sau 14 ngày xử lý, hệ thống đạt hiệu xử lý 99,94% hàm lượng dầu tổng số Hiệu suất phân hủy (%) 20 99.94 100 80 62.92 60 40 20 Biofilm 20.33 0.65 1.18 2.11 Đối chứng 14 ngày Thời gian xử lý Hình 3.26 Khả phân hủy dầu tổng số biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật vật liệu mang quy mơ 20m3 Trong q trình xử lý mơ hình thực tế hệ thống 20 m3, biofilm vật liệu mang xơ dừa trì mật độ vi sinh cao trình xử lý Tiến hành kiểm tra hình ảnh biofilm vi sinh vật vật liệu mang kính hiển vi điện tử quét cho thấy, biofilm có cấu trúc dày, vật liệu mang với tế bào vi sinh vật mật độ cao bám dính hệ thống chất EPS đặc trưng (Hình 3.27) (a) (b) Hình 3.27 Cấu trúc vật liệu mang mơ hình 20 m3 trước (a) sau tạo biofilm kính hiển vi điện tử quét (b) Trong trình xử lý, hàm lượng thành phần phenol PAH nước thải xác định Sau 14 ngày xử lý biofilm vi sinh vật vật liệu mang có khả xử lý 100% thành phần anthracene, flouranthene, pyrene Benzo(k)flouranthene; 94% thành phần phenol, acenaphthylene, fluorene phenanthrene 21 Bảng 3.16 Hiệu xử lý thành phần phenol PAH hệ thống 20m3 Hàm lượng sau ngày xử lý (mg/l) Hiệu suất phân hủy Cơ chất sau 14 0h ngày 14 (%) Phenol 723+6,7 272+1,77 0,2+0,01 99,97 Acenaphthylene 559,2+6,21 325+5,14 5,4+0,15 99, 03 Fluorene 205,5+4,79 164+2,31 10,7+0,12 94,79 Phenanthrene 402,1+2,16 288+5,13 0,1+0,01 99,98 Anthracene 57,3+1,23 21,3+0,9 100 Flouranthene 107,7+1,57 47+0,32 100 Pyrene 48,3+0,63 13,6+0,31 100 Benzo(k) flouranthene 16,8+0,25 6,8+0,23 100 Chất lượng nước thải đầu sau 14 ngày xử lý (bảng 3.17) cho thấy tiêu thử nghiệm đạt so với QCVN 40:2011/BTNMT (cột B) Đặc biệt tiêu tổng dầu mỡ khoáng nước thải trước xử lý cao gấp 3195 lần, phenol gấp 1446 lần so với quy chuẩn, sau trình xử lý 14 ngày tiêu đạt ngưỡng an toàn nước thải mức 3,4mg/l 0,2 mg/l Bảng 3.17 Chất lượng nước thải đầu Nước thải QCVN 40:2011/ TT Chỉ tiêu thử nghiệm Đơn vị sau xử lý BTNMT(Cột B) pH 7,4 5,5-9 SS (Chất rắn lơ lửng) mg/l 6,3 100 o BOD5 (20 C) mg/l 41 50 COD mg/l 110 150 N (Tổng nitơ) mg/l 39,7 40 P (Tổng phospho) mg/l 1,2 22 Tổng dầu mỡ khoáng mg/l 3,4 10 Phenol mg/l 0,2 0,5 PAH mg/l - Acenaphthylene 5,4 - Fluorene 10,7 - Phenanthrene 0,1 - Anthracene - Fluoranthene - Pyrene - Benzo(k)fluoranthene 3.6 Khả chuyển hoá sec-hexylbenzene Trichosporon asahii B1 Chủng B1 giải trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 có kích thước 492bp đăng ký ngân hàng Gene với mã số KC139404 Trình tự đoạn gen sau so sánh ngân hàng gen công cụ BLAST, cho thấy chủng B1 Trichosporon asahii với độ tương đồng 98,39% Từ kết phân tích HPLC GCMS xác định tên sản phẩm trung gian trình phân hủy sechexylbenzene chủng nấm men B1 A, B, C, D, E, F G tương ứng benzoic acid, 2-phenylpropionic acid, 3-phenylbutyric acid, 5phenylhexanoic acid, ß-methylcinnamic acid, acephenone 2,3dihydroxybenzoic Dựa sản phẩm tạo thành nghiên cứu công bố, xây dựng đường giả định chuyển hóa hợp chất sec-hexylbenzene bời màng sinh học chủng nấm men Trichosporon asahii B1 23 Hình 3.33 Con đường giả định phân hủy sec-hexylbenzene Trichosporon asahii B1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Hỗn hợp chủng vi sinh vật hình thành biofilm tốt vật liệu mang xơ dừa với mật độ vi sinh đạt 3,9*1012 CFU/cm3 sau 36h, vật liệu sỏi nhẹ, cellulose mút xốp mật độ vi sinh đạt 2,1*1012, 4,25*109 1,65*1010 CFU/cm3 sau 36h Biofilm vi sinh vật vật liệu mang xơ dừa có khả phân hủy 99,8% lượng dầu tổng số, 85,56% phenol 96% thành phần PAH sau ngày mơ hình 50 lít Trên vật liệu mang sỏi nhẹ, cellulose mút xốp, biofilm vi sinh vật cho khả xử lý thấp vật liệu mang xơ dừa Trên hệ thống xử lý xử lý 300 lít/mẻ biofilm vi sinh vật cho hiệu xử lý 99,76% hàm lượng dầu tổng số 85% thành 24 phần phenol