tiểu luận CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG sản XUẤT ENZYME PROTEASE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG KHOA HĨA CƠNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Lý Thùy Trâm Lớp: 18SH Nhóm: Sinh viên thực hiện: Cao Hoàng Minh Phượng Nguyễn Phượng Hà Nguyễn Văn Nguyên Hoàng Thị Quyên Nguyễn Thị Trâm Tổng quan 1.1 Enzyme protease Protease hay gọi Peptidase hay Proteinase Nó enzyme thủy phân có khả cắt đứt liên kết peptide phân tử Polypeptide, protein, số chất tương tự.​ Protease chất protein sinh vật (động vật, thực vật vi sinh vật) tổng hợp nên, tham gia vào phản ứng hóa sinh học, có đặc tính: - Khơng độc hại, thân thiện với môi trường - Tham gia phản ứng tế bào sống tế bào sống (trong ống nghiệm) - Tham gia xúc tác phản ứng thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hồn tồn lượng dự trữ hợp chất hóa học - Phản ứng enzyme tiêu hao lượng ít, hiệu suất tốc độ cao - Có tính chọn lọc cao - Chịu điều khiển gen điều kiện phản ứng Cơ chế xúc tác trình thủy phân: E + S ↔ ES ↔ E + P 1.1.1 Phân loại Protease (peptidase) thuộc phân lớp lớp thứ hệ thống phân loại enzyme (E.C.3.4) Phân loại protease Với enzyme protease có nhiều cách phân loại ta dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng: Dựa vào vị trí tác dụng protease lên peptide phân tử protein, người ta chia protease làm nhóm chính: - Exopeptidase (Dựa vào vị trí tác động mạch polypeptide): + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi polypeptide để giải phóng acid amin, dipeptide tri peptide + Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C chuỗi polypeptide giải phóng acid amin dipeptide - Endopeptidase (Dựa vào động học chế xúc tác): + Serine proteinase: protein chứa nhóm –OH gốc serine trung tâm hoạt động có vai trị đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzyme Nhóm bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm enzyme động vật chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh vùng kiềm tính thể tính đặc hiệu chất tương đối rộng + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm proteinase thực vật papayin, bromelin, vài protein động vật protein kí sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu chất rộng + Aspartic proteinase: Hầu hết aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trung tâm hoạt động thường hoạt động mạnh pH trung tính + Metallo proteinase: Metallo proteinase nhóm proteinase tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc vi sinh vật bậc cao Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính hoạt độ giảm mạnh tác dụng EDTA Dựa vào thành phần amino acid vùng pH tối ưu protease, người ta chia làm nhóm: - Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động vùng pH acid 2-4 - Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin,… hoạt động vùng pH kiềm 9-11 - Protease trung tính: papain từ đu đủ, bromelain từ dứa,… hoạt động vùng pH trung tính 7-8 1.1.2 Nguồn thu nhận: Protease chủ yếu thu nhận từ nguồn chính: - Nguồn động vật: + Tụy tạng: nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài có nhiều enzyme + Dạ dày bê: ngăn thứ tư dày bê có tồn enzyme thuộc nhóm Protease tên renin Enzyme từ lâu dùng phổ biến công nghệ phomat Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả kết tủa mơi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+ Đây q trình đơng tụ sữa điển hình, nghiên cứu ứng dụng đầy đủ + Từ ruột cá basa: Dịch trích ly enzyme thu từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao 15.78 UI/gCKNT điều kiện trích ly: tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w), pH 9.5: nhiệt độ 35oC: thời gian trích ly 10 phút - Nguồn thực vật: Có loại