TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc

Trang 13 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 14 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM CỦA S AUREUS 1.1.1 Đặc điểm sinh học S aureus tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ gây ngộ độc thực phẩm S aureus thuộc giống Staphylococcus, vi khuẩn hình cầu, khơng di động, gram dương, đường kính 0,5 - 1,5µm, tế bào xếp thành hình chùm nho (Hình 1.1), khơng di động, có vách tế bào kháng lysozyme nhạy với lysotaphin S aureus có tính hiếu khí kỵ khí tùy nghi, tăng trưởng khoảng nhiệt độ rộng, từ - 48oC, khoảng nhiệt độ tối ưu 30 - 45oC; tăng trưởng khoảng pH 4,2 - 9,3, pH tối ưu - 7,5; có tính chịu mặn tăng trưởng mơi trường chứa 15% NaCl; chịu áp suất thẩm thấu cao 33-55% saccharose bị ức chế 60% S aureus phân bố rộng tự nhiên phân lập từ da, màng nhày, tóc mũi người động vật máu nóng Vi khuẩn cịn diện khơng khí, bụi, nhạy với kháng sinh chất diệt khuẩn Mặt khác S aureus nhạy với nhiệt độ, bị diệt bị xử lý 60oC từ – 50 phút Vi khuẩn có tính cạnh tranh yếu, dễ bị vi sinh vật khác ức chế [19] A B Hình 1.1 Hình thái S aureus A Dưới kính hiển vi điện tử; B Dưới kính hiểm vi quang học Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 15 Về đặc điểm sinh hóa, S aureus có men catalase, cho phản ứng đơng huyết tương dương tính nhờ enzyme coagulase Phản ứng đơng huyết tương đặc trưng để phân biệt S aureus với tụ cầu khác S aureus cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả lên men sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose, nhạy với novobicine[4] Một số chủng S aureus có khả gây tan máu mơi trường thạch máu Hầu hết dịng S aureus tạo sắc tố vàng, thường thấy rõ sau - ngày ni cấy nhiệt độ phịng [25] Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc S aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính - 1,5mm, quanh khuẩn lạc có vịng sáng rộng - 5mm Trên môi trường Manitol salt agar (môi trường Chapman), khuẩn lạc S aureus có dạng trịn, bờ lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm làm vàng mơi trường xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.2.) A Mơi trường Bair-Paker B Mơi trường Chapman Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc S aureus môi trường Bair-Parker (A) môi trường Chapman (B) Đa số chủng S aureus tổng hợp hay nhiều độc tố ruột (enterotoxin) mơi trường có nhiệt độ 15oC, nhiều chúng tăng trưởng nhiệt độ 35 - 37oC [4] Các đặc tính sinh hóa S aureus phân biệt với Staphylococcus khác Micrococcus tổng hợp Bảng 1.1 Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 16 Bảng 1.1 Các đặc tính S aureus [12] Đặc tính Catalase Coagulase Thermonuclease Nhạy với Lysostaphin Sử dụng glucose Sử dụng manitol S aureus + + + + + + S epidermidis + + + - Micrococci + - 1.1.2 Các nhân tố độc lực S aureus gây nhiễm trùng, tạo mủ vết xây xước bề mặt da, gây nhiều bệnh truyền nhiễm viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu, viêm xương tủy, viêm màng tim S aureus nguyên nhân gây nhiễm trùng vết mổ nhiễm trùng dụng cụ y khoa Mặt khác S aureus gây ngộ độc thực phẩm độc tố ruột enterotoxin, gây hội chứng shock siêu kháng nguyên máu [62] Độc lực S aureus hình thành tác dụng phối hợp nhiều nhân tố độc lực khác sau * Staphylococcus aureus tạo nhiều yếu tố độc lực: - Protein nhận diện bám dính Bề mặt tế bào S aureus có adhesin protein với vai trị nhận diện bám dính, tạo protein gắn kết fibrinogen fibrinetin làm kích thích kết dính khối máu mô bị chấn thương Các protein gắn kết chất tạo keo thường gặp dòng gây bệnh viêm xương tủy viêm khớp - Các nhân tố xâm nhiễm S aureus tạo nhiều protein giúp vi khuẩn xâm nhập lan nhiễm vật chủ, gọi tên chung invasins, phận đóng vai trò quan trọng độc lực vi khuẩn Sau invasins S aureus + Hemolysin: độc tố tế bào có hoạt tính làm tan màng hồng cầu Ở S aureus độc tố gồm loại: (i) α-Hemolysin: độc tố tan màng mạnh tác dụng lên tiểu cầu bạch cầu người; (ii) β-Hemolysin có tác dụng phân hủy màng Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 17 giàu lipid, thường dùng làm thử nghiệm tan hồng cầu cừu; (iii) δ-hemolysin có hoạt tính làm tan màng số tế bào khác + Hyaluronidase: phân huỷ chất gian bào tế bào chủ giúp S aureus lan nhiễm vùng xung quanh + Catalase: thủy phân hydrogen peroxide ức chế hình thành gốc tự hệ thống myeloperoxidase tế bào chủ + Coagulase: tiết khỏi tế bào S aureus gắn với prothrombin hình thành phức hợp staphylothrombin làm đông fibrinogen máu, giúp vi khuẩn tránh cơng đại thực bào + Staphylokinase: có hoạt tính phân giải fibrin giúp cho S aureus lan nhiễm vật chủ + Các enzyme ngoại bào khác: Tnase enzyme kháng nhiệt, xúc tác hydrogen hóa DNA RNA tế bào