PAH nước nhiễm dầu sau 14 ngày xử lý Trên hệ thống xử lý liên tục 300 lít/ngày, biofilm vi sinh vật cho hiệu xử lý đạt 97% thành phần n-alkane C10, C11, C14-18, 100% thành phần C9, C12, C13, C19 C20, 100% thành phần phenol PAH, 98,9% hydrocarbon no, 95,03% hydrocarbon thơm, 95% nhựa aspaten Trên hệ thống xử lý 20 m3/mẻ, biofilm vi sinh vật cho hiệu xử lý đạt 99,94% hàm lượng dầu tổng số, 99,97% phenol 94% thành phần PAH Kết nước thải đầu đạt QCVN 40:2011/BTNMT tiêu chuẩn B Con đường giả định phân hủy sec-hexylbenzene chủng nấm men Trichosporon asahii B1 thông qua sản phẩm trung gian bao gồm benzoic acid, 2-phenylpropionic acid, 3-phenylbutyric acid, 5-phenylhexanoic acid, ß-methylcinnamic acid, acephenone 2,3dihydroxybenzoic KIẾN NGHỊ: Thử nghiệm đánh giá khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu màng sinh học số kho xăng khác Việt Nam NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ḶN ÁN Là cơng trình Việt Nam đánh giá khả tạo biofilm chủng vi sinh vật phân hủy dầu vật liệu mang: xơ dừa, mút xốp, sỏi nhẹ, cellulose ứng dụng xử lý nước thải nhiễm dầu Lần đề xuất đường giải định phân hủy sec-hexylbenzene chủng nấm men Trichosporon asahii B1 phân lập Việt Nam NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỚ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Thị Nhi Công, Vũ Thị Thanh, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh, Đỗ Thị Liên, Hoàng Phương Hà, Đỗ Văn Tuân, Đỗ Thị Tố Uyên, Thử nghiệm khả phân hủy dầu diesel màng sinh học từ vi sinh vật gắn giá thể cellulose hệ thử nghiệm dung tích 50 lít, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2015, 13(2A), 703-708 Le Thi Nhi Cong, Cung Thi Ngoc Mai, Nghiem Ngoc Minh, Hoang Phuong Ha, Do Thi Lien, Do Van Tuan, Dong Van Quyen, Michihiko Ike, Do Thi To Uyen, Degradation of sec-hexylbenzene and its metabolites by a biofilm-forming yeast Trichosporon asahii B1 isolated from oilcontaminated sediments in Quangninh Coastal Zone, Vietnam, Journal of environmental science and health 2016, part A 51(3), 267-275 Do Van Tuan, Do Thi To Uyen, Dong Van Quyen, Le Thi Nhi Cong, Hydrocarbon degradation in oily wastewater by microbial biofilm attached on polyurethane foam carriers, Proceeding at the 4th Academic conference on natural science for Young Scientists, Master and PhD Student from Asean countries 15-18 December, 2015, Bangkok, Thailand: O16, 40-45 Đỗ Văn Tuân, Lê Thị Nhi Công, Đỗ Thị Liên & Đồng Văn Quyền, Đánh giá khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu kho xăng dầu Đỗ Xá, Hà Nội màng sinh học từ vi sinh vật gắn vật liệu mang xơ dừa, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội 2017, 33 (2S), 274-279 Đỗ Văn Tuân, Lê Thị Nhi Công, Vũ Ngọc Huy, Hoàng Phương Hà, Khả phân hủy thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu màng sinh học (biofilm) từ vi sinh vật vật liệu mang sỏi nhẹ keramzit, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2017, 15(4A), 291-297 Do Van Tuan, Le Thi Nhi Cong, Vu Ngoc Huy, Phi Quyet Tien & Hoang Phuong Ha, Assessment of oil contaminated wastewater treatment by microbial biofilm attached on coconut fiber in 20,000 liter system, Proceeding at the 5th Academic conference on natural science for Young Scientists, Master and PhD Student from Asean countries 4-7 October, 2017, Da Lat, Vietnam, 170-176 ... …………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ….’, ngày … tháng … năm 2022... tháng … năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, với phát triển... thí nghiệm Các bước thí nghiệm luận án tiến hành sau: (1) Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả tạo biofilm tốt (2) Thử nghiệm tính đối kháng chủng vi sinh vật (3) Đánh giá khả hình thành biofilm