Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa ở Thừa Thiên Huế

Nghiên cứu đã phân lập được 47 chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen (N) từ 5 mẫu đất trồng lúa trên địa bàn xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế. Từ đó chọn được hai chủng N36 và N37 có khả năng cố định N mạnh với sinh khối khô đạt 7,47-8,82 mg/mL và hàm lượng NNH4 + đạt 562,72-646,27 mg/L.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITROGEN TỪ ĐẤT TRỒNG LÚA Ở THỪA THIÊN HUẾ Phạm Thị Ngọc Lan, Hoàng Dương Thu Hương* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế *Email: thuhuongcnk32@gmail.com Ngày nhận bài: 18/5/2021; ngày hoàn thành phản biện: 31/5/2021; ngày duyệt đăng: 02/11/2021 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân lập 47 chủng vi khuẩn có khả cố định nitrogen (N) từ mẫu đất trồng lúa địa bàn xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế Từ chọn hai chủng N36 N37 có khả cố định N mạnh với sinh khối khô đạt 7,47-8,82 mg/mL hàm lượng NNH4+ đạt 562,72-646,27 mg/L Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy cho thấy hai chủng vi khuẩn có tích lũy sinh khối khả cố định N mạnh mơi trường có pH 6,5 sau thời gian 4-5 ngày Từ khóa: chủng vi khuẩn, cố định nitrogen, điều kiện nuôi cấy MỞ ĐẦU Trong trình sinh trưởng phát triển trồng, nitrogen nguồn dinh dưỡng hàng đầu, nguồn nitrogen sử dụng phổ biến phân đạm hóa học Tuy nhiên, lượng phân bón hóa học dư thừa gây ảnh hưởng xấu đến trồng, sức khỏe người môi trường sinh thái Do vấn đề đặt cần có biện pháp để bổ sung dinh dưỡng cho trồng mà không gây tác hại đến môi trường người Hiện nay, loại phân bón vi sinh nghiên cứu đưa vào sử dụng thay phân hóa học sản xuất nông nghiệp đạt nhiều hiệu Một vi sinh vật quan trọng sử dụng sản xuất phân bón vi sinh nhóm vi khuẩn có khả cố định nitrogen Vì vậy, khn khổ báo này, tiến hành phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả cố định nitrogen mạnh làm sở cho nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh hữu ích góp phần nâng cao chất lượng phân vi sinh sử dụng trồng lúa nước loài trồng đất ướt 87 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa Thừa Thiên Huế PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, địa điểm thời gian thực Các chủng vi khuẩn có khả cố định N phân lập từ mẫu đất vùng rễ lúa Địa điểm thu mẫu: Xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2020 đến tháng 05/2020 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập đếm số lượng tế bào Từ mẫu đất ướt thu mẫu ruộng lúa địa bàn Xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế , sử sụng phương pháp Koch để phân lập vi khuẩn có khả cố định N mơi trường Ashby thạch đĩa [2] Xác định số lượng tế bào vi khuẩn mẫu phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch đĩa [2] 2.2.2 Sơ tuyển vi khuẩn hiếu khí có khả cố định N Ni cấy trực tiếp vi khuẩn môi trường Ashby thạch đĩa nhiệt độ 30OC thời gian ngày sau xác định sinh trưởng phát triển khuẩn lạc thạch đĩa [2] 2.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn có khả cố định N Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vịng/phút) vi khuẩn mơi trường Ashby dịch thể có pH 7, lượng giống cấy vào bình thí nghiệm mL dịch tế bào/50 mL môi trường, nuôi cấy 30OC ngày Ly tâm thu dịch nuôi cấy, xác định hàm lượng N-NH4+ tạo thành phương pháp so màu với thuốc thử Nessler [1] Phần cặn sấy khô tuyệt đối để xác định sinh khối vi khuẩn 2.2.4 Xác định đặc điểm hình thái Quan sát đại thể môi trường thạch đĩa, sử dụng phương pháp làm tiêu nhuộm đơn để quan sát hình thái tế bào [2] 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tuyển chọn Tối ưu hóa số điều kiện ni cấy: Thời gian độ pH thích hợp cho sinh trưởng, phát triển khả cố định N vi khuẩn phương pháp “một lúc – biến” (one – variable – at – a – time – method) 88 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) 2.2.6 Xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Excel 2016 phân tích ANOVA (Duncan’s test p < 0,05) chương trình SPSS 20.