chủ; DNase, protease, lipase thủy phân chất đại phân tử để cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn; FAME (fatty acid modifying enzyme) xúc tác phản ứng biến đổi giúp kéo dài sống S aureus - Các nhân tố chống lại phịng vệ vật chủ Ngồi protein có vai trị tăng cường xâm nhiễm vật chủ S aureus tạo protein giúp vi khuẩn chống lại hệ thống phòng vệ vật chủ làm tăng độc lực vi khuẩn, bao gồm: + Microcapsule: giúp vi khuẩn chống lại thực bào vật chủ + Protein A: protein bề mặt gắn phân tử IgG qua vùng Fc, cản trở phản ứng opsonin hóa thực bào hệ thống phịng vệ vật chủ + Leukocidin: có hoạt tính phân hủy màng tế bào bạch cầu yếu α-hemolysin, có 2% chủng S aureus phân lập có đến gần 90% chủng phân lập từ vết xước da + Siêu kháng nguyên (superantigen): S aureus tiết hai độc tố có hoạt tính siêu kháng nguyên TSST-1 (Toxic shock syndrom toxin) gây hội chứng sốc nhiễm độc tụ cầu (TSS) Enterotoxin gây nôn mửa, tiêu chảy, thường xảy vụ ngộ độc thực phẩm Hai siêu kháng nguyên kích hoạt 1/5 tế bào T khơng Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 18 chuyên biệt vốn không nhận kháng nguyên thông thường gây hội chứng sốc S aureus [62] 1.1.3 Ngộ độc thực phẩm S aureus a Triệu chứng ngộ độc thường gặp S aureus xem ba tác nhân vụ ngộ độc thực phẩm nhiều nước sau Salmonella Clostridium perfringens [31] [46] Triệu chứng thường gặp vụ ngộ độc S aureus buồn nơn, nơn mửa, đau bụng, có hay khơng có tiêu chảy, ngồi cịn bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp Các triệu chứng xuất khoảng - sau ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm dùng, lượng độc tố có thực phẩm, độ nhạy với độc tố sức khỏe người Thông thường, triệu chứng ngộ độc kéo dài khoảng - hết bệnh sau - ngày [4] b Ngộ độc S aureus giới Trên giới, vụ ngộ độc lớn S.aureus xảy vào năm 1884 Michigan (Mỹ) phô mai Các vụ ngộ độc lớn sau ghi nhận thịt bò, khơ bị bị nhiễm, sữa, bánh kem,… [12] Tại Mỹ, S aureus gây khoảng 14% vụ ngộ độc thực phẩm, gây thiệt hại khoảng 1,5 tỷ đô la năm; độc tố ruột A (SEA) chiếm 77,8%, độc tố D (SED) 37,5% độc tố B (SEB) 10% [46] Ở Nhật Bản, năm 2000, ngộ độc sữa độc tố A (SEA) S aureus gây ngộ độc cho 14.780 người lớn [42] Số liệu thống kê cho thấy năm 19941998 số trường hợp ngộ độc S aureus chiếm 3,1 - 11,9% vụ ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Nhật Bản Ở Tây Ban Nha, năm 2002, xảy ba vụ ngộ độc dùng thực phẩm bị nhiễm độc tố A (SEA) độc tố C (SEC) S aureus Ở Đài Loan, S aureus nguyên nhân gây 30% trường hợp ngộ độc thời gian từ 1986 đến năm 1995 Hầu hết vụ ngộ độc liên quan đến S aureus q trình chế biến bảo quản thực phẩm khơng tốt S aureus thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 19 tay người chế biến bị trầy xước hay ho, hắt Việc bảo quản thực phẩm không phù hợp giúp vi khuẩn tăng nhanh số lượng tạo độc tố (vi khuẩn tăng trưởng khoảng nhiệt độ từ - 48oC) Sự diện độc tố ruột S aureus không gây ảnh hưởng đến đặc tính cảm quan thực phẩm nên khó phát [53] c Tình hình nhiễm gây ngộ độc thực phẩm S aureus Việt Nam Tại Việt Nam ngộ độc thực phẩm xã hội quan tâm bùng nổ việc tiêu thụ thức ăn nhanh, thức ăn đông lạnh tình trạng hàng qn khơng hợp vệ sinh Trong số vụ ngộ độc thực phẩm vi khuẩn S aureus, Salmonella E coli tác nhân chiếm đa số Kết khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố thực phẩm chế biến sẵn chợ TP.HCM vài năm gần cho thấy tỷ lệ nhiễm S aureus cao 53% mẫu bánh mì thịt nguội, 90% mẫu thịt quay khảo sát [2] [3] Năm 2006, ghi nhận vụ ngộ độc thực phẩm 105 người Nha Trang thức ăn nhiễm độc tố ruột S aureus Cùng năm ghi nhận vụ ngộ độc nhà trẻ Huyện Phú Quốc, Kiên Giang yaourt bị nhiễm độc tố A (SEA) S aureus Tháng 12/2007 ghi nhận vụ ngộ độc thực phẩm S aureus số trường tiểu học, mầm non với 100 trẻ em bị ngộ độc Hiện S aureus xem tiêu vi sinh vật cần kiểm soát thực phẩm quan chức Việt Nam Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm nước ta qui định mật độ S aureus phép diện thực phẩm thay đổi tùy theo loại thực phẩm (0, 3, 10, 102 CFU/g ml thực phẩm) trình bày Bảng 1.2 Tuy nhiên, chưa có tiêu chuẩn kiểm sốt độc tố ruột SE thực phẩm Việt Nam Các cơng trình khác nghiên cứu độc tố ruột sản xuất ELISA để xác định độc tố ruột giới hạn phát SEA, thành phần kít ELISA nhập ngoại nhóm tác giả Lê Quang Hà CS (2009) Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nghiên cứu Bảng 1.2 Qui định mức cho phép diện S aureus thực phẩm Việt Nam Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 20 Nhóm thực phẩm Loại thực phẩm Phở, Bún khô Hủ tiếu ăn liền Sản phẩm từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ Thịt sản phẩm từ thịt Cá thủy sản TCVN6346 – 98 TCVN6347 – 98 TCVN6345 – 98 0CFU/g 0CFU/g 0CFU/g / / / 102CFU/g / / 10 CFU/g 102CFU/g 102CFU/g 10CFU/g 102CFU/g 0CFU/g Khơng có / / 102CFU/g / / 102CFU/g / / 10CFU/g / / 102CFU/g / / / / / / / 0CFU/g 10CFU/g / / 3CFU/g Sữa bột Sữa đặc có đường Sữa chua TCVN 5538:2002 TCVN 5539:2002 TCVN 7030:2002 10CFU/g 0CFU/g 0CFU/g 10CFU/g / Khơng có Sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002 0CFU/g Khơng có / / 102CFU/g / / 10CFU/g / / 3CFU/g Khơng có/ml / / / / 102CFU/g / / / 3CFU/g 102CFU/g Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ - có xử lý nhiệt trước sử dụng Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ - không qua xử lý nhiệt trước sử dụng Thịt tươi, Thịt đông lạnh Thịt chế biến khơng qua xử lý nhiệt, có xử lý nhiệt Thịt hộp Thịt tươi, đông lạnh, xay nhỏ, nghiền, (phải qua xử lý nhiệt trước xử dụng Cá thuỷ sản tươi Sản phẩm chế biến từ cá thủy sản không qua xử lý nhiệt Thủy sản khô sơ chế TCVN 7046:2002 TCVN 7047:2002 TCVN 7050:2002 TCVN 7049:2002 TCVN 7048:2002 Rau muối - rau khô Dầu mỡ Kem – nước đá Nước chấm nguồn gốc động, thực vật Sữa - sản phẩm từ sữa Trứng Nước giải khát nước uống Thức ăn dinh dưỡng đặc biệt Gia vị QĐ-BYT46/2007 TCVN Pho mát Trứng tươi, dịch trứng tươi đông lạnh Sản phẩm chế biến từ trứng Nước giải khát khơng cồn Nước giải khát có cồn Nước khống đóng chai Thức ăn khơ,thức ăn thay đặc biệt, phải xử lý nhiệt Thức ăn khô, dùng trực tiếp / TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam; QĐ-BYT: Quyết định Bộ Y tế Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 21 1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S AUREUS 1.2.1 Đặc điểm chung phân loại Độc tố ruột S aureus hay Staphylococcal enterotoxin (SE) protein có trọng lượng phân tử 25 - 29 kDa, chứa vòng cystein bên phân tử giúp ổn định cấu trúc phân tử có vai trò kháng protease độc tố Các SE dễ tan nước nước muối, có điểm đẳng điện pI - 8,6, (SEG, SEH có pI 5,6 5,7) [54] SE chứa nhiều lysine, axít aspartic, axít glutamic tyrosine, bền với hầu hết protease nên không bị thủy phân protease đường tiêu hóa Chúng cịn kháng với chymotrypsine, rennin papain [41] Mặt khác, SE có tính bền nhiệt khơng bị hoạt tính 100oC 30 phút [4], chí 121oC 28 phút Tuy nhiên tính bền nhiệt SE phụ thuộc vào môi trường, loại thực phẩm, độ pH, nồng độ muối nhiều yếu tố khác Ở nồng độ thấp thực phẩm SE bị bất hoạt điều kiện đóng hộp xử lý nhiệt để khử trùng đồ hộp [41] Do số lượng SE lớn nên cần thiết phải phân loại xếp chúng Năm 1962, việc dựa vào tính kháng nguyên độc tố SE chia thành loại theo mẫu tự la tinh độc tố A (SEA), B (SEB), C (SEC), D (SED) E (SEE) [53] Trong đó, SEC lại chia thành SEC1, SEC2, SEC3 Sau này, nhiều SE với gen tương ứng công bố đặt tên từ SEG đến SER SEU [38] Tuy nhiên, liên quan SE ngộ độc thực phẩm chưa rõ Do vậy, hầu hết bộ kít thương mại phát triển độc tố SE SEA, SEB, SEC, SED SEE, độc tố thường gặp ngộ độc thực phẩm S aureus [21] [38] Mặt khác, có khoảng 5% vụ ngộ độc S.aureus cho có nguyên nhân độc tố chưa xác định [52] - Độc tố A (SEA) Độc tố SEA mã hóa gen entA mang bacteriophage ơn hồ vi khuẩn [14] Gen entA mã hóa cho pre-SEA chứa 257 acid amin Khi Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 22 - Độc tố B (SEB) Độc tố SEB chứa 267 acid amin, trọng lượng phân tử 31,4 kDa mã hóa gen entB DNA vi khuẩn mang plasmid [55] [56] - Độc tố C (SEC) Độc tố SEC gồm loại SEC1, SEC2 SEC3 có trình tự acid amin giống SEC1 khác SEC3 acid amin SEC2 khác SEC3 acid amin Gen entC3 có chiều dài 801bp mã hóa pre-SEC3 chứa 267 acid amin với peptid tín hiệu 27 acid amin đầu N Sự cắt loại bỏ peptid tín hiệu tiết khỏi tế bào tạo thành SEC3 với 240 acid amin có hoạt tính [32] - Độc tố D (SED) Độc tố SED gồm 288 acid amin, độc tố mã hóa gen entD nằm plasmid Gen entD mã hóa cho pre-SED gồm 258 acid amin chứa peptid tín hiệu 30 acid amin - Độc tố E (SEE) Độc tố SEE protein 239 acid amin mã hóa gen entE có 81% tương đồng entA Gen entE mã hóa cho pre SEE chứa 257 acid amin - Các độc tố khác: + Độc tố SEG: chứa 233 acid amin tạo thành từ pre SEG chứa 258 acid amin có tính tương đồng cao với SEB, SEC SSA [44] + Độc tố SEH: phát gần có trọng lượng phân tử 27 kDa khơng có phản ứng chéo miễn dịch với SE xác định trước [60] + Độc tố SEI: loại độc tố gồm 218 acid amin hình thành từ preSEI, chứa 242 acid amin, có tính tương đồng thấp với SE khác [44] + Độc tố SEJ: có 245 acid amin có trình tự tương đồng đáng kể với SEA, SEE SED (64 - 66%) Bảng 1.3 tổng hợp đặc tính sinh hóa độc tố SE Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 24 1.2.3 Hoạt tính độc tố ruột SE a Hoạt tính siêu kháng nguyên Phân tử SE tác động trực tiếp lên chuỗi β thụ thể tế bào T phức hợp tương hợp mô MHC-2 không thông qua trình diện kháng ngun APC