(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chức năng của gen abcc4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -z Trần Quốc Đạt NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4 LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ BẰNG MƠ HÌNH RUỒI GIẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 12/2019 download by : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Quốc Đạt NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4 LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ BẰNG MƠ HÌNH RUỒI GIẤM Chun ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trọng Tuệ PGS TS Võ Thị Thương Lan HÀ NỘI - 12/2019 download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để thực thành công luận văn này, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Trọng Tuệ - Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội PGS.TS Võ Thị Thương Lan – Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN – người thầy trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm quý báu, cho hành trang để bước vào nghề, bước vào nghiệp nghiên cứu khoa học Họ người thầy, người cô mang đến cho tơi tình u niềm đam mê khoa học, nhắc nhở, bảo ban động viên suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS Matsamitsu Yamaguchi nhóm nghiên cứu ruồi giấm Khoa Sinh học Ứng dụng, Học viện Công nghệ Kyoto– người giúp đỡ nhiều trình học tập trao đổi ngắn hạn Nhật Bản Thầy người hỗ trợ nhiều việc thu thập dòng ruồi giấm cần thiết cho nghiên cứu, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị để tơi hồn thành tốt đề tài Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để học tập nghiên cứu Trong thời gian thực luận văn, xin cảm ơn quan tâm, giúp đỡ động viên anh chị thuộc nhóm nghiên cứu ứng dụng mơ hình ruồi giấm bạn đồng nghiệp Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ, ủng hộ động viên nhiều để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Học viên download by : skknchat@gmail.com Trần Quốc Đạt download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Quốc Đạt, học viên cao học khoá 26, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan: Đây luận văn trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Trọng Tuệ PGS.TS Võ Thị Thương Lan Cơng trình nghiên cứu hồn tồn khơng trùng lặp với cơng trình nghiên cứu khác Các số liệu thông tin nghiên cứu xác, trung thực khách quan Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Học viên Trần Quốc Đạt download by : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC Mở đầu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hội chứng rối loạn phổ tự kỷ 1.1.1 Chẩn đoán 1.1.2 Nguyên nhân 1.1.3 Điều trị 1.2 Tổng quan ruồi giấm 1.2.1 Chu kỳ vòng đời 1.2.2 Hệ gen ruồi giấm 1.3 Ứng dụng mơ hình ruồi giấm nghiên cứu 12 1.4 Hệ thống kiểm soát biểu gen GAL4-UAS ứng dụng nghiên cứu mơ hình ruồi giấm 16 1.4.1 Hệ thống GAL4/UAS 16 1.4.2 Phương pháp knockdown gen kỹ thuật RNAi biểu gen knockdown hệ thống GAL4/UAS 17 1.5 Họ gen ABC gen ABCC4 18 1.5.1 Tổng quan họ gen ABC 18 1.5.2 Gen ABCC4 19 1.6 Ứng dụng mơ hình ruồi giấm nghiên cứu rối loạn tự kỷ 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Nguyên vật liệu, hoá chất thiết bị 22 2.2.1 Nguyên vật liệu hoá chất 22 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp lai tạo dòng ruồi giấm knockdown biểu dABCC4 mô não ruồi 24 2.3.2 Phương pháp đánh giá biểu protein ABCC4 mô não ruồi giấm kỹ thuật western blotting 26 2.3.3 Đánh giá khả vận động ruồi giấm thí nghiệm leo trèo 27 2.3.4 Phương pháp đánh giá khả tương tác xã hội 28 2.3.5 Phương pháp đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm (activity assay) 29 2.3.6 Phương pháp đánh giá tuổi thọ ruồi giấm (viability assay) 30 2.3.7 Xác định thay đổi cấu trúc mối nối thần kinh phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 31 2.3.8 Phân tích kết 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 So sánh mức độ tương đồng protein ABCC4 người ruồi giấm 36 download by : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm 3.2 Kết đánh giá mức độ biểu protein ABCC4 mô não ruồi giấm 37 3.3 Kết đánh giá khả vận động tương tác ruồi trưởng thành 40 3.4 Kết xác định nhịp sinh học ruồi giấm 43 3.5 Kết xác định thay đổi cấu trúc mối nối thần kinh (neuromuscular junction-NMJ) ruồi giấm phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 46 3.6 Kết đánh giá tuổi thọ ruồi giấm 49 KẾT LUẬN 51 Tài liệu tham khảo download by : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC HÌNH Hình Hoạt động lưu trữ thao tác ruồi giấm thực nghiệm Hình 2: Chu kỳ vịng đời ruồi giấm Hình 3: Quy tắc kí hiệu kiểu gen ruồi giấm ứng dụng viết phép lai 10 Hình Chức quan có tương đồng người ruồi giấm 11 Hình 5: Bảo tồn mặt chức quan hệ thần kinh (A) hệ vận động (B) người ruồi giấm 12 Hình 6: Phương pháp chuyển gen vào ruồi giấm sử dụng vectơ P-element 13 Hình 7: Hoạt động hệ thống GAL4/UAS 17 Hình 8: Cơ chế RNA can thiệp (RNA interference – RNAi) 18 Hình 9: Sơ đồ cấu trúc vùng chức protein ABC 19 Hình 10: Sơ đồ miêu tả trình lai tạo dịng ruồi giấm