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập đánh giá khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn cố định N Từ mẫu đất trồng lúa xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, tiến hành phân lập thu 47 chủng vi khuẩn có khả cố định N Hình Vi khuẩn cố định N phân lập môi trường Ashby thạch đĩa Để đánh giá khả sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn phân lập, tiến hành nuôi cấy chúng môi trường Ashby thạch đĩa pH Sau ngày ni cấy, dựa vào kích thước bề dày khuẩn lạc để đánh giá sơ khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Kết trình bày bảng Bảng Khả sinh trưởng phát triển chủng phân lập Khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn Kích thước khuẩn lạc (mm) Số chủng Tỷ lệ (%) Yếu 11 4,26 89 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa Thừa Thiên Huế Kết bảng cho thấy, khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn môi trường không giống Số chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển yếu trung bình chiếm tỷ lệ cao (27,66% - 51,06%), chủng mạnh mạnh chiếm tỷ lệ thấp (4,26% - 17,02%) Theo nghiên cứu Phạm Thị Ngọc Lan cộng (2016), phân lập chủng vi khuẩn cố định N đất rừng ngập mặn Thừa Thiên Huế tuyển chọn chủng có khả cố định N mạnh (chiếm tỷ lệ 4,17%) [3] Cũng theo công bố Phạm Thị Ngọc Lan cộng (2020), số 101 chủng vi khuẩn có khả cố định N phân lập từ đất trồng rau có 13 chủng có khả cố định N mạnh, chiếm tỷ lệ thấp [4] Như thấy rằng, tỷ lệ vi khuẩn có khả cố định N mạnh nghiên cứu chiếm tỷ lệ tương đương với nghiên cứu trước tác giả khác khả cố định N vi khuẩn đất 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả cố định N mạnh Trong số chủng vi khuẩn phân lập được, chủng có khả sinh trưởng phát triển mạnh chọn để tiến hành nhân nuôi môi trường Ashby dịch thể Sau ngày nuôi cấy, xác định sinh khối khơ hàm lượng N-NH4+ tích lũy môi trường phương pháp so màu với thuốc thử Nessler bước sóng 425 nm Kết trình bày bảng Bảng Khả sinh trưởng phát triển cố định N chủng vi khuẩn STT Chủng Hàm lương N-NH4+ (mg/L) Sinh khối khô (mg/mL) N27 308,14d 6,80bc N30 441,30c 5,96cd N33 515,72bc 6,19cd N34 468,72bc 6,11cd N35 430,86c 5,79cd N36 562,72ab 7,47b N37 646,27a 8,82a N38 501,36bc 5,69d Ghi chú: Sự sai khác chữ cột biểu sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) 90 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) Kết bảng cho thấy số chủng vi khuẩn nghiên cứu có hai chủng có khả sinh trưởng phát triển mạnh môi trường Ashby dịch thể N36 N37 Trong đó, chủng N37 có sinh khối tích lũy mạnh (8,82 mg/mL) hàm lượng N-NH4+ cao (646,27 mg/L) Chủng N36 có khả tạo sinh khối lớn (7,47 mg/mL) hàm lượng N-NH4+ cao (562,72 mg/L) Do đó, chúng tơi chọn hai chủng N36 N37 làm đối tượng cho nghiên cứu Theo Phạm Thị Ngọc Lan cộng (2016), số 137 chủng vi khuẩn cố định N phân lập từ đất rừng ngập mặn Thừa Thiên Huế, chủng V94 có khả cố định N mạnh với hàm lượng N-NH4+ 3,566 mg/L sau ngày nuôi cấy [3] Kết thấp so với nghiên cứu chúng tơi, điều điều kiện môi trường khác nhau, khả sinh trưởng cố định N chủng vi khuẩn có khác biệt 3.3 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 3.3.1 Chủng N36 - Khuẩn lạc nhầy, suốt, tròn, mép tròn đều, dày, không tiết sắc tố môi trường Đường kính khuẩn lạc đạt 13 mm sau ngày ni cấy [Hình 2] - Tiến hành nhuộm đơn chủng N36 quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng N36 có hình que ngắn, kích thước nhỏ nằm riêng lẽ Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng N36 (x100) 3.3.2 Chủng N37 - Khuẩn lạc nhầy, suốt, trịn, mép