Nghiên cứu sự đa dạng và độc tính của vi khuẩn bacillus thuringiensis var kurstaki trên sâu ăn lá hại rau ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var kurstaki TRÊN SÂU ĂN LÁ HẠI RAU Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9.62.01.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ BẢO VỆ THỰC VẬT Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Đình Đơn TP HCM – Năm 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công bố luận án trung thực phần đề tài thuộc Chương trình Khoa học cơng nghệ cấp thành phố PGS TS Lê Đình Đôn làm chủ nhiệm Những số liệu luận án phép công bố với đồng ý chủ nhiệm đề tài NGHIÊN CỨU SINH DƯƠNG KIM HÀ ii LỜI CẢM ƠN Tôi trân trọng biết ơn: PGS.TS Lê Đình Đơn tận tình hướng dẫn tơi suốt trình thực luận án tốt nghiệp TS Võ Thị Thu Oanh, TS Lê Thị Diệu Trang, TS Lê Khắc Hoàng, TS Đinh Minh Hiệp, TS Nguyễn Vũ Phong, PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc, TS Từ Thị Mỹ Thuận hướng dẫn thực chuyên đề luận án Ngồi ra, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Q Thầy, Cơ Phịng Đào tạo Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông học, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ thực thí nghiệm; Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp phần nguồn kinh phí để tơi thực nghiên cứu này; bên cạnh đó, TS Boonhiang Promdonkoy (BIOTEC Thái Lan) cung cấp số mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki primer vip3a cho việc nghiên cứu hoàn thiện Thêm vào đó, tơi xin cám ơn, Ban Lãnh Đạo anh, chị đồng nghiệp công tác Chi cục Trồng trọt Bảo vệ thực vật; Trung tâm Giống trồng, vật nuôi thủy sản Thành phố Hồ Chí Minh; Các anh chị Nghiên cứu sinh khóa 2013, khóa 2014 hỗ trợ, giúp đỡ suốt trình học tập thực luận án Cảm ơn em: Trương Phước Thiên Hoàng, Đào Uyên Trân Đa, Nguyễn Khoa Thảo, Trần Thị Kim Oanh, Trần Thị Hồng Nhung, Đỗ Minh Thân, Danh Thiệt Dal, Kiến Minh Mẫn, Lê Hoàng Phúc, Phạm Xuân Hài, Nguyễn Mai Nghiệp, … nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ thực số nội dung nghiên cứu Cuối xin gửi lời biết ơn chân thành đến gia đình giúp đỡ động viên suốt trình học tập thực luận án NGHIÊN CỨU SINH vii MỤC LỤC Chương Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Summary v Mục lục vii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt xiv Danh mục bảng xvi Danh mục hình đồ thị xxi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu nghiên cứu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn 4.3 Những đóng góp nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự phân bố đa dạng quần thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1 Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.3 Các nghiên cứu nước phân bố, đa dạng di truyền viii vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2 Độc tố gây hại côn trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 12 1.2.1 Phân loại độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 12 1.2.2 Gen cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis 13 1.2.3 Gen cyt vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17 1.2.4 Protein vip vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17 1.2.5 Cơ chế tác động Bacillus thuringiensis côn trùng .19 1.2.6 Các nghiên cứu Bacillus thuringiensis nước 20 1.2.6.1 Nghiên cứu gen cry 20 1.2.6.2 Nghiên cứu khả chống chịu tia UV 21 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus thuringiensis 22 1.