Nghiên cứu sự đa dạng và độc tính của vi khuẩn bacillus thuringiensis var kurstaki trên sâu ăn lá hại rau ở việt nam TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM DƯƠNG KIM HÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var kurstaki TRÊN SÂU ĂN LÁ HẠI RAU Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9.62.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP HCM – Năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đình Đơn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Vào hồi ……giờ … ngày …… tháng … năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh - Thư viện Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong tự nhiên có 90 loại vi khuẩn có khả diệt sâu phân lập từ thể sâu, đất, có vài loại nghiên cứu Nhiều nghiên cứu nước giới Việt Nam tập trung vào vi khuẩn tự nhiên để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, vi khuẩn Bacillus thuringiensis nghiên cứu sử dụng chủ yếu vào sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Vi khuẩn Bacillus thuringiensis vi khuẩn gây độc đường tiêu hóa sâu, khơng giết sâu hại nhanh, phổ ký chủ hẹp, thời gian hiệu lực ngắn, dễ bị phân hủy không gây ô nhiễm môi trường, sức khỏe người địi hỏi cơng nghệ sản xuất cao nghiên cứu cần thời gian dài B thuringiensis có nhiều mơi trường đất, số lượng đất không đủ để diệt côn trùng B thuringiensis tồn dạng bào tử, khơng thể nhân lên Trong đó, B thuringiensis var kurstaki chủng vi khuẩn sử dụng làm hoạt chất thuốc BVTV nhiều danh mục sản phẩm thuốc BVTV năm 2021 (Bộ Nông nghiệp PTNT, 2021) Các nghiên cứu Việt Nam cung cấp nhiều kết minh chứng nguồn gen B thuringiensis nước đa dạng, nhiều lồi, chưa có chủng B thuringiensis (Phạm Thị Thùy, 2013) Bên cạnh đó, nghiên cứu nước B thuringiensis chưa nhiều chưa có cơng nghệ sản xuất B thuringiensis thương mại cho công ty sản xuất Thiếu nghiên cứu gen, phân bố loài, loài B thuringiensis Do đó, việc tập trung nghiên cứu nguồn gen độc tính (cry, cyt, vip) tồn trữ nguồn giống lâu dài cho việc sản xuất chế phẩm B thuringiensis var kurstaki cần thiết; xây dựng mẫu vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki có độc tính cao việc sản xuất chế phẩm phịng trừ sâu ăn cánh vảy, hai cánh cánh cứng; sử dụng mẫu vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki cho nghiên cứu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Việt Nam nhằm xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất có hệ thống quy mơ lớn Bên cạnh đó, việc đẩy mạnh cơng tác khuyến nơng, tập huấn sử dụng thuốc B thuringiensis cách thường xuyên hệ thống góp phần giảm thiểu sâu hại, bảo vệ môi trường, giảm sử dụng thuốc trừ sâu hóa học nhằm sản xuất rau an tồn, có chất lượng cao Để góp phần vào việc sử dụng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki phòng trừ sâu hại từ sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học rau, luận án “Nghiên cứu đa dạng độc tính vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki sâu ăn hại rau Việt Nam” thực từ năm 2015 đến 2021 Mục tiêu nghiên cứu Xác định phân bố vi khuẩn B thuringiensis đa dạng di truyền vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki số tỉnh, thành Việt Nam Lập mẫu vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki có độc tính cao nguồn vật liệu sản xuất chế phẩm sinh học an toàn cho sức khỏe cộng đồng, thân thiện với môi trường, phù hợp với nông nghiệp hữu Xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu hóa điều kiện lên men tự động vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki làm sở cho việc xây dựng qui trình lên men qui mơ lớn tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho sản xuất Đóng góp nghiên cứu Cung cấp thơng tin phân bố tính đa dạng di truyền vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki vùng sinh thái Việt Nam Đã xác định gen độc tính cry, vip3a diện