Bệnh viêm ruột do Canine parvo virus gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm đối với mọi giống chó đang nuôi tại Việt Nam. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập các chủng Canine parvovirus tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam, xác định genotype và một số đặc tính sinh học trên môi trường tế bào CRFK. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 3 chủng CPV: VNUA.CPV.HN01, VNUA.CPV.HN04 và VNUA.CPV.HY05 trên môi trường tế bào CRFK từ 30 mẫu bệnh phẩm.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 3: 300-310 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 300-310 www.vnua.edu.vn MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG CANINE PARVO VIRUS TYPE GÂY BỆNH VIÊM RUỘT TRÊN CHĨ Ở PHÍA BẮC VIỆT NAM Trương Quang Lâm*, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Luyên Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tqlam@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 10.03.2021 Ngày chấp nhận đăng: 21.01.2022 TÓM TẮT Bệnh viêm ruột Canine parvo virus gây bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm giống chó ni Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu phân lập chủng Canine parvovirus số tỉnh phía Bắc Việt Nam, xác định genotype số đặc tính sinh học môi trường tế bào CRFK Kết nghiên cứu phân lập chủng CPV: VNUA.CPV.HN01, VNUA.CPV.HN04 VNUA.CPV.HY05 môi trường tế bào CRFK từ 30 mẫu bệnh phẩm Kết phân tích phả hệ cho thấy chủng phân lập thuộc nhóm genotype CPV2c Các chủng virus phân lập khơng gây bệnh tích đời mà phải qua từ đến đời cấy chuyển mù có khả gây bệnh tích tế bào CRFK Thời điểm xuất bệnh tích tối thiểu 24 sau gây nhiễm 7,47 phá hủy hồn tồn tế bào sau 60-72 ni Hiệu giá virus thu cao, đạt 10 TCID50/ml chủng VNUA.CPV.HN04 phân lập Hà Nội Đường cong sinh trưởng chủng nghiên cứu đạt cao thời điểm 60-72 giờ, sau giảm dần Từ khóa: Canine parvo virus, phân lập, PCR, giải trình tự, đặc điểm sinh học Biological Characterization of Canine Parvovirus Type Isolates Causing Canine Parvovirus Enteritis in North Viet Nam ABSTRACT Canine parvovirus (CPV) is a highly contagious viral disease that commonly causes acute gastrointestinal illness in dog breeds in Vietnam We isolated and determined genotype and biological characteristics of CPV in the CRFK cell line Three strains of CPV, VNUA.CPV.HN01, VNUA.CPV.HN04 and VNUA.CPV.HY05 in the CRFK cell line were isolated from 30 clinical samples The phylogenetic analysis revealed that all CPV isolates belonged to the genotype CPV2c CPV did not cause disease in the first passage but caused cytopathogenic effect in the CRFK cells after to blind passages Cytopathic effect (CPE) occurred within 24 hours post-infection and the cells were 7,47 completely destroyed after 60 to 72 hours of infection CPE viral titer was high, at 10 TCID50/ml The growth curve reached the peak at 60 to 72 hours after infection and then decreased gradually Keywords: Canine parvo virus, Isolation, PCR, Sequencing, biological characteristics ĐẶT VẤN ĐỀ Canine parvovirus (CPV) mût nhąng loäi virus phự bin nhỗt gõy viờm ruỷt tiờu chõy trờn Virus thủc hõ Parvoviridae, gây bệnh cho nhiều lồi đûng vêt khác nhau, tĂ côn trùng (phân hõ Densovirinae) đến chim lồi đûng vêt có vú (phân hõ parvovirinae) (Taguchi & cs., 2010; Snoussiand, 300 2014) Bệnh parvo virus gõy rỗt d lõy lan tĆ nhiên, chiếm tĉi 26% tỵ lệ tĄ vong sø bệnh virus, mût nhng loọi virus rỗt nguy him vi tợ l mớc bệnh cao (100%) tỵ lệ tĄ vong lên đến 10% Ċ chị trāĊng thành, 91% Ċ chó (Appel & cs., 1979) CPV đāợc cho có ngn gøc t mỷt bin th cỵa FPV (felin panleucopenia virus), ỷt biến trĆc tiếp tĂ FPV đāợc thích nghi Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Th Yn, Nguyn Th Hoa, Lờ Th Luyờn vờt chỵ mĉi chó thơng qua ch÷n cáo Bệnh đāợc đặc trāng bĊi hai thể lâm sàng; (i) thể ruût củn c gừi l viờm ruỷt xuỗt huyt, ồy l dọng phự bin cỵa bnh, triu chng nụn ma tiờu chây phân sém màu có máu; (ii) thể viêm cć tim xây Ċ chị dāĉi tn tuựi (Hayes & cs., 1979) Thi gian ỵ bnh dao đûng tĂ đến 14 ngày, đøi vĉi nhąng cá thể chó bð míc bệnh virus đāợc thâi ngồi mơi trāĈng qua phân bít đỉu tĂ ngày thă 4-5 cỵa thi kỡ ỵ bnh, kộo di suứt thĈi gian biểu triệu lâm sàng 10 ngày sau h÷i phĀc (Decaro & cs., 2005b) CPV c cụng bứ xuỗt hin lổn ổu tiờn chồu Âu vào khồng nëm 1976 nhanh chịng lây lan mût cách khơng kiểm sốt sau đị nëm Qua cỏc kt quõ nghiờn cu cho thỗy CPV-2 cú khõ nëng täo biến thể kháng nguyên giøng nhā virus cým Ċ ngāĈi (Shackelton & cs., 2005), minh l cũ n chỵng bin th CPV-2a, CPV2b, CPV-2c vòng thêp kỷ qua (Raj & cs., 2010) Vào nëm 2000, biến thể CPV-2c vĉi axit glutamic Ċ vð trí 426 lỉn đỉu tiên đāợc xác đðnh Ċ Ý sau đị lỉn lāợt Ċ Tây Ban Nha, Đăc, Nhêt Bân, Mexico Hoa Kỳ công bø sĆ cú mt cỵa CPV-2c trờn mớc bnh Cỏc bin th CPV-2c hin xuỗt hin phự bin Chồu Á nhā Ċ Trung Quøc, Đài Loan, Lào, Thái Lan Việt Nam (Minh Hoang & cs., 2018; Tuong Nguyen Manh & cs., 2020) Mặc dü đāợc coi mæm bnh truyn nhim quan trừng trờn chũ, nhng vỗn nghiên cău phân lêp xác đðnh đặc tính sinh hừc cỵa Canine parvovirus tọi Vit Nam cũn rỗt hän chế Nghiên cău đāợc tiến hành nhìm phân lêp xác đðnh mût sø đặc tính sinh hõc cỵa cỏc chỵng CPV2 thc a lu hnh tọi Vit Nam Ngoi cung cỗp thờm thụng tin khoa hừc liên quan đến genoype gây bệnh nay, khâ nëng sinh trng cỵa virus phc v nghiờn cu v o täo PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Méu bệnh phèm bao g÷m máu (huyết thanh), phân nûi täng đāợc thu thêp tĂ tĂng cá thể chò dāćng tính vĉi CPV đāợc giám đðnh bìng phāćng pháp PCR Húa chỗt, dng c, trang thit b phc v nghiên cău bao g÷m: tế bào Crandell-Rees Feline Kidney (CRFK), mửi trng nuụi cỗy t bo DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium-Corning), FBS (huyết thành bào thai bò), Trypsin, PBS (Phosphate buffer saline), kit tách chiết DNA (Qiagen), GoTaq PCR green (Promega), tỵ cỗy an ton sinh hừc cỗp II, tỵ çm CO2, máy PCR, máy điện di, máy ly tâm, mỏy votex, bỡnh nuụi cỗy t bo, khay 12 ging, pipet lội, đỉu tip lội, øng ly tâm 15ml 50ml„ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xử lý mẫu Các méu dāćng tính vĉi CPV đāợc giám đðnh bìng phāćng pháp PCR đāợc sĄ dĀng để phân lêp Các méu phân đāợc hòa tan dung dðch mùi đệm PBS 0,1M có bù sung kháng sinh streptomycin (100 mg/l) penicilin (1 lac U/I) ly tâm Ċ 12.000 vòng/5 phút Thu dðch nùi, lõc qua màng 0,22µm sau đị thu méu lāu Ċ -81C 2.2.2 Nuôi cấy tế bào CRFK Tế bào CRFK đāợc bâo qn nitć lóng đāợc đāa ngồi giâi đöng Tế bào sau giâi đöng đāợc đāa vào ly tåm