thí nghiệm chế hoạt động thành phần lai F1 25 Hình 11: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả leo trèo 27 Hình 12: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả tương tác xã hội ruồi giấm 29 Hình 13: Thiết kế thí nghiệm xác định nhịp sinh học ruồi giấm 30 Hình 14: Cấu trúc thần kinh (neuromuscular junction)ở ấu trùng ruồi giấm 32 Hình 15: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nghiên cứu 35 Hình 16: Mức độ tương đồng protein ABCC4 người ruồi giấm 36 Hình 17: Kết western blotting xác định mức độ biểu protein dABCC4 mô não ruồi giấm 38 Hình 18: Thí nghiệm hành vi tương tác xã hội ruồi giấm trưởng thành 41 Hình 19: Kết thí nghiệm leo trèo xác định khả vận động ruồi giấm trưởng thành thời điểm ngày tuổi, ngày tuổi 14 ngày tuổi 42 Hình 20: Kết xác định nhịp sinh học ruồi giấm 44 Hình 21: Kết phân tích nhịp thức-ngủ ruồi giấm 45 Hình 22: Kết phân tích cấu trúc thần kinh (neuromuscular junction-NMJ) ruồi giấm phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 47 Hình 23: Kết xác định mật độ protein BRP vùng hoạt động trước synap ấu trùng ruồi giấm phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 48 Hình 24: Biểu đồ đánh giá tỷ lệ sống ruồi giấm 50 download by : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Tiếng Anh Chú thích Tiếng Việt ABCC4 ATP-binding cassette subfamily C member Thành viên số phân lớp C protein bám ATP ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ ATP Adenosine Triphosphat BRP Brurchpilot dsRNA double stranded RiboNucleic Acid DLG Disc-large HRP Horseradish Peroxidase HL3 hemolymph-like saline IR Inverted Repeat kDal kilo Dalton NBD Nucleotide Binding Domain Vùng bám nucleotide NGS Normal goat serum Huyết dê NMJ Neuromuscular-junction Mối nối thần kinh PBS Phosphat Buffer Saline PFA Paraformandehide RISC RNA induced silencing complex Phức hệ gây bất hoạt RNA RNAi RNA interference RNA can thiệp RT-PCR Reverse transcription – Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR sử dụng enzyme phiên mã ngược TMD Transmembrane Domain Vùng xuyên màng UAS Upstream Activation Sequence Trình tự hoạt hóa thượng nguồn MSSR Subsynap Reticulum Vùng synap RNA mạch đôi Enzyme củ cải ngựa Trình tự lặp-đảo download by : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm Mở đầu Theo tiêu chuẩn DSM-IV (The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders – 5th Edition), tự kỷ tình trạng rối loạn hành vi nghiêm trọng, nằm nhóm rối loạn phát triển lan tỏa (pervasive developmental disoders) Gần đây, rối loạn phổ tự kỷ tự kỷ tên gọi chung cho toàn thể bệnh Bệnh đặc trưng tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp bao gồm khiếm khuyết tương tác xã hội, phát triển ngôn ngữ kỹ giao tiếp kết hợp với hành vi cứng nhắc, lặp lặp lại Do mang đồng thời nhiều triệu chứng nên gọi rối loạn phổ tự kỷ (autism spectrum disorder - ASD) Bệnh phân loại gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ rối loạn phát triển lan tỏa không đặc hiệu khác Việc nghiên cứu bệnh mức độ phân tử tế bào trở nên khó khăn nhà khoa học tính phức tạp trở ngại việc lựa chọn, xây dựng mơ hình thực nghiệm Hầu hết nghiên cứu dừng lại mức độ in vitro, tập trung vào việc phát đột biến gen cho liên quan đến bệnh mà chưa sâu vào nghiên cứu mức độ in vivo Mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang lại giá trị to lớn nghiên cứu bệnh học phân tử với nhiều ưu điểm như: vòng đời ngắn, sinh trưởng nhanh, đồ hệ gen giải mã chi tiết, có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người, hạn chế pháp lý thử nghiệm, dễ tạo dòng, dễ chuyển gen biểu protein ngoại lai Cấu trúc chức hệ cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hoá…được bảo tồn ruồi giấm người, ruồi giấm biến đổi gen thực mơ hình lý tưởng để nghiên cứu bệnh lý người đặc biệt bệnh lý thần kinh Trên giới, có nghiên cứu sử dụng mơ hình ruồi giấm để xác định mối liên quan đột biến số gen với bệnh tự kỷ việc giảm biểu gen (knockdown) hệ thần kinh, đồng thời phân tích ảnh hưởng gen liên quan đến biểu hành vi, khả vận động, khả sống sót, thay đổi nhịp sinh học biến đổi cấu trúc thần kinh NMJ ruồi giấm Một nghiên cứu gần knockdown gen ABCA13 (ATP-binding cassette subfamily A member 13) – gen thuộc họ ABC có vai trị quan trọng việc vận chuyển lipid, ion, vitamin, chất hữu số phân tử thuốc qua màng tế bào cho thấy giảm tương tác rõ download by : skknchat@gmail.com ... KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Quốc Đạt NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4 LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ BẰNG MƠ HÌNH RUỒI GIẤM Chun ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA... mơ hình ruồi giấm nghiên cứu rối loạn tự kỷ Trên giới có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mơ hình để mô bệnh lý rối loạn tự kỷ người với mục tiêu xác định tác động yếu tố gen, môi... đến rối loạn tự kỷ lại chưa biết đến chưa có nghiên cứu mơ hình động vật xác định vai trị sinh bệnh học gen Trên sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu vai trò gen ABCC4 liên quan đến rối