hoạt hóa tế bào Ở người, tỷ lệ tế bào T hoạt hóa bị nhiễm SE lên đến – 20% tế bào T Các tế bào T hoạt hóa tiết lượng lớn bất thường cytokine thường gây sốt Các protein có đặc tính tương tự SE gọi siêu kháng nguyên (superantigen) hay độc tố siêu kháng nguyên gây sốt (pyrogenic toxin superantigen, PTSA) [41] b Hoạt tính gây nơn Hoạt tính gây nơn chưa hiểu rõ, người ta cho độc tố SE có lẽ tác động trực tiếp lên biểu mô đường tiêu hố lên thần kinh phế vị gây kích thích trung tâm nôn gây nôn mửa triệu chứng ngộ độc SE Liều gây ngộ độc SE khoảng 0,1µg, thay đổi tùy độ mẫn cảm người Họat tính gây nơn cho có liên quan đến vịng cystine phân tử SE [41] 1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS TRONG THỰC PHẨM 1.3.1 Định lượng S aureus thực phẩm phương pháp nuôi cấy a Phương pháp đếm khuẩn lạc Mẫu thực phẩm cắt nhỏ xay nhuyễn máy điều kiện vô trùng thể đồng Nếu mẫu giữ đông phải làm tan băng trước xét nghiệm Mẫu thực phẩm chưa xét nghiệm phải bảo quản -20OC không ngày Thực phẩm khơ khơng cần bảo quản lạnh Cân xác 25g mẫu thực phẩm chuẩn bị hút xác 25ml mẫu thực phẩm lỏng cho vào chai dural chứa sẵn 225ml nước đệm phosphat (hay 90ml nước đệm phosphat) Lắc 2-3 phút thu dung dịch mẫu thử có độ pha lỗng 10-1 Mẫu pha loãng tiếp tục 10-2, 10-3, …tùy theo mức nhiễm loại mẫu cho cấy thể tích mẫu xác định lên đĩa thạch Baird Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 25 Parker, thạch Chapman thạch máu xuất khoảng 10 - 100 khuẩn lạc/ đĩa Sau 48 giờ, khuẩn lạc S aureus mơi trường Baid-Parker có đường kính khoảng 0,5 - 1mm, màu đen bóng, lồi, có vịng trắng đục hẹp vòng sáng rộng khoảng - 2mm quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc số dịng khơng tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc [54] Trên môi trường Chapman khuẩn lạc lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm (do sử dụng đường manitol màu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng), đường kính khuẩn lạc 0,1 - 1mm; sau 48 ni cấy khuẩn lạc có màu vàng đậm Trên môi trường thạch máu sau 24 ủ, S aureus cho khuẩn lạc bóng lống, đục lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng - 2mm Hầu hết S.aureus có vùng tan máu, nhiên số dịng khơng tạo vùng tan máu Chọn khuẩn lạc đặc trưng để thử phản ứng coagulase, dựa vào tỷ lệ khuẩn lạc cho kết qua coagulase (+), tính kết b Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp dùng để định lượng S aureus mẫu có mật độ S aureus thấp mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó xác định phương pháp đếm khuẩn lạc Dung dịch mẫu pha loãng thập phân với độ pha loãng liên tiếp Tùy theo yêu cầu độ xác kết phân tích, sử dụng phương pháp MPN với hệ thống ống nghiệm (3 độ pha loãng với lần lặp lại độ pha loãng) hay 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với lần lặp lại độ pha loãng) Trên sở ống cho kết dương tính ống mơi trường canh cấy chọn lọc khuẩn lạc đặc trưng mơi trường Baird Parker Chapman có phản ứng coagulase (+) tính kết dựa vào bảng MPN ống 15 ống để suy mật độ S aureus mẫu (số MPN/g hay MPN/ml) [54] 1.3.2 Phát định lượng S aureus thực phẩm phản ứng PCR Các tiến khoa học công nghệ ngày giúp cho việc xét nghiệm vi sinh vật trở nên nhanh, tiện, nhạy có tính chuyên biệt cao so với phương Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 26 pháp nuôi cấy Tại Việt Nam, việc phát S aureus thực phẩm thực chủ yếu phương pháp nuôi cấy Tuy nhiên nhược điểm lớn phương pháp thời gian phân tích kéo dài, phải - ngày cho kết thức Năm 2006, phương pháp PCR để phát S aureus thực phẩm thiết lập Việt Nam báo cáo nghiệm thu đề tài Khoa học Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử vào việc kiểm tra, giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, KC.04-30, Bộ Khoa học Công nghệ, 2006 tác giả Trần Linh Thước [5] dựa việc nhân đoạn gen nuc mã hóa cho protein nuclease chịu nhiệt đặc trưng cho S aureus với cặp mồi chuyên biệt cho sản phẩm PCR có kích thước 276bp Do S aureus thường diện với mật độ thấp thực phẩm, để làm tăng độ nhạy phát hiện, trước tiến hành thực phản ứng PCR cần phải qua bước tăng sinh môi trường không chọn lọc Qui trình phát S.aureus thực phẩm phản ứng PCR tiến hành qua bước sau: - Đồng tăng sinh 25g mẫu 225ml môi trường Saline Peptone Water (SPW) Trytone Soya Broth (TSB) máy dập mẫu Stomacher 30 giây, ủ 37oC 24 - 1ml dịch canh khuẩn sau tăng sinh ly tâm để thu sinh khối, rửa nước cất vơ trùng, huyền phù hóa với 1ml nước cất đun sôi cách thủy 10 phút Dịch đun sôi ly tâm để thu dịch chứa DNA mẫu - Phản ứng PCR thực dung tích 25μl gồm thành phần 2,5μl đệm dùng cho phản ứng PCR (10X); 2,5μl dNTP 100μM; 1,0μl Taq polymerase 1U; 1,0μl mồi (5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’) 