protease thực vật Bromelain (thu từ chồi dứa, vỏ dứa (pineapple pant)), Papain (thu từ nhựa củ lá, thân, đu đủ (Carica papaya)) Ficin (thu từ nhựa cọ ( Ficus carica)) - Nguồn vi sinh vật: nguồn thu nhận enzyme khổng lồ, enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn,…gồm loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces số loại nấm men - Nguồn vi khuẩn: Protease động vật thực vật chứa hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả sinh hai loại trên, protease vi khuẩn có tính đặc hiệu chất cao Chúng có khả phân hủy tới 80% liên kết peptide phân tử protein Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% sản lượng enzyme sử dụng - Nguồn nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả tổng hợp lượng lớn protease ứng dụng công nghiệp thực phẩm chủng: Aspergillus, A.terricola, A.saitoi,… Các nấm mốc có khả ba loại protease: acid, kiềm trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu protease acid, có khả thủy phân protein pH 2.5-3 Một số nấm mốc A.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti…cũng có khả tổng hợp protease có khả đơng tụ sữa sử dụng sản xuất phomat - Nguồn xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn nghiên cứu vi khuẩn nấm mốc Tuy nhiên, người ta tìm số chủng có khả tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.Terimosus,… 1.1.3 Ứng dụng - Chế biến thịt: làm mềm thịt, giảm thời gian chín - Cơng nghiệp chế biến sữa: khả làm đông tụ sữa, ứng dụng sản xuất mát - Công nghiệp sản xuất bia rượu: + Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay + Giảm thời gian lên men + Hiệu suất thu hồi tăng + Bia, rượu thành phẩm đạt tiêu quy định tốt khoảng 30% + Nâng cao hiệu kinh tế, giảm chi phí sản xuất - Cơng nghiệp sản xuất bánh quy: làm giảm thời gian đảo trộn, tăng độ dẻo làm nhuyễn bột, tạo độ xốp nở tốt - Công nghiệp sản xuất nước chấm (đặc biệt quan trọng ngành sản xuất nước mắm): + Sử dụng enzyme từ nguồn tự nhiên: động vật (trong nội tạng gia súc), thực vật (đu đủ, khóm, ), vi sinh vật ( nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, ) + Phương pháp sử dụng: • Sử dụng dạng thô: cho nguyên liệu có enzyme vào chượp với tỉ lệ định • Sử dụng dạng chiết xuất: chiết enzyme từ nguyên liệu thành dạng tinh chế sau cho vào chượp 1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae A oryzae loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus (họ Trichocomaceae, Eurotiales) Đặc điểm: - Cấu tạo đa bào thuộc loại vi hồn khuẩn, có hình dáng đính bào tử - Vi nấm thể, mọc thành lớp mốc màu đen, vàng - Cơ thể sinh trưởng hệ sợi, phân nhánh có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào, sợi mảnh, chiều ngang khoảng 5-7µm - Sinh sản bào tử - Giàu enzyme thủy phân nội bào ngoại bào 2 Quy trình cơng nghệ Phương pháp nuôi cấy: a Phương pháp nuôi cấy bề mặt: Là phương pháp tạo môi trường để vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường Về bản, nguyên liệu môi trường dinh dưỡng phải cung cấp đủ chất dinh dưỡng như: nitro, carbon, vitamin, muối khoáng cho vi sinh vật phát triển Tuy nhiên, muốn có mơi trường dinh dưỡng tốt bổ sung thêm nito vô nito hữu chất cảm ứng khác tùy loại enzyme Đối tượng sử dụng: các loại nấm mốc A oryzae, A niger Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng môi trường đặc Môi trường lỏng: • Vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường, tạo khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng pha khí • Vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào tách từ sinh khối hòa tan vào dung dịch môi trường, enzyme nội bào nằm sinh khối vi sinh vật • Chiều cao mơi trường lỏng phải tính tốn kỹ khoảng 12-15 cm Nếu q lớn vi sinh vật