Vector

KHÁI NIỆM Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài gắn các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC THÁI NGUYÊN

BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG

VECTOR

SV THỰC HIỆN: NGUYỄN HOÀNG LINH NGUYỄN HỮU HOÀN NGÔ MẠNH LINH

GV HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN VŨ THANH THANH

1 KHÁI NIỆM

2 CÁC ĐẶC ĐIỂM

3 ỨNG DỤNG

4 CÁC BƯỚC CHÍNH TRONG TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP

5 CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG

6 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CHO VECTOR BIỂU HIỆN GEN

7 THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

I KHÁI NIỆM

 Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài ( gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ gen của tế bào chủ

II CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA VECTOR

vững của DNA tái tổ hợp và

không gây biến động cho tế

bào chủ

• Ngoài ra còn cần một số yếu

tố và trình tự cần thiết khác

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

III ỨNG DỤNG

• Tạo dòng và khuếch đại

• Nghiên cứu về sự biểu hiện của một trình tự

DNA

• Chuyển gen

• Sản xuất RNA

• Sản xuất protein

DNA tế bào cho cùng một

loại emzim giới hạn

B3: Nối DNA plasmid và DNA

tế bào cho nhờ enzim nối

ligase tạo thành vector

tái tổ hợp

TÕ bµo cho Vi khuÈn

V CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG

Plasmid là DNA xoắn kép dạng vòng có kích thước

nhỏ, tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men

1.2 Tên gọi:

+ p : viết thường (plasmid)

+1 hoặc 2, 3 chữ tiếp theo chỉ tên tác giả phát

hiện hoặc tên vi khuẩn chứa plasmid

+ Số thứ tự chỉ chủng vi khuẩn

VD: pBR322 (B- Bolivar, R- Rodriguez)

1.3 Phân loại: Plasmid đã được cải tiến qua 3 thế hệ

 Plasmid thế hệ thứ nhất: Là các plasmid tự

nhiên và nay hầu như không còn sử dụng

 Plasmid thế hệ thứ hai, thứ ba: là những

plasmid được cải tiến, mang các gen

đa cắt nối (Polylinker) hoặc gen chỉ thị.

 Plasmid thế hệ thứ 2: pBR322

Mang gen kháng thuốc Amp và Tet, có trình tự khởi đầu sao chép (ori) và một số trình tự RE.

 Plasmid thế hệ thứ 3: Là các plasmid đa năng

(poly linker) và chuyên dụng

 NHÓM pUC

• Có kích thước 2,6kb

• Mang gen kháng Amp

• Chứa một phần gen Lac Z’

• Có chứa poly linker.

 Nhóm plasmid pBluescript

• Có kích thước khoảng 3kb

• Có ưu thế nhất, kế hợp

được tất cả các ưu điểm

của 2 loại trên

pBluescript II

1.4 TẠO DÒNG TRONG PLASMID

 Nguyên tắc: DNA của plasmid được cắt bằng RE và

nối in vitro với đoạn DNA ngoại lai tạo ra các plasmid tái

tổ hợp, sau đó chúng được dùng để biến nạp vào vi khuẩn

 Phương thức tạo dòng. Một số phương thức được

dùng để phân biệt giữa các thể̉ tái tổ̉ hợp và tái tạo lại vòng như sau:

– Khử hoạt tính bằng chèn đoạn

– Tạo dòng định hướng

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

 Tạo dòng theo phương thức khử hoạt tính bằng chèn đoạn

 Tạo dòng định hướng

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Hệ thống chuyển gen bằng xung điện

1.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn (tế bào vật chủ)

Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E coli

Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp

2 Vector là cosmid

 Cosmid là vector được thiết kế từ plasmid và đầu cos

của phage λ

1 Các đặc điểm chính vector cosmid

 Một gen kháng kháng sinh và một origin khởi đầu của plasmid

 Các plasmid mạnh có thể được gắn thêm đoạn đa cắt nối (Polylinker)

 Kích thước nhỏ cho phép các đoạn DNA eukaryote dài khoảng 45 kb có thể thích ứng

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Cosmid: vector pWEB-TNC

3 Các vector phage λ

 Cấu trúc: - Phage λ là DNA mạch thẳng dài 50kb

- Hai đầu là mạch đơn bổ sung với 12

nucleotid mang trình tự cos

- Có đoạn giữa 20 kb không mang chức

Tạo dòng trong phage λ :

• Nguyên tắc: Vùng DNA không mang chức năng

(stuffer) của phage λ được cắt bỏ và nối in vitro 2

nhánh của chúng với các đoạn gen ngoại lai có kích

thước khoảng 20 kb

• Các bước tạo dòng:

