Đang tải... (xem toàn văn)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN TIỂU LUẬN TÊN ĐỀ TÀI ENZYME PROTEASE Môn học Vi sinh vật đại cương Mã môn học EN1015 Giảng viên PGS TS Đặng Vũ Bích Hạnh ThS Trịnh Thị Bích Huyền Họ và tên LÊ BÙI ANH MSSV 2010110 Tp Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC 2 I Khái niệm 2 II Nguồn gốc 2 1 Thực vật 2 2 Động vật 3 3 Vi sinh vật 3 CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI 5 I Khái niệm EC 5 II Phân loại Protease 5 CHƯƠNG 3 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 7 CHƯƠNG 4 CHỨC NĂNG.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN TIỂU LUẬN TÊN ĐỀ TÀI: ENZYME PROTEASE Môn học : Vi sinh vật đại cương Mã môn học : EN1015 Giảng viên : PGS TS Đặng Vũ Bích Hạnh ThS Trịnh Thị Bích Huyền Họ tên : …LÊ BÙI ANH… MSSV : …2010110… Tp Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC I Khái niệm: II Nguồn gốc: Thực vật: 2 Động vật: 3 Vi sinh vật CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI I Khái niệm EC: II Phân loại Protease: .5 CHƯƠNG 3: CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CHƯƠNG 4: CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG .10 I Trong y sinh: 10 II Trong công nghiệp: 10 Chế biến thủy sản 10 Công nghiệp sữa bánh .11 Sản xuất bia 11 Công nghiệp da dệt 11 CHƯƠNG 5: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZYME .12 Phương pháp thu nhận Ficin thô từ sung sơ chế thành chế phẩm Enzyme Ficin 12 I II Thu nhận Ficin thô: 12 Sơ chế dịch nhựa tươi thành chế phẩm Enzyme Ficin: 12 Phương pháp tinh sạch: 13 KẾT LUẬN 15 MỞ ĐẦU Thế giới xung quanh ta tồn vơ vàn điều kì diệu mà lồi người dành nhiều hệ để nghiên cứu chúng enzyme số Enzyme, biết, đóng vai trị quan trọng thể sinh vật sống Trái Đất này.Trên thực tế, người cịn chưa có khái niệm enzyme, họ biết sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền Khoảng 5000 năm trước công nguyên Jerico, người ta biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương chao,… mức độ khác Và Protease enzyme vô thú vị: Các nghiên cứu gần cho thấy khoảng 2% toàn sản phẩm gene (gene products) protease1, đủ thấy tầm quan trọng enzyme Lịch sử nghiên cứu protease ghi nhận từ năm cuối kỉ XVIII, tới gần thật nhận quan tâm ứng dụng rộng rãi chúng: chúng khơng có ý nghĩa cho q trình sinh sản, sinh trưởng sinh vật mà cịn đóng vai trị quan trọng cơng nghệ chế biến thực phẩm, y học, công nghệ gene bảo vệ mơi trường Đây lí đề tài chọn cho tiểu luận sau tìm hiểu khái niệm, phân loại, chế hoạt động ứng dụng quy trình tách chiết loại enzyme đặc biệt Proteases in physiology and pathology by Chakraborti Sajal-Dhalla Naranjan S 1|Page CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC I Khái niệm: Enzyme nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò chức sinh học quan trọng bậc tế bào thể sống Enzyme có khả xúc tác với tốc độ đặc hiệu chất vơ hồn hảo, xúc tác đặc biệt phản ứng hóa học mà điều kiện bình thường chất xúc tác hóa học khác khơng thể thực Các trình sinh học xảy thể sinh vật sống phản ứng hóa học hầu hết chịu tác động enzyme Nếu khơng có enzyme, phần lớn phản ứng khơng thể xảy Enzyme xúc tác tất trình trao đổi chất tế bào, bao gồm tiêu hóa thức ăn mà phân tử chất dinh dưỡng lớn protein, carbohydrate hay chất béo bị phá vỡ cấu trúc thành phân tử nhỏ hơn.2 Điển hình trình tiêu hóa thức ăn enzyme protease Protease ( hay gọi Peptidase Proteinase) enzyme xúc tác cho trình phân giải protein thành chuỗi polypeptide ngắn hay nhiều phân tử amino acid Để làm điều này, trình thủy phân, chúng cắt đứt liên kết peptide ( -CO-NH-) phân tử protein, ngồi nhiều protease cịn có khả thủy phân liên kết ester vận chuyển amino acid Chúng khơng có ý