chăa thêm 5ml môi trāĈng DMEM Ly tâm 1.500 vủng/5 phýt loọi bú ht chỗt bõo quân thu cặn tế bào Hoàn nguyên cặn tế bào 1ml mưi trāĈng DMEM sau đị chuyển tế bào vo bỡnh nuụi cỗy cha 5ml DMEM bự sung 10% FBS 1% kháng sinh Nuôi tế bào Ċ 37C vi 5% CO2 Theo dừi s phỏt trin cỵa t bo n t bo mừc ỵ dy trờn b mt bỡnh nuụi cỗy 2.2.3 Phõn lp virus T bo CRFK c nuụi bỡnh nuụi cỗy t bo T-25 vĉi diện tích đáy 25cm2 chăa mơi trāĈng DMEM có bù sung 10% FBS (Fetal bovine serum) % PenStrep, nuôi tế bào Ċ điều kiện nhiệt đû 37C vi 5% CO2, t bo phỏt trin phỵ hết đáy bình tiến hành gây nhiễm 301 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam Méu bệnh phèm cho kết quâ dāćng tính vĉi CPV xĄ lý lāu Ċ -80C trāĉc đị đāợc gây nhiễm lên mưi trāĈng tế bo CRFK xuỗt DNA sau tỏch chit c bõo quõn Ċ nhiệt đû -80C Nghiên cău sĄ dĀng cặp m÷i để chèn đốn đðnh tính Canine Parvo virus 555for/555rev (Bâng 1) Tế bào chn bð Ċ lội bó hết môi trāĈng đāợc rĄa läi vĉi dung dðch mùi đệm PBS 0,1M Sau đị gåy nhiễm 500µl méu bnh phốm ó chuốn b Tin hnh ỵ thi gian 90 phút Ċ 37C sau đò bù sung 5ml möi trāĈng phân lêp (DMEM vĉi 5% FBS, 1% PenStrep) nuụi cỗy iu kin 37C vi 5% CO2 ngày Méu DNA sau tách chiết đāợc hỳn hp vi cỏc thnh phổn phõn ng cỵa Kit Invitrogen bao gữm: 6,5àl nuclease-free water; 12,5àl master mix; 1àl reverse primer; 1µl forward primer; 5µl khn méu DNA Đøi dāćng DNA CPV dāćng tính, đāợc khỵng đðnh bìng PCR giâi trình tĆ thủc Đề tài trừng im cỗp Hừc vin, nghim thu 2019 Chu trỡnh nhiệt đāợc thĆc g÷m bāĉc: Tiền biến tính Ċ nhiệt đû 94C phút; Chu kì lặp läi 40 lỉn: Biến tính Ċ nhiệt đû 94C 40 giây, gín m÷i Ċ 57C 40 giây, tùng hợp kéo dài Ċ 72C 50 giây; Hoàn thành Ċ 72C phút Điện di kiểm tra sân phèm PCR: Sân phèm PCR đāợc kiểm tra gel agarose 1,2% Điện di Ċ hiệu điện 100V cāĈng đû 100mA, thĈi gian điện di 30 phút Kết thýc in di, bõn gel c lỗy nhuỷm Red gel không 5-7 phút Sau nhủm bân gel đāợc chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết q điện di Vð trí độn DNA đāợc phỏt hin bỡng nhng vt sỏng tng ng cỵa thuức nhuûm, chĀp ânh đõc kết quâ Kết quâ dāćng tính méu cho kích thāĉc sân phèm DNA theo đýng thiết kế m÷i, méu âm tính khơng có sân phèm DNA Bình tế bào sau gây nhiễm virus đāợc theo dõi bệnh tích tế bào bìng kính hiển vi soi ngāợc múi 12 giĈ mût læn, tiến hành thu bỡnh t bo gõy nhim virus xuỗt hin bệnh tích tế bào không 70-90% diện tích đáy bình, v lu -80C Nu ngy khụng xuỗt hin bệnh tích tế bào thu dðch ni tế bào, lāu Ċ -80C Bình tế bào sau gây nhiễm đāợc đơng tan lỉn Ċ nhiệt đû phịng, ly tâm lội bó tế bào thu dðch nùi Đøi vĉi cỏc mộu cha xuỗt hin bnh tớch t bo s c cỗy chuyn cỏc i tip theo n cú bệnh tích 2.2.4 Phương pháp PCR Các méu bệnh phèm cỵa nghi ng mớc Canine parvo virus c thu thêp, kiểm tra đāợc giám đðnh bìng phāćng pháp PCR Méu bệnh phèm đāợc tách chiết bìng Kit Qiagen, cỏc bc tin hnh theo hng dộn cỵa nh sõn Bảng Trình tự nucleotide cặp mồi sử dụng phát Canine parvo virus Mồi Trình tự (5'-3') Kích thước sản phẩm Tham khảo 555for CAGGAAGATATCCAGAAGGA 583bp Buonavoglia & cs (2001) 555rev GGTGCTAGTTGATATGTAATAAACA Bảng Bảng thống kế mẫu bệnh phẩm thu thập số tỉnh phía Bắc Tỉnh Số mẫu Mẫu thu thập Huyết Phân Nội tạng Hà Nội 11 Hưng Yên 13 10 Vĩnh phúc Bắc Ninh Tổng 33 22 302 Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Luyên 