khơng đều, dày, khơng tiết sắc tố mơi trường Đường kính khuẩn lạc đạt 12,5 mm sau ngày ni cấy [Hình 3] - Tiến hành nhuộm đơn chủng N37 quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x100, kết cho thấy tế bào chủng N37 có hình que ngắn, kích thước nhỏ nằm riêng lẽ 91 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa Thừa Thiên Huế Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng N37 (x100) 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh trưởng, phát triển cố định N vi khuẩn Để thăm dị ảnh hưởng thời gian ni cấy đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn, tiến hành nuôi cấy lắc hai chủng N36 N37 môi trường Ashby dịch thể Sau mốc thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6, ngày xác định hàm lượng NNH4+ sinh khối khô Kết thể bảng Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển tích lũy N-NH4+ hai chủng N36 N37 Chủng N36 Thời gian nuôi cấy (ngày) Chủng N37 Sinh khối khô Sinh khối Hàm lượng N-NH (mg/L) (mg/mL) 4+ khô Hàm lượng N-NH4+ (mg/L) (mg/mL) 1,37d 238,73f 1,82f 210,45g 7,13ab 465,46d 6,80de 476,77e 7,42ab 555,10c 8,07bc 541,18d 7,82a 703,49a 8,81b 659,98b 7,34ab 640,83b 10,32a 777,04a 6,48b 586,87c 7,69cd 582,95c 5,23c 390,61e 5,99e 448,49f Ghi chú: Sự sai khác chữ cột biểu sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) 92 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) Kết bảng cho thấy, sau ngày nuôi cấy, sinh khối khô hàm lượng NNH4+ bắt đầu tăng mạnh chủng đạt cực đại sau ngày nuôi cấy chủng N36 sau ngày nuôi cấy chủng N37, sau sinh khối hàm lượng NNH4+ giảm dần ngày nuôi cấy Theo Đỗ Kim Nhung cộng (2011) nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả cố định N 12 chủng vi khuẩn Azospirillum spp cho kết thời gian nuôi cấy tối ưu ngày nuôi cấy [6], kết tương đương với nghiên cứu 3.5 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng, phát triển cố định N vi khuẩn Độ pH môi trường điều chỉnh khoảng 5,5 - 8,0; sau thời gian ni cấy thích hợp (4 ngày chủng N36 ngày chủng N37) xác định hàm lượng N-NH4+ sinh khối khô Kết thể bảng Kết nghiên cứu cho thấy, hai chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng phát triển khoảng pH rộng pH 6,5 thích hợp Khi pH mơi trường tăng lên, sinh khối khả tích lũy N-NH4+ chủng vi khuẩn giảm Kết nghiên cứu Đỗ Hoành Quân (2011) hai chủng vi khuẩn có khả cố định N Az03 Az07 thuộc chi Azotobacter phân lập từ đất canh tác, xác định pH thích hợp cho chủng nghiên cứu 7,0-7,5 [7] Theo Trần Hải Minh (2012), pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển cố định N chủng vi khuẩn Azotobacter 6,8 [5] Bảng Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng, phát triển tích lũy N-NH4+ hai chủng N36 N37 Chủng N36 pH Chủng N37 Sinh khối khô Hàm lượng NNH4+ (mg/L) Sinh khối khô (mg/mL) Hàm lượng NNH4+ (mg/L) (mg/mL) 5,5 6,31cd 583,39d 8,97c 628,21d 6,0 8,57ab 726,56b 9,97b 765,29b 6,5 10,20a 814,03a 11,60a 836,65a 7,0 7,80bc 690,44b 11,32a 785,74b 7,5 7,29c 640,83c 9,15c 703,93c 93 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa Thừa Thiên Huế Chủng N36 Chủng N37 Sinh khối pH khô Hàm lượng NNH4+ (mg/L) Sinh khối khô (mg/mL) Hàm lượng NNH4+ (mg/L) 561,63d 8,02d 560,32e (mg/mL) 5,29d 8,0 Ghi chú: Sự sai khác chữ cột biểu sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) KẾT LUẬN Trong 47 chủng vi khuẩn cố định N phân lập từ mẫu đất trồng lúa Thừa Thiên Huế, tuyển chọn chủng N36 N37 có khả cố định N mạnh với hàm lượng N-NH4+ 562,72 mg/L 646,27 mg/L Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển cố định N chủng vi khuẩn: - Chủng N36: thời gian nuôi cấy ngày, pH môi trường 6,5 - Chủng N37: thời gian nuôi cấy ngày, pH môi trường 6,5 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đoàn Văn Cung, Phạm Văn Quyến, Trấn Thúc Sơn, Nguyễn Văn