nghĩa cho q trình sinh sản, sinh trưởng sinh vật mà đóng vai trị quan trọng cơng nghệ chế biến thực phẩm, y học, công nghệ gene bảo vệ mơi trường.3 II Nguồn gốc4: Protease có nguồn thu tới từ động vật, thực vật vi sinh vật Thực vật: Bromelin, glycoprotein, phân tử có glycan gồm maltose, glucosamine, xylose fructose tìm thấy thân dứa Loại protease có biên độ pH từ 3-10, pH tối thiểu 5-8 tùy thuộc chất nhiệt độ thay đổi gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Papain, protease-thiol với trung tâm hoạt động có nhóm –SH định hoạt tính nó, có nhựa đu đủ Loại protease chịu nhiệt độ cao dạng ổn định (hay cấu trúc không gian ổn định) chịu pH khoảng 1.5-8.5 https://www.britannica.com/science/enzyme https://en.wikipedia.org/wiki/Protease ; https://sciencevietnam.com/enzyme-protease Protease- Nhóm 1, Trường Đại học An Giang Khoa Nông nghiệp - Tài nguyên Thiên nhiên 2|Page Ficin có nhựa thân sung lại thủy phân liên kết peptide nhiều loại protein tự nhiên protein sữa, đậu nành Hoạt động phạm vi nhiệt độ từ 30-500C với pH thuộc khoảng 4-9.5 hoạt động tốt nhiệt độ 50-650C pH=5 (nếu chất gelatin), pH= 9.5( chất casein) Động vật: Pepsin, polypeptide cấu tạo 329 amino acid, đầu C alanin đầu N isoleucine với pH tối hảo (pH phù hợp nhất) = 1.5-2.4, tìm thấy dịch vị động vật có vú, chim… Rennin, hay cịn gọi Chymosin hình thành dày non loại nhai lại (như bê) có khả đơng tụ sữa giúp non hấp thụ chất dinh dưỡng từ sữa tốt ,và hoạt động pH= 2.3-6.8 Trypsin loại enzyme tiêu hóa quan trọng, tìm thấy hệ tiêu hóa nhiều lồi động vật có xương sống, nơi enzyme trypsin thực vai trò thủy phân protein Vi sinh vật5 Vi sinh vật nguồn thu nhận enzyme khổng lồ protease chúng sản xuất có tính đặc hiệu chất cao, protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn Enzyme Protease_Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm_Đại học Vinh 3|Page Subtilisin protease ban đầu thu từ Bacillus subtilis, vi khuẩn có khả tổng hợp protease mạnh Các vi khuẩn thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiếm yếu (5-8) có khả chịu nhiệt thấp Bacillus Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu protease acid, có khả thủy phân protein pH = 2.5-3 Một số nấm mốc A.candidatus,P camemberti, có khả tổng hợp protease có khả đơng tụ sữa Nấm mốc 4|Page CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI I Khái niệm EC: Để phân loại ta phải tìm hiểu Enzyme Commission number (tạm dịch số EC) Đây cách phân loại enzyme phương pháp đánh số dựa phản ứng hóa học mà chúng tham gia xúc tác Mọi mã Enzyme (Enzyme code) chứa cụm “ EC” số ngăn cách dấu chấm Những số đại diện cho cách phân loại cụ thể chi tiết cho enzyme.6 II Phân loại Protease: Protease thuộc phân lớp lớp thứ ( EC.3.4) : enzyme thủy phân ( Hydrolases) tác động lên liên kết peptide Protease chia thành loại dựa vào vị trí cắt mạch peptide: Endopeptidase Exopeptidase Endopeptidase cắt liên kết peptide phân tử protein, kết tạo nhiều mạch peptide Exopeptidase lại cắt cuối mạch phân tử protein dẫn đến việc tách amino acid Dựa vào vị trí tác động mạch polypeptide, Exopeptidase phân thành loại: - Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi polypeptide để giải phóng amino acid, dipeptide tripeptide - Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C chuỗi polypeptide giải phóng amino acid dipeptide Dựa vào động học chế xúc tác, Endopeptidase chia thành nhóm: -Serine Protease: protease chứa nhóm -OH gốc serine trung tâm hoạt động có vai trị đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzyme Nhóm bao gồm nhóm nhỏ: Chymotrypsin Subtilisin Chymotrypsin bao gồm enzyme động vật Chymotrypsin, Elastase; Subtilisin bao gồm loại enzyme vi