6pM, 1,0μl mồi (5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’) 6pM; 3,0μl DNA khuôn; 14,0μl nước cất Mẫu ủ máy điều nhiệt theo chu kỳ 95oC phút để làm biến tính hồn tồn sợi DNA có mẫu Phản ứng PCR gồm 35 chu kỳ gồm bước sau: (i) Biến tính ban đầu 95oC phút; 35 chu kỳ gồm ba bước: biến tính 94oC 30 giây, bắt cặp 55oC 40 giây, kéo Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 27 dài 72oC 45 giây; (iii) ủ 72oC 10 phút sau 30oC 15 phút - Đọc kết quả: sản phẩm sau phản ứng PCR điện di gel agarose 2% điện 100V 45 phút nhuộm gel dung dịch ethidium bromide; sau quan sát kết hộp đèn UV có bước sóng 312nm, xuất vạch tương đương với 276bp kết luận có S aureus Đây phương pháp nhanh, có độ đặc hiệu cao cho phép phát S aureus mức 10CFU/25g thực phẩm sau 24 tăng sinh, cho kết sau 28 giờ, ngắn nhiều lần so với việc phát phương pháp truyền thống Qui trình PCR tiến hành đánh giá hiệu lực theo phương pháp công nhận rộng rãi giới cho thấy hoàn tồn thay phương pháp ni cấy để phát S aureus thực phẩm Qui trình PCR xét nghiệm S aureus thực phẩm ứng dụng để xét nghiệm định tính (0CFU/g) định lượng (≤ 10CFU/g, ≤ 102CFU/g) tùy thuộc vào tiêu chuẩn kiểm sốt phân nhóm thực phẩm theo qui định quan quản lý nhà nước Việc xét nghiệm định tính xét nghiệm định lượng khác bước đồng mẫu pha lỗng trước tăng sinh Các bước cịn lại hai qui trình xét nghiệm Sau đồng 25g mẫu 225ml môi trường tăng sinh Trytone Soya Broth (TSB) - Trường hợp xét nghiệm định tính (0CFU/g): hút 10ml dịch đồng (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh 37oC 24 trước thực phản ứng PCR Nếu phản ứng PCR dương tính kết luận mẫu chứa S aureus 1CFU/g (không đạt tiêu chuẩn) - Trường hợp xét nghiệm định lượng: + Xét nghiệm theo tiêu chuẩn ≤10CFU/g thực phẩm: hút 10ml dịch đồng (tương đương 1g mẫu) pha loãng 10 lần cách trộn với 90ml mơi trường TSB Nếu mẫu chứa 10CFU/g 100ml dịch pha loãng chứa 10CFU hay 1CFU/10ml Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh 37oC 24 trước Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 28 thực phản ứng PCR Nếu phản ứng PCR dương tính kết luận mẫu chứa 10CFU/g (không đạt tiêu chuẩn) + Xét nghiệm theo tiêu chuẩn ≤102CFU/g thực phẩm: hút 1ml dịch đồng (tương đương 0,1g mẫu) pha loãng 102 lần cách trộn với 99ml mơi trường TSB Nếu mẫu chứa 100CFU/g 100ml dịch pha loãng chứa 10CFU hay 1CFU/10ml Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh 37oC 24 trước thực phản ứng PCR Nếu phản ứng PCR dương tính kết luận mẫu chứa 102CFU/g (không đạt tiêu chuẩn) 1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ RUỘT SE TRONG THỰC PHẨM Việc phát độc tố ruột SE thực phẩm cần phương pháp nhạy với lượng thấp, 1ng/g thực phẩm lượng độc tố SE gây ngộ độc thực phẩm thay đổi từ đến 50 ng/g [54] Các phương pháp để phát định lượng độc tố thường sử dụng phương pháp miễn dịch bao gồm phương pháp khuyếch tán gel (gel diffusion), phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immunoassay :RIA), phương pháp RPLA (Reversed Passive Latex Aggulutination), ELFA (enzyme-linked fluorescent immunoassay), phương pháp ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) Sau số phương pháp phổ biến sử dụng để phát độc tố SE S aureus a Phương pháp khuếch tán thạch Trong phương pháp ống thạch khuếch tán, kháng thể kháng SE đặt đáy ống thạch dịch xét nghiệm cho vào phần đỉnh ống thạch Phản ứng độc tố kháng thể làm xuất vạch ngưng kết có chiều dài tăng theo thời gian độc tố khuyếch tán vào gel Phương pháp thường sử dụng làm phương pháp sàng lọc định tính để kiểm tra chủng S aureus tạo độc tố Đây phương pháp miễn dịch sử dụng nhiều năm trước Sử dụng microslide phương pháp nhạy phương pháp khuếch tán Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 29 thạch (50 – 100ng/ml), nhiên, cần có nhiều kinh nghiệm để giải thích kết Mặt dù vậy, độ nhạy phương pháp khuếch tán gel không đáp ứng yêu cầu phát liều gây độc SE thực phẩm [54] b Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immunoassay, RIA) Miễn dịch phóng xạ phương pháp đủ nhạy sử dụng để phát độc tố SE thực phẩm Trong phương pháp này, độc tố SE đánh dấu 125I Dịch chiết thực phẩm cho vào với kháng thể chuyên biệt ống nhựa nhỏ trước bổ sung độc tố đánh dấu Đo lượng phóng xạ 125 I phức hợp SE đánh dấu kháng thể để xác định lượng độc tố Hiện khơng cịn sử dụng phương pháp có phương pháp thay khơng cần dùng phóng xạ [54] c Phương pháp RPLA (Reversed Passive Latex Aggulutination) Phương pháp RPLA ứng dụng để phát độc tố thực phẩm chủng S aureus tạo độc tố Trong phương pháp này, hạt nhựa phủ kháng thể kháng độc tố trước bổ sung vào giếng Mẫu xét nghiệm bổ sung vào phản ứng; diện độc tố mẫu tạo ngưng kết độc tố kháng thể với