2.2.5 Xác định hiệu giá virus 2.2.8 Xử lý số liệu Tế bào CRFK đāợc chuèn bð khay 48 ging ọt ỷ phỵ 95-98% Mộu virus cổn xác đðnh hiệu giá đāợc pha loãng theo cć sø 10 tĂ 10-1 đến 10-8, tiến hành gây nhiễm 50µl dung dðch virus Ċ n÷ng đû khác vào giếng có chăa tế bào CRFK, Ċ múi n÷ng đû pha loãng gây nhiễm giếng tế bào Theo dõi bệnh tích tế bào bìng kính hiển vi soi ngāợc Hiệu giá virus đāợc xác đðnh theo phāćng phỏp cỵa Spearman & Karber Sứ liu c x lý bìng phỉn mềm GraphPad Prism 2.2.6 Xác định đường cong sinh trưởng virus Tế bào CRFK đāợc chuèn bð vào khay 96 giếng (mưi trāĈng DMEM có bù sung 10% FBS 1% kháng sinh) Virus phân lêp đāợc gây nhiễm lên giếng tế bào vĉi MOI = TCID50/t bo, ỵ 1h 37C, sau ũ hýt bó dðch bù sung mưi trāĈng ni (HIRASAWA & cs 1984) Các giếng tế bào sau gây nhiễm đāợc thu dðch tế bào-virus, tiến hành đöng tan giếng ni virus để thu tồn bû virus tế bào täi thĈi điểm 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h sau gây nhiễm Sau đị, dðch virus sau đưng tan đāợc tiến hành xác đðnh hiệu giá xây dĆng đāĈng cong sinh trāĊng cỵa virus theo bin logarit thờp phõn cỵa TCID50 tọi múi thĈi điểm thu virus 2.2.7 Giải trình tự gene xây dựng sinh học phân tử Sân phèm phân ăng PCR đāợc tinh säch bìng bût kit QIAquick Extraction (Qiagen, Đăc), chäy phân ăng PCR sequence, sau đò giâi trình tĆ trĆc tiếp sân phèm phân ăng PCR sequence máy giâi trình tĆ gene tĆ đûng CEQ-8000 (Beckman coulter, Mỹ) Dą liệu trình tĆ gene thu đāợc tĂ máy giâi trình tĆ gene đāợc xĄ lý bìng phæn mềm MEGA X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 10) Cây sinh hõc phân tĄ đāợc xây dĆng bìng phỉn mềm MEGA, sĄ dĀng phāćng pháp test Maximum likehood vĉi giỏ tr bootstrap l 1.000 n v Cỏc chỵng CPV tham chiếu sĄ dĀng để xây dĆng sinh hõc phân tĄ đāợc thu thêp tĂ dą liệu ngân hàng gene giĉi (NCBI) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thu thập mẫu chó phục vụ phân lập Canine Parvo virus Các méu đāợc thu thêp täi mût sø phòng khám chò, mèo đða bàn mût sø tỵnh phía Bíc: Hà Nûi, Hāng n, Vïnh Phýc Bíc Ninh Việc thu thêp méu dĆa vào triu chng lõm sng in hỡnh cỵa bnh v kt q test bìng kit chèn đốn nhanh phát virus Canine parvo Trong tùng sø 33 méu thu thêp đāợc bao g÷m méu huyết thanh, 22 méu phân méu nûi täng täi tỵnh Hà Nûi (11 méu), Hāng Yên (13 méu), Vïnh Phýc (3 méu) Bíc Ninh (6 méu) Các méu thu thêp đāợc chiết tách DNA giám đðnh bìng phāćng pháp PCR sĄ dĀng cặp m÷i đặc hiệu cho CPV, kết quâ đāợc trình bày Ċ hình Qua kết quâ sàng lõc méu bìng phāćng pháp PCR thu đāợc 30 tùng sø 33 méu dāćng tính vĉi virus Canine parvo cho sân phèm PCR cò đû dài 583bp, tāćng ăng vĉi sĆ khuếch đäi mût phỉn độn gen VP2 đāợc quan sát bìng điện di gel (Hình 1) Các méu âm tính 30, chiếm tỵ lệ 9,09%; q trình thu thêp méu täi q trình bâo qn sĄ dĀng kit chèn đốn nhanh khưng đýng cách dén đến tāợng dāćng tính giâ; triệu låm sàng khưng điển hình gåy khị khën trình thu thêp méu 3.2 Kết phân lập CPV Các méu bệnh phèm bao g÷m phân, huyết nûi täng cho kết quâ PCR dāćng tính đāợc lĆa chõn xĄ lý phân lêp môi trāĈng tế bào CRFK Kết quâ thu đāợc tùng sø 30 méu bệnh phèm, chiếm tỵ lệ 10% Kết quâ đāợc trình bây Ċ bâng Trong thớ nghim ny, cỏc mộu phõn lờp c cỗy chuyển mü đĈi liên tĀc tế bào CRFK, bệnh