chủng vi khuẩn gây chết sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ (Plutella xyslotella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) từ chủng phân lập Xác định khả chịu đựng UV, mật số, thời gian gây chết sâu trung bình (LC50, LT50) chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Đã xây dựng quy trình kỹ thuật lên men tự động cho việc gia tăng mật số vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Ý nghĩa khoa học Kết phân bố loài vi khuẩn B thuringiensis vùng sinh thái Việt Nam nguồn sở liệu cho nhà khoa học để nghiên cứu nguồn gốc phát sinh, đa dạng phong phú loài vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam Bộ mẫu vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki có diện gen cry, vip kết luận án cung cấp thông tin cần thiết để thiết lập sở liệu sinh học, giúp cho lĩnh vực nghiên cứu chuyên sâu tính độc chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki phân bố vùng sinh thái Việt Nam, đóng góp phần sở khoa học để bổ sung thêm vào danh sách chủng vi khuẩn có độc tính trừ sâu cao có Việt Nam Bố cục luận án Luận án thức gồm có chương, 108 trang Các phần: Mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết thảo luận (57 trang), kết luận đề nghị (2 trang); 37 bảng số liệu 17 hình Luận án tham khảo tổng cộng 187 tài liệu 15 tài liệu tiếng Việt 172 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN 1.1 Sự phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis đất Đã có 27.000 mẫu vi khuẩn B thuringiensis phân lập toàn giới phát diện vi khuẩn B thuringiensis nhiều môi trường khác đất, số hạt trần, thuốc khô bụi sản phẩm tồn trữ, hạt giống, đất nông nghiệp, môi trường thủy sản chí vùng có điều kiện khắc nghiệt sa mạc, trầm tích biển nhiều quốc gia giới Trong đất, B thuringiensis tồn dạng bào tử, không nảy mầm nhân lên qua nhiều năm Mật số B thuringiensis loại đất thấp, khoảng 0,005 – 0,5% loài Bacillus spp (DeLucca ctv, 1981; Travers ctv, 1987; Martin Travers, 1989; Kealin ctv, 1994; Smith Couche, 1997; Ben Dov ctv, 1997; Iriarte ctv, 1998; Rampersad Ammons, 2005; Baig Mehnaz, 2010, Hassan ctv, 2010; Oves ctv, 2013; Mohammad ctv, 2013; Joelma ctv, 2014; Diego Graciela, 2017; Nair ctv, 2018) Kết nghiên cứu đa dạng sinh học chủng B thuringiensis Việt Nam phát chủng vi khuẩn đất rừng ngập mặn có khả diệt ấu trùng loại muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti Culex quinquefasciatus Ở số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ phân loại 22 loài tổng số 82 loài phát giới (Nguyễn Thanh Cảnh, 2004; Mai Thị Hằng Mai Thị Mỹ Hạnh, 2004; Lê Thị Minh Thành ctv, 2005; Nguyễn Thiện Phú Trần Thanh Thủy, 2013) 1.2 Gen gây độc côn trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Gen cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis Vi khuẩn Bacillus thuringiensis gây bệnh cho côn trùng qua đường tiêu hóa Bào tử nảy mầm dẫn đến sinh sản vi khuẩn thể vật chủ làm trùng chết, song yếu tố làm cho trùng chết nhanh độc tố vi khuẩn sinh Các gen cry thường nằm plasmid có hệ số chép thấp (Carlton Gonzalez, 1985) Các tinh thể diệt trùng mã hóa nhiều gen cry khác Hiện nay, 200 gen cry mô tả phân loại thành nhóm dựa vào hoạt tính diệt trùng trình tự amino acid Tuy nhiên, hầu hết mối quan tâm tập trung vào nhóm gen cry1, cry3, cry4 (Li ctv, 1991; Hernandez Ferre, 2005) 1.2.2 Gen mã hóa protein vip vi khuẩn Bacillus thuringiensis Protein vip mã hóa cho nhóm độc tố vip có khả diệt côn trùng phổ rộng, độc tố cao chưa phát loại trùng có khả kháng độc tố Hai loại độc tố vip phát lần vip3a vip3b Estruch ctv (1996) Đến nay, người ta phát 85 gen vip thuộc bốn nhóm khác nhau, đáng ý gen vip3a mã hóa protein 88 kDa có hoạt tính diệt trùng cánh vảy, độc tố nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột trùng Những đặc tính vip3a mở khả ứng dụng cao việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh có nguồn gốc từ B thuringiensis dựa số lượng lớn loài gây hại trồng (Palma, 2014) 1.3 Một số kết nghiên cứu B thuringiensis Nghiên cứu đa dạng di truyền: chủng Bacillus thuringiensis đa dạng cấu trúc tinh thể độc tố (hình thoi chiếm 63,1%, hình cầu 11,2%, hình khối lập phương 4,8% ), đa dạng tuýp huyết thanh, đặc biệt đa dạng gen mã hóa protein: diệt côn trùng cánh vảy, cánh cứng, hai cánh, diệt tuyến trùng hại nông lâm công nghiệp Gen cry1 (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1E, cry1F, cry1Aa, cry1Ac, cry1Ca), cry2 (cry2Aa, cry2Ab), cry3Aa7 cry4 (cry4Aa, cry4Bb), cry8 (cry8ca2), cry10Aa, cry11Aa cry11Ba Gen vip nghiên cứu ngày nhiều việc tạo chế phẩm sinh học, vip3 (67,4%), vip2 (14,6%), vip1 (8,1%) mô tả đặc điểm, đa dạng vi khuẩn B thuringiensis tìm gen cry gây độc cho trùng (Glen Ana, 2005; Phạm Thì Thùy ctv, 2005; Ramalakshmi Udayasuriyan, 2009; Pardo, 2009; Sun Park, 2010; Yu ctv; 2010; Liu ctv, 2010; Swamy ctv, 2011; Joelma ctv, 2014; Diego Graciela, 2017) Nghiên cứu tác động ký sinh côn trùng vi khuẩn B thuringiensis diệt côn trùng cánh vảy, cánh cứng, hai cánh, diệt tuyến trùng hại nông lâm công nghiệp (Chilcott ctv, 1998; Naimov ctv, 2001; Tigue ctv, 2001; Wellman-Desbiens Cote, 2005; Dubovskii ctv, 2005; Jiménez-Juárez ctv, 2007; Ruiu ctv, 2007; Rouis ctv, 2007; Kati ctv 2007; Chandi ctv, 2007; Cohen ctv, 2008; Porcar ctv 2009; Wojciechowska, 2009; Erban ctv, 2009; Joelma ctv 2014; Soares-da-Silva ctv, 2014; Doolotkeldieva ctv, 2018) Theo Xue ctv (1996) chứng minh bào tử B subtilis dễ bị ảnh hưởng xạ mặt trời với tia cực tím bước sóng 254 nm (UV-C) Vi khuẩn B thuringiensis hoạt động chậm, nhạy cảm xạ UV chết tiếp xúc với tia tử ngoại ion hóa, với protein liên kết chéo gốc hydroxyl xạ ion hóa, đặc biệt tia cực tím UV-B (280 – 315 nm) Do đó, bảo vệ bào tử vi khuẩn B thuringiensis khỏi tác động xạ mặt trời giữ độc tính vi khuẩn bền vững (Jones ctv, 1991; Pusztai ctv, 1991; Xue ctv, 1996) Chế phẩm sinh học B thuringiensis xuất vào năm 1970 loại thuốc cho hiệu lực khả quan phịng trị sâu, ảnh hưởng mơi trường, bảo vệ thiên địch lồi động vật có ích, ngồi cịn mang lại hiệu kinh tế cao cho người dân (Tasbashnik, 1990) Đến khoảng 130 giống côn trùng thuộc cánh vảy, hai cánh cánh cứng được kiểm sốt Có nhiều chủng B thuringiensis khác nhau, loại tạo loại protein độc tố cho nhóm sâu hại (Dean, 1984) Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Sự phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis đa dạng quần thể vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki từ tỉnh, thành Việt Nam 2.1.2 Đánh giá độc tính chủng B thuringiensis var kurstaki sâu ăn - Đánh giá khả gây chết chủng B thuringiensis var kurstaki sâu ăn cánh vảy - Chọn lọc chủng B thuringiensis var kurstaki kháng tia UV tối ưu điều kiện sản xuất chế phẩm VBt - Đánh giá hiệu trừ sâu ăn chế phẩm VBt điều kiện nhà lưới đồng ruộng 2.2 Vật liệu nghiên cứu Hóa chất dùng phân lập vi khuẩn B thuringiensis: Dịch chiết nấm men, NaCl, Tryptone, Agar, MnCl2, NaH2PO4, Na2HPO4; Bộ nhuộm Gram (Nam Khoa, Việt Nam) gồm: Crystal violet, lugol, cồn, safranin; dầu soi kính, dung dịch lục malachite (C23H25N2Cl), dung dịch Fuchsin, dung dịch acid carbolic, NaOH Sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng nuôi nhà lưới kín phịng Sâu ni thức ăn tự nhiên (cải ngọt, cải xanh), có kèm mật ong có hoa tạo tiểu sinh thái phù hợp với tự nhiên, chọn sâu khỏe mạnh lớn ni hóa nhộng Sâu nhân ni phịng thí nghiệm (nhiệt độ phịng 28 – 300C, ẩm độ 75%) vịng đời, đồng tuổi (đang giai đoạn tuổi 2) Loại bỏ sâu non có tượng bị virus hay bị bệnh khác 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sự phân bố vi khuẩn B thuringiensis chọn lọc vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki đất từ tỉnh, thành 2.3.1.1 Phương pháp thu thập mẫu đất Mẫu