mức độ ngưng kết tương quan với lượng độc tố Phương pháp có độ nhạy 10 - 20ng/ml đủ để phát độc tố hầu hết thực phẩm vụ ngộ độc [54] d Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme ELISA (Eenzyme linked immuno sorbent assay) ứng dụng phổ biến để phát độc tố SE thực phẩm [35] [50] Đây phương pháp đơn giản, nhạy, nhanh, phát định lượng độc tố Nhiều dạng ELISA khác dùng để phát định lượng kháng thể kháng nguyên dựa kháng nguyên hay kháng thể cố định pha rắn Nguyên tắc ứng dụng phương pháp ELISA trình bày sau + ELISA sandwich Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 30 Trong phương pháp này, kháng thể cố định lên bề mặt giếng, sau bổ sung kháng nguyên Phức hợp kháng nguyên - kháng thể phát kháng thể đánh dấu với enzyme có khả bắt kháng nguyên epitope khác Như vậy, kháng thể cố định lên giếng kháng thể phát phải tương tác với hai epitope khơng chồng lấp (Hình 1.3) ELISA sandwich phương pháp thường sử dụng Alkaline photphatase horseradish peroxidase enzyme thường chọn phương pháp Alkaline photphatase dễ cộng hợp với kháng thể hơn, màu tạo với chất ρnitrophenyl photphatase (pNPP) màu vàng, Horseradish peroxidase cho phản ứng nhạy hơn, kết hợp với chất cho màu xanh lá, xanh dương hay cam Phương pháp ELISA có độ nhạy 0,5ng độc tố/ml [54] + ELISA cạnh tranh ( Competitive ELISA) Thường sử dụng trường hợp kháng nguyên mục tiêu có kích thước q nhỏ, kháng ngun có epitope diện mẫu với số lượng độc tố vi sinh vật, dư lượng thuốc trừ sâu … Trong phương pháp này, kháng thể chuyên biệt phủ lên giếng; kháng nguyên chuẩn cộng hợp với enzyme kháng nguyên mẫu cạnh tranh với để gắn lên lượng kháng thể giới hạn cố định Kháng nguyên chuẩn cộng hợp enzyme pha loãng nồng độ tối ưu mà kháng nguyên tự mẫu cạnh tranh dễ dàng Dựa vào giảm tín hiệu màu so với đối chứng để định lượng mức độ diện kháng nguyên mẫu + ELISA trực tiếp (Direct ELISA) Phương pháp ELISA dùng để định tính định lượng diện kháng nguyên kháng thể mẫu Trong phương pháp này, kháng nguyên mục tiêu (hoặc kháng thể) cố định lên giếng, sau kháng thể chuyên biệt (hoặc kháng nguyên chuyên biệt) đánh dấu với enzyme bổ sung đo OD Do hình thành lớp phức hợp kháng nguyên - kháng thể nên ELISA trực tiếp có thao tác đơn giản, nhanh tránh phản ứng Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 31 chéo kháng thể thứ cấp mẫu Tuy nhiên, ELISA trực tiếp có độ nhạy thấp cần phải tự đánh dấu kháng thể tương ứng với kháng nguyên riêng biệt A Hình 1.10 ELISA cạnh tranh B C D Hình 1.3 Các dạng thử nghiệm ELISA phổ biến A, ELISA sandwich; B, ELISA cạnh tranh; C, ELISA trực tiếp; D, ELISA gián tiếp + ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Đây phương pháp ELISA phổ biến để kiểm tra độ đặc hiệu kháng nguyên chuyên biệt mẫu kháng huyết thanh, đóng vai trò quan trọng việc nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Trong phương pháp này, kháng nguyên cố định lên giếng; sau bổ sung kháng thể sơ cấp Phức hợp kháng nguyên - kháng thể nhận biết kháng thể thứ cấp cộng hợp enzyme Kháng thể thứ cấp kháng thể đa giá, dùng để kiểm tra nhiều loại kháng thể khác loài Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 32 1.5 XÁC ĐỊNH TIỀM NĂNG SINH ĐỘC TỐ CỦA CÁC CHỦNG S AUREUS BẰNG PHẢN ỨNG PCR DỰA VÀO GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ Phương pháp PCR ứng dụng để nhân gen entA, entB, entC, entD, entE mã hóa cho độc tố SEA, SEB, SEC, SED, SEE Phản ứng PCR dựa gen mục tiêu gen mã hóa cho độc tố SE dùng cho mục đích xác định phân biệt chủng S aureus theo độc tố để xác định khả tạo độc tố chủng theo gen mã hóa độc tố tương ứng Một phương pháp multiplex-PCR với cặp mồi chuyên biệt để nhân gen gen entA, entB, entC, entD entE thiết lập thành công cho sản phẩm PCR gen gen entA, entB, entC, entD entE có độ dài tương ứng 120bp, 478bp, 257bp, 317bp 170bp [49] 1.6 PHƯƠNG PHÁP TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG VÀO VIỆC PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH ELISA [20] [61] 1.6.1 Phương pháp tạo kháng thể đa dòng Việc sản xuất kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên bước quan trọng cần thiết cho thử nghiệm miễn dịch Hầu hết kháng nguyên có cấu trúc phức tạp, chứa nhiều epitope khác dẫn đến chọn lọc dòng tế bào B khác Kết trình đáp ứng miễn dịch vật chủ tạo kháng thể đa dòng gồm nhiều kháng thể đơn dòng, kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho epitope kháng nguyên [6] Để tạo kháng thể có hiệu giá cao yếu tố cần quan tâm là: - Liều lượng kháng nguyên: liều lượng kháng nguyên tối ưu giúp gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất; lượng kháng nguyên thấp cao dẫn đến tượng dung nạp kích thích đáp ứng miễn dịch Thơng thường, thỏ, liều