khơng đồng hóa hết chất dinh dưỡng phía đáy khay ni cấy Nếu chiều cao nhỏ, thiếu thành phần dinh dưỡng, hiệu suất thu hồi enzyme không cao Mơi trường đặc: • Đây mơi trường sử dụng phần lớn nhà máy sản xuất enzyme • Vi sinh vật không phát triển bề mặt mơi trường, mà cịn nằm hẳn lịng mơi trường • Vi sinh vật nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường sinh tổng hợp enzyme ngoại bào nội bào Các enzyme ngoại bào thấm vào hạt mơi trường, cịn enzyme nội bào năm sinh khối vi sinh vật • Mơi trường ni cấy phải có độ ẩm thích hợp, có độ xốp cao Thơng thường người ta tạo độ ẩm khoảng 55-65% hợp lý Nếu sử dụng cám ngun liệu phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho khơng khí dễ dàng xâm nhập vào lịng mơi trường b Phương pháp nuôi cấy chìm: Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng môi trường lỏng thực thùng lên men Trong thiết bị lên men, thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH nồng độ chất dinh dưỡng Phương pháp đòi hỏi phải vô trùng tuyệt đối khâu vệ sinh tổng hợp, trùng thiết bị, trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác ni cấy, khơng khí cung cấp cho q trình ni cấy Đới tượng sử dụng: các loại vi khuẩn (Bacillus susbtilis, E.Coli), nấm men (Kluyveromyces lactis, Saccharomyces fragilis) Nuôi cấy bề mặt Ưu điểm Nuôi cấy chìm - Dễ thực hiện, q trình cơng - Ít diện tích nghệ thường khơng phức tạp - Có thể tự động hóa giới - Đầu tư đơn giản tốn kém, vận hóa mức độ cao hành đơn giản khơng cần dùng - Có thể thực liên tục thiết bị phức tạp nồi lên men nối tiếp thay - Lượng enzyme tổng hợp theo mẻ Do đó, kiểm sốt chất cao nhiều so với nuôi cấy lượng lên men dễ dàng chìm - Chế phẩm enzyme thơ sau thu nhận dễ sấy khô bảo quản - Trường hợp nhiễm vi sinh vật lạ, dễ xử lý mơi trường tĩnh Nhược điểm - Phải có diện tích lớn - Sự nhiễm cục dễ kéo theo nhiễm tồn hệ thống thời - Khó giới, tự động hóa, cần gian ngắn nhiều nhân cơng - Chi phí lớn Dựa vào bảng so sánh hai phương pháp thì phương pháp nuôi cấy bề mặt thích hợp cho chủng nấm mốc A.Oryzae nên nhóm chọn sử dụng phương pháp THUYẾT MINH QTCN a Xử lý nguyên liệu - Mục đích: Việc chuẩn bị nguyên liệu làm nguyên liệu giúp trình sản sinh enzyme đạt hiệu suất cao tránh tạp nhiễm loại bỏ chất cặn bẩn, tạo kích thước tối ưu để q trình lên men tốt - Tiến hành: Cám trấu mua trực tiếp từ xí nghiệp xay xát gạo Gentraco (Cần Thơ) Trấu từ kho chứa đưa đến thiết bị sàng để loại bỏ tạp chất Cám gạo từ bunke chứa đưa đến máy nghiền khô để tránh tượng vón cục, tạo kích thước tối ưu b Phối trộn - Mục đích: Trộn thành phần môi trường dinh dưỡng Tạo điều kiện thuận lợi cho trình lên men sau - Cách tiến hành: Hỗn hợp cám gạo, trấu gelatin định lượng trộn theo tỉ lệ tính tốn môi trường bao gồm 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin bổ sung làm chất cảm ứng Sau làm ẩm mơi trường 60% Máy trộn liên tục kiểu băng tải c Hấp khử trùng - Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật - Tiến hành: Hấp nồi hấp khử trùng nhiệt độ 121°C d Làm nguội, làm tơi - Mục đích: Khối mơi trường vừa hấp xong cịn nóng dính bết Vì phải làm nguội làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống phân phối vào dụng cụ nuôi Yêu cầu thời gian phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên Nhiệt độ yêu cầu đạt để gieo giống 35 – 39° C thiết bị làm nguội e Giống Aspergillus oryzae nhận từ Viện Nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ nuôi cấy bề mặt thạch môi trường PGA (Potato, Glucose, Agar) đem ủ 30° C ngày để tăng sinh f Ni cấy - Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển sinh enzyme - Cách tiến hành: Tiến hành nuôi cấy nấm mốc phịng trùng, giống sau q trình nhân giống