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis sản xuất nông nghiệp 24 1.3.1 Thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc Bacillus thuringiensis 25 1.3.2 Cây trồng chuyển gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis 28 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Nội dung nghiên cứu …………………………………………… 30 2.1.1 Sự phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis đa dạng quần thể Bacillus thuringiensis var kurstaki từ tỉnh, thành Việt Nam 30 2.1.2 Đánh giá độc tính chủng Bacillus thuringiensis var kurstaki sâu ăn 30 2.1.2.1 Đánh giá khả gây chết chủng Bacillus thuringiensis var kurstaki sâu ăn cánh vảy 30 2.1.2.2 Chọn lọc chủng B thuringiensis var kurstaki kháng tia UV tối ưu điều kiện sản xuất chế phẩm VBt 30 2.1.2.3 Đánh giá hiệu trừ sâu ăn chế phẩm VBt điều kiện nhà lưới đồng ruộng 30 ix 2.2 Thời gian địa điểm 31 2.2.1 Thời gian 31 2.2.2 Địa điểm 31 2.3 Vật liệu nghiên cứu 31 2.3.1 Hóa chất thí nghiệm 31 2.3.2 Nguồn sâu 32 2.4 Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis chọn lọc vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki đất từ tỉnh, thành 32 2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 32 2.4.1.2 Phương pháp đặt tên mẫu đất chủng vi khuẩn (mã mẫu) 33 2.4.1.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường phân lập mẫu đất 33 2.4.1.4 Phân lập mẫu vi khuẩn 33 2.4.1.5 Định danh vi khuẩn Bacillus thuringiensis thử nghiệm hóa sinh 34 2.4.1.6 Phương pháp tăng sinh khối vi khuẩn Bacillus thuringiensis 35 2.4.1.7 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn Bacillus thuringiensis 35 2.4.2 Khuếch đại trình tự 16S-rDNA gen cry chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki 36 2.4.2.1 Ly trích DNA 36 2.4.2.2 PCR 36 2.4.2.3 Điện di gel agarose đọc kết sản phẩm PCR 37 2.4.3 Xác định diện protein vip3a vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki 37 2.4.3.1 PCR phát gen vip3a 37 2.4.3.2 Phương pháp phân lập protein Vip3a 38 2.4.4 Đánh giá độc tính mẫu phân lập Bacillus thuringiensis var kurstaki sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu x xanh da láng (Spodoptera exigua) điều kiện phịng thí nghiệm 39 2.4.5 Xác định giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki 40 2.4.5.1 Xác định giá trị LC50 40 2.4.5.2 Xác định giá trị LT50 40 2.4.6 Chọn lọc chủng Bacillus thuringiensis var kusrtaki chống chịu tia UV (Ultraviolet) 41 2.4.6.1 Khảo sát khả chống chịu tia UV chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kusrtaki hai bước sóng 254 nm 365 nm 41 2.4.6.2 Đánh giá hiệu gây chết sâu chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki có khả chống chịu tia UV điều kiện phịng thí nghiệm 41 2.4.7 Tối ưu điều kiện lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kusrtaki 42 2.4.7.1 Xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp nhân sinh khối vi khuẩn 42 2.4.7.2 Khảo sát điều kiện nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki 43 2.4.7.3 Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến khả tăng sinh khối vi khuẩn phương pháp quy hoạch thực nghiệm 43 2.4.7.4 Đánh giá hiệu gây chết sâu kết hợp chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki 44 2.4.7.5 Khảo sát mức nhiệt độ bảo quản chế phẩm VBt 45 2.4.8 Khảo sát khả tăng sinh vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki hệ thống lên men tự động lít BioFlo 120 45 2.4.9 Đánh giá độc tính chế phẩm VBt trên sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) điều kiện nhà lưới 46 xi 2.4.10 Đánh giá độc tính chế phẩm VBt 