Sức, Trần Thị Tâm (1998) Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [2] Phạm Thị Ngọc Lan (2012) Giáo trình thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Huế [3] Phạm Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Việt (2016) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất rừng ngập mặn Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế , Tập 4, Số 1, tr 63-72 [4] Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thị Thanh Xuân, Ngô Thị Bảo Châu (2020) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng rau thành phố Pleiku, tỉnh Gia Lai, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế , Tập 17, Số 2, tr 117-126 [5] Trần Hải Minh (2012) “Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa”, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Đại học Nha Trang [6] Đỗ Kim Nhung, Vũ Thành Công (2011) Khảo sát khả sinh tổng hợp IAA cố định đạm vi khuẩn Gluconacetobacter sp Azospirillum sp phân lập từ mía, Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ, Số 18a, tr 161-167 [7] Đỗ Hoành Quân (2011) “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu đặc tính tăng trưởng, cố định đạm vi khuẩn Azotobacter - thử nghiệm trồng”, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 94 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 19, Số (2021) ISOLATION AND SELECTION OF NITROGEN-FIXING BACTERIA FROM SOIL OF RICE FIELDS IN THUA THIEN HUE PROVINCE Pham Thi Ngoc Lan, Hoang Duong Thu Huong* Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University *Email: thuhuongcnk32@gmail.com ABSTRACT In this study, 47 nitrogen-fixing bacteria strains (N) were isolated from five soil samples of rice fields in Huong Toan Commune, Huong Tra District, Thua Thien Hue Province Two strains of N36 and N37 that show strong nitrogen-fixation capacity (dry biomass at 7,46-8,83 mg/mL and N-NH4+ concentration at 562,72646,27 mg/L) were selected Our findings in the culture condition optimization indicate that these two nitrogen-fixing bacteria strains have the highest biomass and the strongest nitrogen-fixation ability at pH 6,5, after four to five days of culture Keywords: Bacteria strains, culture condition, nitrogen fixation Phạm Thị Ngọc Lan sinh ngày 01/01/1963 Hà Tĩnh Năm 1984, bà tốt nghiệp cử nhân Sinh học trường Đại học Tổng hợp Huế Năm 1995, bà tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Hóa sinh – Sinh lý thực vật Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Năm 2004, bà tốt nghiệp tiến sĩ chuyên ngành Sinh lý thực vật Đại học Huế Hiện nay, bà giảng viên Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Lĩnh vực nghiên cứu: Vi sinh vật học, Vi sinh môi trường, Ứng dụng vi sinh vật sản xuất, Phân bón Vi sinh, Enzyme vi sinh vật Hồng Dương Thu Hương sinh ngày 30/04/1990 Bà tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học năm 2013, tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học năm 2015 Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Hiện nay, bà giảng dạy Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 95 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa Thừa Thiên Huế 96 .. .Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitrogen từ đất trồng lúa Thừa Thiên Huế PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, địa điểm thời gian thực Các chủng vi khuẩn có khả cố định. .. LUẬN 3.1 Phân lập đánh giá khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn cố định N Từ mẫu đất trồng lúa xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, tiến hành phân lập thu 47 chủng vi khuẩn. .. trước tác giả khác khả cố định N vi khuẩn đất 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả cố định N mạnh Trong số chủng vi khuẩn phân lập được, chủng có khả sinh trưởng phát triển mạnh chọn để tiến hành