tích tế bào mà CPV gây cú th khụng xuỗt hin i cỗy chuyn ổu tiờn Sau i cỗy chuyn, cỏc mộu khụng cú bệnh tích tế bào đāợc coi âm tính 303 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam Ghi chú: M: Marker; 1-9: Các mẫu bệnh phẩm thu thập; 10: Đối chứng dương (583bp); 11: Đối chứng âm Hình Kết sàng lọc mẫu bệnh phẩm dương tính với CPV phương pháp PCR Hình Hình ảnh tế bào bị co tròn sau ủ virus Bảng Kết phân lập CPV qua đời cấy chuyển mù liên tiếp tế bào CRFK Bệnh tích tế bào Số mẫu PCR dương tính Số mẫu phân lập Đời Đời Đời Đời Đời Hà Nội 11 2 2 Hưng Yên 12 0 1 Vĩnh Phúc 0 0 0 Bắc Ninh 0 0 0 Tổng 30 3 Địa phương Trong trình phân lêp, quan sỏt thỗy hin tng t bo CRFK b co trũn bong lên khói đáy bình ni sau c ỵ vi virus (Hỡnh 2) Cỏc mộu cú hin tng trờn chim tợ l thỗp, nhiờn cỏc mộu đāợc coi âm tính khơng thể theo dơi đāợc bệnh tích tế bào Hiện tāợng hàm lāợng 304 trypsin có méu phân, rủt đûc tø khưng xác đðnh dðch ruût méu phân gây ânh hāĊng đến tế bào Các méu đāợc thu thêp tĂ nhiều đða bàn, q trình bâo qn vên chuyển q lâu có th lm giõm chỗt lng cỵa cỏc mộu, õnh hng trĆc tiếp đến kết quâ phân lêp Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Luyên Kết quâ bâng cho thỗy, chỵng phõn lờp H Nỷi v chỵng phõn lờp Hng Yờn u khụng gõy bnh tớch i th nhỗt Trong chỵng phõn lờp Ċ Hà Nûi kí hiệu VNUA.CPVHN04; VNUA.CPV.HN01 lỉn lāợt xuỗt hin bnh tớch i cỗy chuyn th 2; th Chỵng cũn lọi phõn lờp Hng Yờn kớ hiu l VNUA.CPV.HY04 xuỗt hin bnh tớch i cỗy chuyn th Cỏc nghiờn cu phõn lờp CPV giĉi chỵ rìng: đøi vĉi chỵng virus khỏc nhau, vic ghi nhờn thi im xuỗt bệnh tích tế bào Ċ đĈi phân lêp khác Parthiban & cs (2011) cÿng tin hnh phõn lờp CPV qua i cỗy chuyn mù thu đāợc tùng sø 18 méu i cỗy chuyn th Theo Kaur & cs (2015) phõn lờp c chỵng t 60 mộu bnh phốm ũ chỵng phõn lờp i cỗy chuyn th nhỗt v chỵng i cỗy chuyn thă Virus cỉn có thĈi gian để thích nghi trờn mửi trng mi; sứ lng virus ớt, cha ỵ để gây nên bệnh tích tế bào bệnh tớch xuỗt hin ớt v dọng rounding: t bo co trịn, tĀ thành đám bong trịc lên khói đáy bình, khiến cho việc quan sát bệnh tích t bo rỗt d nhổm lộn vi cỏc t bo chết khơng bệnh lý, đđi hói nhiều thĈi gian công săc Mût sø công bø giĉi chỵ rìng ngồi CPV cịn có mût sø virus cÿng gåy tiêu chây chó có khâ nëng gåy bệnh tích tế bào CRFK: (i) CAV (OngrádI & cs., 2019); (ii) CCoV (Regan & cs., 2012) Vì vêy để khỵng đðnh kết q nghiên cău phõn lờp cỏc chỵng CPV v tớnh thuổn khit, khụng b tọp nhim vi cỏc loọi virus khỏc Cỏc chỵng đāợc giám đðnh bìng phāćng pháp PCR sĄ dĀng cặp m÷i đặc hiệu cho Canine Parvovirus (CPV); Canine Adenovirus (CAV); Canine Coronavirus (CCoV) Kt quõ PCR cho thỗy cỏc chỵng phân lêp đāợc hồn tồn thn khiết khơng bð täp nhiễm bĊi lội virus khác (Bâng 4, Hình 4) Ghi chú: (A) Bệnh tích tế bào CPV gây ra; (B) Tế bào CRFK bình thường Hình Bệnh tích tế bào CPV gây tế bào CRFK sau 60h gây nhiễm Bảng Kết kiểm tra khiết chủng CPV phân lập STT Tên chủng CPV CAV CCoV VNUA.CPV.HN01 + - - VNUA.CPV.HN04 + - - VNUA.CPV.HY05 + - - 305 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam Ghi chú: M: Marker; 1: VNUA.CPV.HN01; 2: VNUA.CPV.HN04; 3: VNUA.CPV.HY05; 4: Đối chứng dương Hình Kết PCR kiểm tra tạp nhiễm chủng phân lập Các phân tích so sánh trình tĆ độn gen VP2 đāợc thĆc bìng cách