khuẩn Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN Các Serine protease thường hoạt động mạnh vùng kiềm thể hiến tính đặc hiệu chất tương đối rộng -Cysteine Protease: Protease chứa nhóm -SH trung tâm hoạt động; bao gồm Protease thực vật Papain, Bromelin, vài Protease https://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_Commission_number https://sciencevietnam.com/enzyme-protease#Phan_loai 5|Page động vật Protease kí sinh trùng Các Cysteine Protease thường hoạt động vùng pH trung tính có tính đặc hiệu chất rộng -Aspartic Protease: hầu hết Aspartic Protease thuộc nhóm Pepsin, bao gồm enzyme tiêu hóa như: Pepsin, Chymosin, Cathepsin, Renin Các Aspartic Protease có chứa nhóm Carboxyl trung tâm hoạt động thường hoạt động mạnh pH trung tính -Metallo proteinase: nhóm proteinase tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc vi sinh vật bậc cao Các Metallo Proteinase thường hoạt động vùng PH trung tính giảm hoạt động mạnh tác dụng EDTA Ngồi ra, Protease phân loại theo vùng pH tối ưu tương ứng: Protease acid: Pepsin, Renin, … vùng pH acid 2-4 Protease base: Trypsin, Chymotrypsin, … vùng pH kiềm 9-11 Protease trung tính: Papain từ đu đủ, Bromelin từ dứa, … hoạt động vùng pH trung tính 7-8 6|Page CHƯƠNG 3: CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG Ta biết Protease có vai trị xúc tác cho phương trình thủy phân thủy phân sử dụng nước để phá vỡ liên kết cộng hóa trị Trong trường hợp này, liên kết cộng hóa trị mà ta muốn phá liên kết amide protein Hình mô ta phân tử nước ( màu đỏ) liên kết peptide (màu xanh) bảng màu sử dụng xuyên suốt chương nhằm giải thích chế hoạt động Protease Sau nước phản ứng với liên kết amide, ta kết amine acid carboxylic Tác dụng Enzyme Protease giúp phản ứng xảy nhanh nhiều chất nước nucleophile đủ tốt để q trình diễn nhanh chóng Và ta nên nhớ ta cần nucleophile để bắt đầu loại phản ứng Và Protease biến nước thành nucleophile tốt cách sau: hình sau Trung tâm hoạt động enzyme vẽ màu trắng dòng electron màu vàng để ta dễ dàng theo dõi https://www.youtube.com/watch?v=A_Krlxg6lz8 7|Page Bước phản ứng biến nước thành nucleophile tốt enzyme làm điều cách lấy prtoton nước tạo anion hydroxide Enzyme lấy cặp electron tự aspartic acid Trung tâm hoạt động để lấy proton từ nước, tạo Hydroxide Sau nước trở thành nucleophile đủ mạnh để tác dụng với electrophile (tạo Oxyanion) Và điều xảy tạo điều kiện cho nguyên tử N liên kết peptide lấy proton ngun tử H (của nhóm -OH) Chính khiến cho N trở thành điện tích dương (positive charge) nên nhóm carbonyl hình thành electron hấp dẫn nguyên tử N liên kết peptide liên kết CO vừa tạo Khi hoàn thành giai đoạn lúc ta cắt liên kết peptide trinh thủy phân kết thúc ta giai đoạn hồi phục Trung tâm hoạt đông Enzyme cách lấy proton Aspartic acid 8|Page Và ta làm điều cách dùng cặp electron tự amine Carboxylate tùy vào điều kiện pH thích hợp mà phân tử nhường cặp electron tự Và cụ thể điều kiện sinh học, amine thường lấy proton (protonated) Vậy ta khôi phục Trung tâm hoạt động enzyme để tiếp tục xúc tác cho phản ứng 9|Page CHƯƠNG 4: CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG I Trong y sinh: Protease gắn liền với nhiều khía cạnh sinh học người Ví dụ, ruột non, Protease giúp tiêu hóa protein giúp ta hấp thụ amino acid Các q trình cần có Protease làm trung gian đông tụ máu, giúp phát hệ miễn dịch hoạt động, phát triển prohormone, hình thành xương, chết theo chương trình tế bào ( Programmed cell death) Protease không thiết phải gắn liền tới chức tiêu hóa tái tạo chất mơ ngoại bào, mà cịn yếu tố để “hướng dẫn” (induction) phản ứng miễn dịch sinh lý (Physiological immune responses) Sự hướng dẫn trực tiếp, thơng qua phân hủy mầm bệnh bên Phagolysosomes