2.5 Xử lý phân tích số liệu Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis v thuringiensis var kurstaki đất t 3.1.1 Phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3.1.2 Xác định chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis thử nghiệm sinh hóa 3.2 Xác định diện gen cry vi khuẩ kurstaki 3.3 Xác định diện gen vip3a vi kh kurstaki 3.4 Khả gây chết sâu tơ (Plutella xyloste litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exig Bacillus thuringiensis var kurstaki phân l 3.5 Giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn kurstaki sâu tơ, sâu khoang, sâu phòng thí nghiệm 3.5.1 Giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn kurstaki sâu tơ 3.5.2 Giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn kurstaki sâu khoang 3.5.3 Giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn kurstaki sâu xanh da láng 3.6 Chọn chủng Bacillus thuringiensis var k 3.6.1 Khả chống chịu tia UV chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki bước sóng xii 3.6.2 Hiệu gây chết sâu chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki có khả chống chịu tia UV điều kiện phịng thí nghiệm 82 3.7 Tối ưu điều kiện lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki 3.7.1 85 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh khối vi khuẩn .85 3.7.1.1 Ảnh hưởng thời gian lên men đến sinh khối vi khuẩn 86 3.7.1.2 Ảnh hưởng pH đến sinh khối vi khuẩn 86 3.7.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh khối vi khuẩn 87 3.7.2 Tối ưu hóa yếu tố ảmh hưởng đến sinh khối vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki phương pháp quy hoạch thực nghiệm 88 3.7.3 Hiệu gây chết sâu kết hợp hai chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki92 3.7.4 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ bảo quản đến chế phẩm VBt .94 3.8 Tăng sinh vi khuẩn hệ thống lên men tự động lít BioFlo 120 95 3.9 Hiệu chế phẩm VBt trên sâu tơ, sâu khoang sâu xanh da láng điều kiện nhà lưới 97 3.10 Hiệu chế phẩm VBt sâu tơ đồng ruộng 100 Thảo luận chung 103 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107 Kết luận 107 Đề nghị 108 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 109 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 131 PHỤ LỤC Sơ đồ định danh vi khuẩn Bergey Sơ đồ phân loại vi khuẩn Bacillus spp xiii Ly trích DNA ® Thuốc trừ sâu Vi-Bt 32000WP Hình ảnh hoạt động thực Luận án PHỤ LỤC Giải trình tự gen cry 14 PHỤ LỤC Số liệu thí nghiệm 21 PHỤ LỤC Phân tích thống kê 40 PHỤ LỤC Số liệu địa điểm lấy mẫu 69 ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ 10Bến Tre Tân Hào, Giồng Trôm 11Bến Tre Tân Thạnh, Giồng Trơm 12Bến Tre Lương Hịa, Giồng Trơm 13 Bến Tre Thạnh Trị, Bình Đại Bình Phươc Xuân 14 An Giang 15Đồng Tháp 16Kiên Giang 17Kiên Giang Cao Lãnh Phú Quốc Phú Quốc PHỤ LỤC SỐ LIỆU VÙNG LÂY MẪU ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ Đồng sông Hồng (8 tỉnh - 31/152) Xã Dục Tú, Đông Anh Hà Nội Thôn Lương Nổ (Xã Tun Dương) 2Hà Nội Đơng Anh Phú Cường, Sóc Sơn Hà Nội Hà Nội Thôn Thượng Đại Thịnh, Mê Linh Khu Liên Linh, Thanh Trì Hà Nội Hạ Hồi, Thường Tín Hà Nội Vĩnh Phúc Đạo Đức, Bình Xun Cầu Lị Cang 8Vĩnh Phúc Thanh Trà, Vĩnh Yên Vĩnh Phúc ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP 10 Vĩnh Phúc HUYỆN, XÃ Phước Lưu, Vĩnh Yên Đạo Đức, Bình Xuyên 11Vĩnh Phúc Thị Xã Phúc Yên 12Vĩnh Phúc 13 Thái Bình Khu cầu Bo, TP Thái Bình Ngã Ba Đơng Mỹ 14Thái Bình 15Thái Bình Xã Phú Lương, Đông Hưng Xã Đông Hải, Quỳnh Phụ 