giâi trình tĆ sân phèm PCR dāćng tính (Hình 1) Kết q phân tích ngn gøc phát sinh loi theo s sai khỏc nucleotide cỵa oọn gene VP2 (Hỡnh 4) cho thỗy cỏc chỵng phõn lờp VNUA.CPV.HN01, VNUA.CPV.HN04 VNUA.CPV.HY05 cị đû tāćng đ÷ng cao nucleotide nìm nhánh phát sinh CPV2c Kết quâ nghiên cău tāćng đ÷ng vĉi kết quâ nghiên cău nëm 2016-2018 xỏc nh genotype cỵa cỏc chỵng virus CPV2c täi Việt Nam dĆa dą liệu đoän gen VP2 (Minh Hoang & cs., 2019; Tuong Nguyen Manh & cs., 2020) v cho thỗy cỏc chỵng CPV-2c Vit Nam cú chung nguữn gức tin húa vi cỏc chỵng CPV-2c chõu ỏng chỳ ý, kt quõ phõn tớch cho thỗy có sĆ khác biệt ngn gøc phát sinh sĆ tāćng đ÷ng đøi vĉi biến thể CPV-2c phân lờp tọi Vit Nam so vi cỏc chỵng vacxin thuỷc genotype CPV2a, CPV2b sĄ dĀng loäi vacxin thāćng mäi nhêp khèu đāợc sĄ dĀng rûng rãi Nhiều loäi vacxin CPV-2 đāợc sĄ dĀng täi Việt Nam; nhiên, chāa cò nghiên cău tài liệu đánh giá hiệu quâ bâo hỷ cỵa vic tiờm vacxin CPV-2 nhờp ngoọi ứi vi biến thể CPV-2c täi lāu hành täi Vit Nam Do ũ, vic ỏnh giỏ hiu quõ cỵa vacxin täi đøi vĉi CPV-2c cæn phâi đāợc nghiên cău đánh giá 306 3.3 Kết xác định số đặc tính sinh học chủng CPV phân lập 3.3.1 Kết xác định khả gây bệnh tích theo thời gian chủng CPV mơi trng t bo CRFK Cỏc chỵng phõn lờp CPV c gây nhiễm tế bào CRFK để quan sát theo dõi bệnh tích täi thĈi điểm khác sau gõy nhim Kt quõ cho thỗy thi gian tứi thiu cỏc chỵng virus bớt ổu gõy bnh tích tế bào 24 giĈ sau gây nhiễm; phỏ hỵy 100% t bo thi im 60 gi; 72 giĈ sau gây nhiễm tồn bû bệnh tích tế bào tan rã bong lên khói đáy bình ni (Bâng 5, Hình 6) 3.3.2 Kết xác định hiệu giá virus Kết quâ nghiên cău xác đðnh hiệu giá cỵa cỏc chỵng CPV phõn lờp c trỡnh by bõng Trong ũ, chỵng virus VNUA.CPV.HN04 ọt hiu giỏ cao nhỗt, 107,47TCID50/ml; thỗp hn l chỵng VNUA.CPV.HN01, VNUA.CPV.HY05 lỉn lāợt đät 107,13 TCID50/ml, 106,8 TCID50/ml Các cơng bø giĉi chỵ rìng CPV đāợc phân lêp tế bào khác nhā MDCK A-72 Chýng tưi tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu giá virus loäi tế bào này, kết quõ cho thỗy hiu giỏ virus trờn t bo CRFK cao hćn so vĉi hiệu giá virus tế bào MDCK A-72 (Kết q khưng đāợc trình bày) Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Luyên Hình Cây sinh học phân tử chủng CPV2 dựa vào phần đoạn gen VP2 chủng CPV nghiên cứu Bảng Khả gây bệnh tích theo thời gian chủng phân lập CPV nghiên cứu Các chủng 12h 24h 36h 48h 60h 72h VNUA.CPV.HN01 - VNUA.CPV.HN04 - + + ++ +++ B + ++ ++ +++ B VNUA.CPV.HY05 - + + ++ +++ B Ghi chú: “-“ chưa có bệnh tích; “+” 10-30%; “++” 30-70%; “+++” 70-100% bệnh tích tế bào; “B” tế bào bị bong trúc Theo nghiờn cu cỵa Aiko Fukuma & cs (2013) phân lêp CPV tế bào CRFK, virus đät hiệu giá 107 TCID50/ml Hiệu giá virus đāợc phân lêp t bo MDCK l 105.5 TCID50/ml theo cụng bứ cỵa Mochizuki & cs (2006) M.Horiuchi & cs (1994) thĄ phân lêp CPV tế bào A-72 thu đāợc virus có hiệu giá 2,5 × 104 Các kết q nghiên cău tāćng 307 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam ững vi kt quõ nghiờn cu trc ồy cỵa chýng töi, làm cć sĊ lĆa chõn tế bào để phân lêp đāợc virus có hiệu giá cao 3.3.3 Đường cong sinh trưởng chủng virus phân lập ĐāĈng cong sinh trāĊng đāợc xây dĆng dĆa hiệu giá cỵa chỵng virus c thu cỏc thi im khỏc Kt quõ hỡnh cho thỗy chỵng virus VNUA.CPV.HN04 thích