gián tiếp,thơng qua kích hoạt PRRs (Pattern recognition receptors) chủ chốt TLRs (toll-like receptors) Nhưng thật đáng tiếc sản xuất dư thừa Protease dẫn đến phản ứng có hại cho vật chủ gây viêm tổn thương cho mơ dư thừa Protease cịn đóng vai trị quan trọng nhiều sở để điều trị bệnh bệnh Alzheimer’s, ung thư nhiễm trùng vi rút (viral infection) MMP-9, ma trận metallopeptidase, đóng vai trị quan trọng trình hình thành mạch máu (angiogenesis) mục tiêu để chữa trị cho ung thư (therapeutic target for cancer) Chính tầm quan trọng chúng bệnh lý học (pathology of disease) mà Protease nhóm thuốc mục tiêu hướng tới ( drug target class) II 10 Trong công nghiệp: Chế biến thủy sản Nước mắm truyền thống kết trình thủy phân protein thịt cá tác động hệ protease nội cá với điều kiện có muối Khi sản xuất nước mắm thời gian chế biến thường dài nhất, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộc nhiều vào địa phương, phương pháp gài nén ( phương pháp để sản xuất nước mắm), nguyên liệu cá Nên việc sử dụng chế phẩm Enzyme Protease quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày dần hoàn thiện Phương pháp sử dụng Protease sản xuất nước mắm: Trong 24 tiếng đầu tiên, tác động hệ Protease nội cá, phần protein thịt cá bị phân hủy thành peptide, polypeptide hòa tan nước bồi Sau đó, protein thịt cá, peptide polypeptide tạo thành https://www.sinobiological.com/research/enzymes/proteases-function Enzyme Protease_Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm_Đại học Vinh 10 10 | P a g e tiếp tục bị thủy phân Protease tạo thành amino acid tự do, peptide ngắn hình thành hương vị nước mắm Cơng nghiệp sữa bánh Protease dùng sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đơng tụ sữa chúng Protease từ sinh vật A Candidus, P.Roquerti, B mesentericus Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy,… Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo làm nhuyễn bột, tạo độ xốp, giúp bánh có độ nở tốt Sản xuất bia Chế phẩm Protease có ý nghĩa quan trọng việc làm tăng độ bền bia rút ngắn thời gian lọc Protease Aps.oryzae tạo điều kiện xử lý bia tốt cách thủy phân Protein hạt ngũ cốc ( hạt sau lên men để nấu bia gọi bã bia) Ứng dụng Protease để làm ổn định nước rượu vang tác nhân gây đục gây khó khăn cho việc protein Công nghiệp da dệt Trong công nghiệp da, Protease sử dụng làm mềm da nhờ thủy phân phần protein da, chủ yếu collagel, thành phần khiến cho da bị cứng Kết cho việc loại bỏ khỏi da chất nhớt làm cho da có độ mềm dẻo định, tính chất hồn thiện sau thuộc da Trước đây, để làm mềm da người ta dùng Protease phân lập từ quan tiêu hóa động vật Ngày nay, việc đưa Protease tách từ vi khuẩn (B.mesentericus, B.subtilis), nấm mốc (A.Oryzae, A.flavus) vào công nghiệp thuộc da đem lại nhiều kết quan trọng Protease vi sinh vật sử dụng để làm tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin làm dính bết sợi tơ tự nhiên, làm bong tách rời loại tơ tằm để từ giảm lượng hóa chất cần để tẩy trắng 11 | P a g e CHƯƠNG 5: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZYME Bây tìm hiểu quy trình tách chiết Protease cụ thể: Ficin Ficin protease tìm thấy nhựa thuộc họ Ficus (sung, vả), thuộc họ Moraceae, Urticales Hầu hết phận có chứa nhựa bao gồm cao su 2,4%, Resin, Albumin, Cerin, đường, Malic acid, Rennin, Proteae, Diatase,… Người ta nhận thấy hoạt tính enzyme Ficin cao nhựa thu nhận vào buổi sáng sớm Do đó, nhựa sung thường thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng công nghệ thực phẩm I Phương pháp thu nhận Ficin thô từ sung sơ chế thành chế phẩm Enzyme Ficin Thu nhận Ficin thô: 11 Từ quả: sau hái rửa sơ, cắt nhỏ ngâm nước xay nhuyễn.Lọc qua vải thường, loại bỏ xác thu lấy dịch