- Tinh sạch DNA phage λ sau khi đã được cắt bởi RE

- Các nhánh phải và trái được liên kết với DNA ngoại lai với trình tự bổ sung

- Xác định DNA ngoại lai nằng phương pháp lai axit nucleic

- Tinh sạch và chọn tế bào chủ phù hợp

4 Vector là nhiễm sắc thể nhân tạo

 Nhiễm sắc thể nhân tạo là vector được thiết kế

cho phép cài đoạn DNA insert với khich thước lớn

 Phân loại: thường được sử dụng với hai loại:

Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn BAC

Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men YAC

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

4.1 BAC ( Bacteria Artificial Chromosom)

 CẤU trúc: - Được thiết kế dựa trên cơ sở plasmid F-factor

- Mang đoạn ori, các gen chỉ thị đặc hiệu, đoạn

đa cắt nối (Polylinker) và promotor đặc hiệu, gen kháng

kháng sinh

 Ưu điểm: Ổn định

Dễ biến nạp

Dễ tinh sạch

Tốc độ sinh trưởng trong vật chủ E coli cao

Cho phép gắn đoạn DNA insert có kích thước

từ 100_ 300 kb

Nhiễm sắc thể nhân tạo: pBACe3.6

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

4.2 YAC ( Yeast Artificial Chromosom)

 Cấu trúc: YAC là các vector mạch thẳng dựa trên cấu trúc

nhiễm sắc thể tự nhiên của nấm men

Mang một số trình tự quan trọng: ARS, CEN, TEL Ngoài ra còn mang một số trình tự quan trọng khác

 Ưu điểm: Có thể cho phép cài đoạn DNA có kích thước

2.000 kb

 Nhược điểm: - Số lượng bản sao tạo thành thấp

- Thường xuất hiện thể khảm

- Đoạn DNA cài thường không ổn định

- Thao tác khó khăn

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men: pYac2

5 Vector là Ti plasmid

 Ti plasmid là plasmid có kích thước 200 kb tong tế bào

vi khuẩn Agrobacterium tumefacien

 Đặc điểm: - Mang đoạn T- DNA gây khối u ở thực vật

- Chứa vùng vir_ giúp hệ thống plasmid xâm

nhập vào tế bào chủ

 Ứng dụng: - Dùng trong chuyển gen thực vật

- Được cải tiến, gắn thêm các gen chỉ thị, các đoạn DNA chức năng tạo thành vector nhị thể,

vector liên hợp

Ti Plasmid

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

6 Vector ở sinh vật nhân chuẩn

 Nguyên nhân lựa chọn: Do plasmid, cosmid…

hoạt động kém trong động vật,

thực vật bậc cao.Do đó ở sinh vật

nhân chuẩn cần sử dụng vector riêng

VD: SV 40, Adenovirus, retrovirus…

 Cải tiến: Sử dụng vector là các

loại virut được cắt bỏ các gen

VI MỘT SỐ ĐẶC ĐiỂM CHO VECTOR BIỂU

HIỆN GEN

 Vector biểu hiện gen là

những vector được thiết kế

dùng để biểu hiện một tính trạng

hay tạo ra một loại protein, RNA

 Đặc điểm: Ngoài mang

những đặc điểm quan trọng trên

của vector tách dòng, vector

biểu hiệngen cần có các

promotor mạnh, trình tự ori,

vị trí khởi đầu phiên mã,

vị trí bám của riboxom, tín hiệu

kết thúc dịch mã

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Vector biểu hiện gen: pcDNA3 1 vector

VII THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG

 Vector là một thành phần quan trọng góp phần

đưa đến thành công trong chuyển gen

 Cây trồng chuyển gen (GMC hay GMO )

 1983: Được ứng dụng đầu tiên ở cây thuốc lá

 1986: Bông kháng sâu và kháng cỏ dại

 1992: Số GMC là 675 cây

 1995: Diện tích GMC trên thế giới là 1,2 triệu ha

 2003: Diện tích lên tới 67,7 triệu ha trong đó:

Mĩ: 42,8 triệu ha chiếm 60,3%diện tích

Argentina: 13,9 triệu ha, 21% diện tích

Canada: 4,4 triệu ha, 6,5 diện tích

Brazil: 3 triệu ha, 4% diện tích

Trung Quốc: 2,8 triệu ha, 3,85% diện tích

• Doanh thu từ cây chuyển gen toàn cầu:

- 1995: 75 triệu USD

- 2001: 3,8 tỉ USD

- 2003: 5,4_ 4,57 tỉ USD

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

 TRIỂN VỌNG:

 Thế giới: 1010 đạt doanh thu 20,0 tỉ USD

 Việt Nam: 2010_ 2011 sẽ có sản phẩm cây trồng biển

đổi gen

Và chúng ta đang và sẽ đóng góp vào

thành công đó…?

KÍNH CHÚC CÔ MẠNH KHỎE VÀ THÀNH

CÔNG HƠN TRONG SỰ NGHIỆP!

CHÚC CÁC BẠN HỌC TỐT!

KỸ THUẬT DI TRUYỀN