nghi nhân lên tế bào CRFK tứt hn chỵng cũn lọi cỏc thi im nuụi cỗy Kt quõ cng cho thỗy s tng ững v c tớnh sinh trng cỵa cỏc chỵng virus, khõ nëng nhån lên giâi phóng virus khói tế bào Ċ thĈi điểm khác khác Virus bít đỉu nhân mänh không thĈi gian 12 giĈ đến 48 giĈ sau gây nhiễm, đät măc đû cao nhỗt thi im 60 gi sau gõy nhim Hiu giá virus trì đến thĈi điểm 72 giĈ sau gây nhiễm, sau đị giâm dỉn TĂ kết q bâng cho thỗy thi im virus ọt hiu giỏ cao nhỗt l virus phỏ hỵy hon ton t bo giâi phịng ngồi, cị ý nghïa việc lĆa chõn thĈi điểm thu virus thích hợp để đät hiu giỏ cao Cỏc chỵng virus ny cú th c sĄ dĀng để nghiên cău chế täo vacxin chøng läi cỏc chỵng CPV ang lu hnh Vit Nam Ghi chú: (A) bệnh tích sau 24h gây nhiễm CPV; (B) bệnh tích sau 36h gây nhiễm CPV; (C) bệnh tích sau 48h gây nhiễm CPV; (D) bệnh tích sau 60h gây nhiễm CPV Hình Bệnh tích chủng VNUA.CPV.HN04 gây tế bào CRFK thời điểm khác Bảng Hiệu giá virus chủng CPV phân lập Chủng virus 308 Số giếng tế bào có bệnh tích nồng độ Hiệu giá 10 10 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 (log10 TCID50/ml) VNUA.CPV.HN01 3 3 0 7,13 VNUA.CPV.HN04 3 3 0 7,47 VNUA.CPV.HY05 3 3 0 6,8 -1 -2 Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Luyên Hình Đường cong sinh trưởng chủng phân lập CPV tế bào CRFK KẾT LUẬN Tùng sứ chỵng CPV ó c phõn lờp t 30 méu bệnh phèm có kết q PCR dāćng tính vĉi CPV đāợc thu thêp täi Hà Nûi, Hāng Yên, Bíc Ninh v Vùnh Phýc Cỏc chỵng phõn lờp VNUA.CPV.HN01, VNUA.CPV.HN04 VNUA.CPV.HY05 nìm nhánh phát sinh genotype CPV2c Cỏc chỵng CPV phõn lờp khụng xuỗt hin bnh tớch t bo i ổu tiờn cỗy chuyn m phõi qua i cỗy chuyn mự Bnh tớch t bo quan sát đāợc Ċ däng co trịn, bệnh tích tế bo xuỗt hin sau 24 gi gõy nhim v nhanh chóng đät 100% 60 giĈ sau gây nhiễm Hiệu giá virus thu đāợc dao đûng 107TCID50, đò cao nhỗt l chỵng VNUA.CPV.HN04 vi hiu giỏ ọt 107,47 TCID50/ml, thỗp nhỗt l VNUA.CPV.HY05 ọt 106,8 TCID50/ml Virus nhõn lên mänh täi thĈi điểm 36 đến 48 giĈ ọt cao nhỗt 60 gi sau gõy nhim v sau đị giâm dỉn Kết q tiền đề cho việc triển khai nghiên cău nhỡm la chừn c chỵng giứng tim nởng phc v nghiờn cu sõn xuỗt ch phốm v vacxin phủng v điều trð bệnh chó LỜI CẢM ƠN Bài báo ny c thc hin t nguữn kinh phớ cỵa tài: “Nghiên cău chế täo kháng huyết tøi miễn dðch để điều trð bệnh viêm ruût tiêu chây Canine parvo virus gây chó” dĆ án WordBank tài trợ (ĐTKHCN.WB.09/20) TÀI LIỆU THAM KHẢO Appel M.J., Carmichael L.E & Scott F.W (1980) U.S Patent No 4193990 Washington, DC: U.S Patent and Trademark Office Buonavoglia C., Martella V., Pratelli A., Tempesta M., Cavalli A., Buonavoglia D & Carmichael L (2001) Evidence for evolution of canine parvovirus type in Italy Journal of General Virology 82(12): 3021-3025 Decaro N., Elia G., Campolo M., Desario C., Lucente M.S., Bellacicco A.L &Buonavoglia C (2005) New approaches for the molecular characterization of canine parvovirus type strains Journal of Veterinary Medicine, Series B 52(7‐8): 316-319 Fukuma A., Yoshikawa R., Miyazawa T & Yasuda J (2013) A new approach to establish a cell line with reduced risk of endogenous retroviruses PloS one 8(4): e61530 Hayes M.A., Russel R.G., Mueller R.W & Lewis R.J (1979) Myocarditis in young dogs associated with a parvovirus-like agent The Canadian Veterinary