lọc Dịch lọc xác định đem xác định hoạt tính enzyme phương pháp Kunitz, từ xác định hoạt tính enzyme Ficin chứa dịch lọc Từ nhựa thân: nhựa sung thu vào buổi sáng từ 6-8 Nhựa sung bảo quản lạnh ngăn đơng có nhiệt độ thấp 00C Hoạt tính Protease nhựa tươi xác định phương pháp Kunitz Sơ chế dịch nhựa tươi thành chế phẩm Enzyme Ficin: - Dịch nhựa sung sau thu pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa 2ml nước cất -Khuấy dung dịch máy khuấy từ phút để enzyme hoà tan hoàn toàn nước -Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 vòng /phút thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại lắng xuống Loại bỏ phần lắng phía dưới, thu dịch bên -Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme ethanol 96% để thu lấy phân đoạn xác định hoạt tính enzyme phân đoạn 11 Các phương pháp tinh Enzyme_ GVHD Ths Đặng Thị Ngọc Dung_ Hóa Thực Phẩm 12 | P a g e -Những phân đoạn có hoạt tính enzyme pha lọc gel để loại bỏ tạp chất phân đoạn enzyme -Các phân đoạn sau qua cột gel xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 sấy khô nhiệt độ 400C Chế phẩm enzyme thu dạng bột bảo quản nhiệt độ 0-40C Ta biểu diễn việc thu nhận theo sơ đồ sau: II 12 Phương pháp tinh sạch: Việc làm enzyme việc loại protein enzyme, nước,các thành phần khác tế bào khỏi enzyme Cơng việc hồn tồn khơng dễ dàng Do đó, việc làm enzyme địi hỏi người làm nghiên cứu enzyme, hiểu biết enzyme phải nắm vững nhiều thao tác kỹ thuật khác để tránh gây tính hoạt động enzyme Trong dịch chiết, ngồi enzyme cịn chứa protein tạp nhiều chất khác cần phải tinh 12 Các phương pháp tinh Enzyme_ GVHD Ths Đặng Thị Ngọc Dung_ Hóa Thực Phẩm 13 | P a g e Để loại bỏ protein tạp tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biện tính chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion),điện di, phương pháp lọc gel Ở sâu quy trình phương pháp lọc gel việc tinh Ficin: Cách làm: + Nhồi cột: ngâm gel sephadex G75 dung dịch NaN3 0,02% 24 để gel trương nở hoàn toàn - Cho dung dịch đệm vào cột - Cho lớp gòn thủy tinh vào cột, đổ gel từ từ vào cột đến chiều cao cần thiết Trong trình đổ gel vào cột phải khuấy để gel đồng phải ý ln ln có lớp dung dịch đệm mặt để ngăn cản tượng khô gel Đặt lên gel lớp giấy lọc - Để cột ổn định vài giờ, rửa cột dung dịch đệm phosphate + Nạp mẫu: cân mẫu hoà tan mẫu vào 3-5 ml dung dịch đệm pH 6,1 cho nồng độ protein khoảng 10 mg/ml - Nạp mẫu vào cột, sau hết mẫu tiếp tục cho dung dịch đệm qua cột - Thu mẫu vào ống nghiệm, ống nghiệm chứa 2,5ml Mỗi phân đoạn thu thời gian 5-10 phút, đem phân đoạn đo OD 280nm Dồn chung phân đoạn có diện enzyme để đo hoạt tính xác định hàm lượng enzyme 14 | P a g e KẾT LUẬN Tóm lại, Protease loại enzyme xúc tác trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH)n phân tử protein hay polypeptide, có nguồn gốc đa dạng từ thực vật, động vật vi sinh vật Sự đa dạng không dừng lại nguồn gốc mà chức tính biệt hóa cao chúng, tính ứng dụng chúng ngành công nghiệp y học vô to lớn mặc cho quy trình tách chiết chế hoạt động phức tạp chúng 15 | P a g e ... lồi động vật có xương sống, nơi enzyme trypsin thực vai trò thủy phân protein Vi sinh vật5 Vi sinh vật nguồn thu nhận enzyme khổng lồ protease chúng sản xuất có tính đặc hiệu chất cao, protease. .. Nguồn gốc4: Protease có nguồn thu tới từ động vật, thực vật vi sinh vật Thực vật: Bromelin, glycoprotein, phân tử có glycan gồm maltose, glucosamine, xylose fructose tìm thấy thân dứa Loại protease. .. bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn Enzyme Protease_ Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm _Đại học Vinh 3|Page Subtilisin protease ban đầu thu từ Bacillus subtilis, vi khuẩn có khả tổng hợp protease