16Thái Bình Tả Sơng Hồng, Vũ Thư 17Thái Bình 18 Hà Nam Xã Thanh Tuyền, Thanh Liêm Liêm Chung, Phú Lý 19Hà Nam ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ Đê Sông Hồng, Mỹ Tân, Mỹ Lộc 20Nam Định Hiền Khánh, Vũ Bản 21Nam Định Nam Dương, Nhật Tân, Tiên Lữ 22Hưng Yên Toàn Thắng, Kim Động 23 Hưng Yên Lục Điền, Minh Châu, Yên Mỹ 24Hưng Yên Tân Chí, Tiên Du 25Bắc Ninh Tương Giang, Từ Sơn 26Bắc Ninh 27 Hải Dương Ninh Thành, Ninh Giang Cao Thắng, Thanh Miện 28Hải Dương 29Hải Phòng Địa phận An Hòa, Vĩnh Bảo ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ Xã Nguyên Giáp, Tú Kỳ 30 Hải Phòng Bảo An, An Lão 31Hải Phòng Biển Thanh Khê 1Đà Nẵng Hòa Khánh, Đà Nẵng Đà Nẵng Ngũ Hành Sơn 3Đà Nẵng Quảng Nam Bình Q, Thăng Bình Quế Phú, Quế Sơn 5Quảng Nam Quảng Nam Bình Minh, Thăng Bình S Trường Giang Bình Giang, Thăng Quảng Nam Bình 8Bình Thuận Núi Tà Cú Bình Thuận Mũi Né, Phan Thiết ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ 10Bình Thuận Long Hải, huyện Phú Q 11 Bình Thuận Mỹ Khê, phuyện Phú Q 12Bình Thuận Tam Thanh, huyện Phú Q Đơng Nam (4 tỉnh - 33/196) Lý Nhơn, Cần Giờ TPHCM An Thới Đông, Cần Giờ 2TPHCM 3TPHCM An Thới Đông, Cần Giờ 4TPHCM An Thới Đông, Cần Giờ 5TPHCM NĐ, Củ Chi 6TPHCM NĐ, Củ Chi 7TPHCM TLT, Củ Chi Thạnh Xuân, Q12 8TPHCM 9TPHCM 10TPHCM Nhị Bình, Hóc Mơn Đơng Thạnh, Hóc Mơn ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ 11TPHCM Thới Tam Thơn, Hóc Mơn 12Tây Ninh Suối Đá, Dương Minh Châu 13Tây Ninh Suối Đá, Dương Minh Châu 14Tây Ninh Sông Vàm Cỏ Đông 15Tây Ninh Phước Lưu, Trảng Bàng 16Tây Ninh Thành Điền, Châu Thành 17Đồng Nai Thống Nhất 18Đồng Nai Định Quán 19Đồng Nai Trảng Bom 20Đồng Nai Tân Phú 21 Lâm Đồng 22Lâm Đồng 23Lâm Đồng 24Lâm Đồng 25Lâm Đồng ng 9, Phườ Phường Xuân Thọ Phường 4, Đà Lạt Phường 7, Đà Lạt Hồ lắng, Hồ Xuân Hương t Đà Lạ 26Lâm Đồng 27Lâm Đồng Xã Đạ Sar, Lạc Dương Xã Đạ Sar, Lạc Dương ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP 28Lâm Đồng 29Lâm Đồng 30Lâm Đồng 31Lâm Đồng 32Lâm Đồng 33Lâm Đồng HUYỆN, XÃ Thị Trấn, Lạc Dương Xã Đạ Chais, Lạc Dương Xã Ka Đô, Đơn Dương Xã Lạc Xuân, Đơn Dương Thị trấn Phi Nôm Xã Hiệp Thạnh, Đức Trọng Đồng sông Cửu Long (5 tỉnh - 17/106) 1Tiền Giang Hậu Thuận, Hậu Thành - C.Bè 2Tiền Giang Hậu Thuận, Hậu Thành - C.Bè Tiền Giang Tân Thành - Gị Cơng Đơng Tiền Giang Tăng Hồ - Gị Cơng Đơng Tiền Giang An Thái - An Cư - Cái Bè Tiền Giang Phú Thạnh, Phú Riềng - Châu Thành 7Bến Tre Bình Thành, Giồng Trôm 8Bến Tre Tân Thạnh, Giồng Trôm Bến Tre Phú Hưng, Giồng Trôm ĐỊA ĐIỂM STT TỈNH, TP HUYỆN, XÃ 10Bến Tre Tân Hào, Giồng Trôm 11Bến Tre Tân Thạnh, Giồng Trơm 12Bến Tre Lương Hịa, Giồng Trơm 13 Bến Tre Thạnh Trị, Bình Đại 14 An Giang 15Đồng Tháp 16Kiên Giang 17Kiên Giang Bình Phươc Xuân Cao Lãnh Phú Quốc Phú Quốc ... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Sự phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis đa dạng quần thể vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki từ tỉnh, thành Vi? ??t Nam - Sự phân bố vi khuẩn B thuringiensis. .. phần vào vi? ??c sử dụng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki phịng trừ sâu hại từ sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học rau, luận án ? ?Nghiên cứu đa dạng độc tính vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. .. phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis đa dạng quần thể Bacillus thuringiensis var kurstaki từ tỉnh, thành Vi? ??t Nam 30 2.1.2 Đánh giá độc tính chủng Bacillus thuringiensis var kurstaki sâu ăn