cấp đưa vào nuôi cấy khay khử trùng Trong q trình ni không cần điều chỉnh pH môi trường Đây môi trường bán rắn nên thay đổi pH vị trí khơng ảnh hưởng đến tồn mơi trường Độ ẩm 96% ÷ 98% Thời gian ni cấy nấm mốc khoảng 30 ÷ 60 giờ, trung bình 42 Q trình ni cấy mơi trường bán rắn nuôi phương pháp bề mặt trải qua giai đoạn sau: • Giai đoạn (Từ ni đến nuôi thứ 10-12): trương nở bào tử xuất cuống nấm, W= 55-60%, φ =96-100%, T=30-32 C • Giai đoạn (kéo dài 10-18h): phát triển mạnh, dẫn đến tượng kết bánh môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, T=38-40 C Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-30 C cần thơng gió (quạt) bão hồ ẩm khơng khí phịng ni • Giai đoạn (kéo dài 10-20h ): tạo enzyme nhiều Cường độ trao đổi chất giảm chút ít, nhiệt toả nên tốc độ bốc nước môi trường nuôi cấy giảm theo thiết bị nuôi cấy g Chế phẩm thô - Mục đích: Thu chế phẩm enzyme protease, chế phẩm gọi enzyme thơ ngồi thành phần enzyme chúng chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường nước - Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme khơng bị hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến độ ẩm thấp (thường dùng máy sấy chân không) Nhiệt độ sấy khoảng 10-30°C Sau qua thiết bị đóng gói ta enzyme thơ Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta sử dụng enzyme mà khơng cần phải tinh Trong trường hợp khác ta phải tiến hành tinh enzyme để bảo quản lâu máy sấy chân khơng h.nghiền - Mục đích: Vừa phá vỡ tế bào, vừa làm nhỏ thành phần chế phẩm enzyme thô Khi thành tế bào bị phá vỡ, enzyme bên dễ dàng giải phóng mơi trường bên ngồi - Cách tiến hành: Lượng canh trường sau nuôi cấy vận chuyển lên bunke chứa cho vào máy nghiền trục Máy nghiền trục i Lọc - Mục đích: loại bã, lấy phần dịch lọc Tiến hành: lọc thiết bị lọc chân không thùng quay lọc lấy phần dịch, phần bã loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc Thiết bị lọc chân không thùng quay j Kết tủa enzyme - Mục đích: thu nhận enzyme tinh - Tiến hành:trong công nghiệp tinh chế enzyme, người ta sử dụng muối amoni sunfat dung môi ethanol k Ly tâm Mục đích: tách enzyme kết tủa khỏi dung mơi thiết bị ly tâm lắng l sấy - Mục đích: nhằm thu enzyme kỹ thuật Tách nước khỏi dung dịch mà khơng làm thay đổi tính chất enzyme nhằm bảo quản lâu thiết bị sấy chân không KẾT LUẬN Protease enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực, đó, đặc biệt cơng nghiệp thực phẩm Protease có đóng góp to lớn việc phục vụ, nâng cao đời sống người Hiện giới công nghệ thu nhận Protease từ vi sinh vật phát triển nhanh chóng, tìm tịi nghiên cứu khả ứng dụng enzyme Protease Ở Việt Nam có nhiều cơng trình cơng bố việc nghiên cứu sử dụng Protease chủ yếu tập trung vào Protease thực vật động vật protease vi sinh vật nghiên cứu chục năm trở lại Công nghệ enzyme nước ta mẻ, giai đoạn hưởng ứng ngày hoàn thiện dần lĩnh vực tương lai Do việc sâu tìm hiểu enzyme Protease, nguồn thu nhận Protease từ vi sinh vật ứng dụng đề tài mang tính thời đại, cấp thiết tình hình Việt Nam hội nhập mạnh mẽ với kinh tế giới ... Protease Ở Vi? ??t Nam có nhiều cơng trình cơng bố vi? ??c nghiên cứu sử dụng Protease chủ yếu tập trung vào Protease thực vật động vật protease vi sinh vật nghiên cứu chục năm trở lại Công nghệ enzyme. .. phần lớn nhà máy sản xuất enzyme • Vi sinh vật không phát triển bề mặt mơi trường, mà cịn nằm hẳn lịng mơi trường • Vi sinh vật nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường sinh tổng hợp enzyme ngoại bào... phẩm Protease có đóng góp to lớn vi? ??c phục vụ, nâng cao đời sống người Hiện giới công nghệ thu nhận Protease từ vi sinh vật phát triển nhanh chóng, tìm tịi nghiên cứu khả ứng dụng enzyme Protease