Journal 20(5): 126 Hirasawa T., Tsujimura N & Konishi S (1985) Multiplication of canine parvovirus in CRFK cells The Japanese Journal of Veterinary Science 47(1): 89-99 Horiuchi M., Goto H., Ishiguro N & Shinagawa M (1994) Mapping of determinants of the host range for canine cells in the genome of canine parvovirus using canine parvovirus/mink enteritis virus chimeric viruses Journal of general virology 75(6): 1319-1328 Kaur G., Chandra M., Dwivedi P.N & Sharma N.S (2015) Isolation of Canine parvovirus with a view 309 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam to identify the prevalent serotype on the basis of partial sequence analysis Veterinary world 8(1): 52 Minh Hoang, Wei-Hao Lin, Van Phan Le, Bui Thi To Nga, Ming-Tang Chiou & Chao-Nan Lin (2019) Molecular epidemiology of canine parvovirus type in Vietnam from November 2016 to February 2018 Journal of Virology 16 Mochizuki M (2006) Growth characteristics of canine pathogenic viruses in MDCK cells cultured in RPMI 1640 medium without animal protein Vaccine 24(11): 1744-1748 Patterson M.G., West M.A., Shackleton V.J., Dawson J.F., Lawthom R., Maitlis S & Wallace A.M (2005) Validating the organizational climate measure: links to managerial practices, productivity and innovation Journal of organizational behavior 26(4): 379-408 Parthiban S., Mukhopadhyay H.K., Panneer D., Antony P.X & Pillai R.M (2011) Isolation and typing of canine parvovirus in CRFK cell line in Puducherry, South India Indian journal of microbiology 51(4): 456-460 Raj J.M., Mukhopadhyay H.K., Thanislass J., Antony P.X & Pillai R.M (2010) Isolation, molecular characterization and phylogenetic analysis of 310 canine parvovirus Infection, Genetics and Evolution 10(8): 1237-1241 Snoussi K & Kann M (2014) Interaction of parvoviruses with the nuclear envelope Advances in biological regulation 54: 39-49 Shackelton L.A., Parrish C.R., Truyen U & Holmes E C (2005) High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus Proceedings of the National Academy of Sciences 102(2): 379-384 Taguchi M., Namikawa K., Maruo T., Lynch J & Sahara H (2010) Antibodies to parvovirus, distemper virus and adenovirus conferred to household dogs using commercial combination vaccines containing Leptospira bacterin Veterinary Record 167(24): 931-934 Tuong Nguyen Manh, Chutchai Piewbang, Anudep Rungsipipat & Somporn Techangamsuwan (2020) Molecular and phylogenetic analysis of Vietnamese canine parvovirus 2C originated from dogs reveals a new Asia-IV clade Transboundary and Emerging Diseases DOI: 10.1111/tbed.13811 Verma S., Singh M., Chander V., Glora P., Chakrovarty S., Thomas J & Kumawat S (2016) Isolation of canine parvovirus-2 in A-72 cell line J Immunol Immunopathol 18(2):122-126 ... Sharma N.S (20 15) Isolation of Canine parvovirus with a view 309 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam to identify the prevalent serotype on... CO2, t bo phỏt trin phỵ hết đáy bình tiến hành gây nhiễm 301 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam Méu bệnh phèm cho kết quâ dāćng tính. .. 307 Một số đặc tính sinh học chủng Canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam ững vi kt quõ nghiờn cu trc ồy cỵa chýng töi, làm cć sĊ lĆa chõn tế bào để phân lêp đāợc virus