tiêm thấp khoảng 10μg/lần tiêm, phổ biến 100μg/lần tiêm Liều dành cho chuột giảm 10 lần so với thỏ - Vật chủ: nhiều loài động vật có xương sống dùng để sản xuất kháng huyết kháng thể dùng phịng thí nghiệm chủ yếu thỏ, Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 33 chuột bọ Thông thường, thu 25ml huyết thanh/lần từ thỏ, 100 - 200 µl/lần từ chuột, - ml/lần từ bọ - Tá chất (adjuvant): có vai trị kích thích hệ miễn dịch tăng thời gian tồn kháng nguyên thể vật chủ Tá chất thường dùng hỗn hợp dầu, complete Freund’s adjuvant (CFA), ngồi cịn chứa thành phần vách tế bào vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Tuy nhiên, CFA gây viêm, loét tiêm với liều cao hay tiêm nhiều lần Do vậy, CFA dùng lần tiêm lần thay incomplete Freund’s adjuvant (IFA) IFA có thành phần tương tự CFA không mang vách tế bào vi khuẩn lao - Vị trí tiêm: chọn lựa tùy mục đích Tiêm da thường dùng cho thỏ, chuột, bọ Các vật liệu tiêm vào di chuyển nhanh chóng đến hệ thống bạch huyết tập trung hạch bạch huyết gần vị trí tiêm Thỏ thường tiêm lưng; chuột, bọ tiêm sau cổ hai bên háng Tiêm vào dùng nhằm mục đích phóng thích chậm kháng nguyên Chất tiêm vào tích tụ mô kháng nguyên di chuyển dần đến khoảng gian bào lân cận sau đến hạch bạch huyết lân cận Phương pháp khó sử dụng cho động vật gặm nhấm nhỏ chuột, dùng phổ biến cho thỏ động vật lớn Tiêm vào da nhiều vị trí khác lưng dùng phổ biến cho động vật lớn cho phép phóng thích kháng ngun với tốc độ chậm, thường dùng với kháng nguyên có nồng độ cao Tiêm vào tĩnh mạch dùng hầu hết động vật ni phịng thí nghiệm tiến hành tiêm nhắc kể từ lần thứ hai trở sau, dùng để tiêm lần đầu Tá chất khơng an tồn khơng thích hợp cho phương pháp này, nên sử dụng dung dịch đệm sinh lý Tiêm vào khoang bụng sử dụng cho chuột, bọ Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 34 1.6.2 Tinh chế đánh dấu kháng thể [9] [37] [61] a Tinh chế kháng thể Việc tinh chế protein nói chung kháng thể nói riêng dựa đặc điểm tính tích điện, kích thước, độ kỵ nước, diện nhóm chức chun biệt, protein Ngồi kháng thể cịn có số đặc điểm riêng thuận lợi cho việc tinh chế: điểm đẳng điện tương đối cao (khoảng 8,6; kháng thể thỏ có pI từ 8,4 đến 9,2) so với protein khác (khoảng - 7), protein huyết có pI 5, phân đoạn kháng thể có lực với số protein đặc biệt vùng Fc có lực cao với protein A G - Tủa phân đoạn protein hóa chất Khi hịa tan nước phân tử protein hydrate hóa Khi có diện muối có tính tan cao ammonium sulfate bão hòa, protein bị khử nước bị kết tủa Do protein diện dung dịch bị tủa với mức độ khác (tủa phân đoạn) tùy thuộc vào đặc tính protein nồng độ amonium sulfate khác Việc kết hợp bước tinh chế với số phương pháp tinh chế khác sắc ký trao đổi ion hay sắc ký lọc gel cho phép thu nhận kháng thể với độ tinh mong muốn Mặt khác, acid caprylic tủa hầu hết protein huyết trừ IgG nên dùng phương pháp kết hợp với tủa phân đoạn ammonium sulfate bão hòa để tinh chế kháng thể Kết tinh phương pháp lên đến 99 % - Phương pháp tinh chế kháng thể qua sắc ký cột protein A G Phương pháp sắc ký lực cột protein A G sử dụng phổ biến tinh chế kháng thể có tính chọn lọc cao, đạt độ tinh lên đến 99% Protein A có nguồn gốc từ vách tế bào S aureus Protein G có nguồn gốc từ Streptococcus Cả hai protein có lực cao vùng Fc kháng thể IgG Mặt khác, lực hai loại protein kháng thể phụ thuộc vào điều kiện pH nên đặc tính ứng dụng để dung ly kháng thể khỏi cột b Đánh dấu kháng thể Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 35 Trong phản ứng ELISA, kháng thể cần đánh dấu enzyme hiển thị giúp định lượng mức độ diện kháng nguyên mục tiêu mẫu thông qua thay đổi màu sắc, phát huỳnh quang phản ứng xúc tác enzyme Sự cộng hợp (gắn cộng hóa trị) enzyme vào kháng thể tối ưu hiệu suất cộng hợp cao vị trí xác định kháng thể enzyme mà khơng làm hoạt tính kháng thể hay enzyme Các nhóm chức kháng thể dùng để gắn cộng hóa trị với enzyme là: + Nhóm amin bậc (-NH2): diện nhiều vùng Fc kháng thể Đây nhóm chức biến đổi dễ dàng, sử dụng phổ biến việc đánh dấu kháng thể Các gốc đường phân tử enzyme ơxi hóa thành nhóm aldehyde hay cetone, nhóm tương tác với nhóm NH2 kháng thể tạo nên hợp chất trung gian carbinolamine chứa nối NH - C Do nối NH - C dễ bị thủy giải nên đơi điện tử từ nhóm amin chuyển vào nối đơn carbinolamine hình thành nối đôi phân tử Schiff base Các tác nhân ơxi hóa mạnh periodate, glutaraldehyde thường dùng để hoạt hóa enzyme có chất glycoprotein hỗ trợ cho hình thành Schiff base phản ứng cộng hợp kháng thể - enzyme (Hình 1.4.) Vùng carbohydrate chứa nhóm cis-diol: vùng bị ơxi hóa hình thành O Enzyme NH2 H Enzyme N CH nhóm aldehyde hoạt độC ng dùng cho mục đích cộng hợp, diện vùng Fc Cộng bỏ in, tuLoại hợp thông qua carbonhydrate cần nhiều bước so với cộng (CH hợp2)am y nhiên (CH2)3 kháng thể sau cộng hợp có hoạt tính cao lượng thừa GA C C + Nhóm sulhydryl (-SH): nằm cystein hoặcOlà kết Hcủa trình H O vùng lề kháng thể, cộng hợp thông qua sulhydryl khử cầu nối disulfite cần nhiều bước cho hoạt tính khánNH g thể sau cộng hợp cao Antibody Enzyme N C H (CH2)3 H C N Antibody Hình 1.4 Cơ chế hình thành Schiffbase phương pháp cộng hợp kháng thể enzyme thơng qua nhóm NH2 1.6.3 Xây dựng qui trình ELISA sandwich Hình 10 Cơ chế hình thành Schiff base phương pháp cộng hợp hai bước dùng GA Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 36 + Vùng carbohydrate chứa nhóm cis-diol: vùng bị ơxi hóa hình thành nhóm aldehyde hoạt động dùng cho mục đích cộng hợp, diện vùng Fc Cộng hợp thông qua carbonhydrate cần nhiều bước so với cộng hợp amin, nhiên kháng thể sau cộng hợp có hoạt tính cao + Nhóm sulhydryl (-SH): nằm cystein kết trình khử cầu nối disulfite vùng lề kháng thể; cộng hợp thông qua sulhydryl cần nhiều bước cho hoạt tính kháng thể sau cộng hợp cao 1.6.3 Các bước qui trình ELISA sandwich Qui trình ELISA sandwich để định lượng kháng nguyên kháng thể bao gồm bước sau: (i) Phủ kháng thể kháng nguyên lên bề mặt giếng, rửa phần thừa; (ii) Khóa vị trí khơng có kháng nguyên kháng thể để tránh kết dương tính giả; rửa phần thừa; (iii) Bổ sung kháng nguyên kháng thể cần phát hiện; rửa phần thừa; (iv) Nếu chất phản ứng bước (iii) kháng nguyên bổ sung kháng thể thứ hai kháng lại kháng nguyên (kháng thể cộng hợp enzyme); chất phản ứng bước (iii) kháng thể bổ sung kháng thể thứ cấp kháng kháng thể ban đầu (kháng thể thứ cấp cộng hợp với enzyme); rửa để loại bỏ phần thừa; (iv) Bổ sung chất; phản ứng chuyển hóa chất xác định enzyme tạo sản phẩm có màu thơng qua cường độ màu để định lượng nồng độ kháng thể kháng nguyên mẫu a Phủ giếng (Coating) Hầu hết đĩa microplate dùng cho ELISA làm từ polystyrene Việc gắn kháng nguyên hay kháng thể lên giếng chủ yếu dựa vào tương tác kỵ nước protein với chuỗi carbon chứa vòng benzen bề mặt giếng microplate Một số microplate có bề mặt giếng xử lý để làm tăng tương tác kỵ nước nhóm carboxyl (COOH), hydroxyl (OH), nhóm amin, hydrazine N-oxysuccinimide Mặt khác, chất kỵ nước bề mặt polystyren, việc phủ giếng cần tiến hành pH lớn pI protein để tránh lực đẩy tĩnh điện Trong trường hợp kháng thể, bám vào bề mặt giếng diễn tốt pH - dung dịch muối giúp trì hịa tan cấu hình tự nhiên Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 37 protein Ba loại dung dịch đệm phủ giếng sử dụng rộng rãi 50mM carbonate pH 9,5, 10mM Tris pH 8,5, 10mM Phosphate Buffer Saline pH 7,2 Thời gian nhiệt độ hai yếu tố quan trọng việc kiểm soát lượng protein cố định Sự bám dính tốt có khác biệt giếng đĩa ủ qua đêm (16 - 18 giờ) 4oC Thời gian ủ rút ngắn cách ủ nhiệt độ phòng (2 - giờ) 37oC (2 giờ) Nồng độ protein tối ưu cho bước phủ giếng cần xác định qua thực nghiệm Thường dao động khoảng từ 1µg/ml đến 5µg/ml kháng thể 1µg/ml đến 20µg/ml kháng nguyên Độ tinh cao protein giúp giảm phản ứng chéo nâng cao độ nhạy b Khóa giếng (Blocking) Việc phủ kháng thể kháng ngun cịn để lại vị trí cịn trống bề mặt giếng cần khóa để tránh gắn khơng đặc hiệu tác chất bước dẫn đến hệ làm tăng tín hiệu giảm độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Hai loại chất khóa giếng thường sử dụng protein chất hoạt động bề mặt Tween-20 Triton X-100 Các protein dùng để khóa giếng phổ biến là: sữa gầy nồng độ - 5% pha - ngày trước sử dụng, casein 0,5 - 1%, gelatin cá 0,5 - 1% c Rửa Bước ủ cho phép tương tác đặc hiệu có lực cao hình thành protein Bằng cách rửa vài lần lần ủ, chất phản ứng dư thừa loại bỏ Mặt khác, bên cạnh tương tác đặc hiệu có lực cao, ln có tương tác có lực thấp chất phản ứng Dung dịch rửa phải có khả phá vỡ tương tác có lực thấp để rửa tương tác Dung dịch rửa nên chứa nồng độ muối thích hợp để tránh phần tương tác bị biến tính trì hoạt tính enzym Các dung dịch đệm thường sử dụng PBS, Tris d Phát Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc ... vùng Fc kháng thể IgG Mặt khác, lực hai loại protein kháng thể phụ thuộc vào điều kiện pH nên đặc tính ứng dụng để dung ly kháng thể khỏi cột b Đánh dấu kháng thể Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang... nhanh tránh phản ứng Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 31 chéo kháng thể thứ cấp mẫu Tuy nhiên, ELISA trực tiếp có độ nhạy thấp cần phải tự đánh dấu kháng thể tương ứng với kháng nguyên riêng... bụng sử dụng cho chuột, bọ Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc Trang 34 1.6.2 Tinh chế đánh dấu kháng thể [9] [37] [61] a Tinh chế kháng thể Việc tinh chế protein nói chung kháng thể nói riêng dựa đặc