đất lấy điểm theo đường chéo góc (điểm góc khu đất) Dùng dụng cụ lấy mẫu gạt bỏ lớp đất mặt, đào sâu lấy phần đất cách lớp mặt – 10 cm Trộn đất điểm lại với thành mẫu chung cho vào hộp nhựa đậy kín nắp, ghi nhận thơng tin chi tiết mẫu đất (địa điểm, loại đất, tọa độ) Số mẫu thu thập: 616 mẫu đất thu thập 22 tỉnh, thành vùng Đồng sông Hồng, vùng Duyên Hải miền Trung, vùng Đông Nam Bộ, vùng Đồng sông Cửu Long tập trung khu vực đất canh tác (đất trồng rau màu, lúa, ăn công nghiệp – 476 mẫu), đất không canh tác (trầm tích sơng, hồ, cát ven biển, vùng hải đảo (Phú Quý, Phú Quốc, Lý Sơn), rừng bảo tồn, ven đường – 140 mẫu) vị trí lấy mẫu địa phương hóa xác định tọa độ theo GPS 2.3.1.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường phân lập mẫu đất Môi trường T3 agar (môi trường phân lập) Môi trường T3 lỏng (môi trường tăng sinh, môi trường lắc mẫu) Môi trường Clark - lubs Môi trường phản ứng thủy phân tinh bột Tất môi trường điều chỉnh pH 7,0 sau hấp khử trùng 121oC, atm 20 phút 2.3.1.3 Phân lập mẫu vi khuẩn Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Traves, 1987 Sau ngày, chọn khuẩn lạc với đặc điểm: màu trắng, thô, lan nhanh đĩa, đem cấy ria đĩa petri có chứa mơi trường T3 đặc Tiếp tục cấy khuẩn lạc đến vi khuẩn xuất đĩa có hình dạng kích thước Các chủng phân lập giữ ống nghiệm chứa môi trường LB 2.3.1.4 Định danh vi khuẩn B thuringiensis bằng thử nghiệm sinh hóa Nhuộm Gram, nhuộm bào tử tinh thể, thử hoạt tính catalase, Phản ứng VP (Voges-Proskauer), Phản ứng thủy phân tinh bột, Thử nghiệm khả di động đo kích thước tế bào vi khuẩn 2.3.1.5 Phương pháp tăng sinh khối vi khuẩn B thuringiensis Nuôi cấy chủng vi khuẩn nghi ngờ B thuringiensis phân lập môi trường T3 lỏng 30oC, lắc 180 vòng/phút 48 giờ, đem xử lý mẫu 70oC 10 phút pha loãng mẫu đến 10-7 Lấy 0,1 mL nồng độ pha loãng từ 10-5, 10-6, 10-7 trang vào đĩa thạch vô trùng chứa môi trường T3 Để vào tủ ấm 28oC 24 đếm số lượng khuẩn lạc diện đĩa Môi trường nhân nuôi vi khuẩn (Môi trường dịch chiết nấm men) 2.3.1.6 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn B thuringiensis Bảo quản giống dầu khống: tạo mơi trường yếm khí dầu khống để ức chế sinh trưởng vi khuẩn Cho dầu khống vào ống Eppendorf khử trùng 121oC, atm 20 phút Dùng que cấy vơ trùng lấy vi khuẩn cho vào ống Eppendorf, đậy nắp dùng paraffin quấn quanh miệng ống, nuôi khoảng 24 đem bảo quản - 20oC 2.3.2 Khuếch đại trình tự 16S-rDNA gen cry chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki 2.3.2.1 Ly trích DNA Các chủng vi khuẩn B thuringiensis phân lập nuôi cấy môi trường LB lỏng 30oC, lắc 180 vòng/phút 24 DNA tổng số tách kít Wizar Genomic DNA Purification (Promega) GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn sử dụng DNA sau ly trích hịa trữ tủ âm 20oC 2.3.2.2 PCR Phản ứng PCR thực với cặp primer để khuếch đại trình tự 16S–rDNA (cặp primer 63F, 1489R) gen cry1 (cặp primer Un1(F), Un1(R)) cry2 (cặp primer Un2(F), Un2(R)), cry4 (cặp primer Un4(F), Un4(R)), cry9 (cặp primer Un9(F), Un9(R)) chủng vi khuẩn phân lập theo Ben-Dov ctv (1997) Chu trình phản ứng PCR theo Khojan ctv (2013) 2.3.2.3 Điện di gel agarose đọc kết sản phẩm PCR Sản phẩm PCR kiểm tra cách điện di gel agarose 1,0%, nhuộm với SYBGreen Chạy điện di hiệu điện 100V 35 phút Quan sát kết tia UV Đọc kết quả, chụp ảnh gel máy chụp ảnh gel (UVP MultiDoc – It Digital Imaging System) Sản phẩm PCR gửi giải trình tự First Base, Malaysia Kết giải trình tự kiểm tra có trùng khớp với vùng gen cry1, cry2, cry4, cry9 đối chứng dương (B thuringiensis var kurstaki) ngân hàng gene 2.3.3 Xác định diện protein vip3a vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Phản ứng PCR khuếch đại gen vip3a vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki thực với cặp primer Vip3a – Fw Vip3a – Rv theo Abdelkefi ctv, 2005 Thành phần phản ứng bao gồm Taq DNA polymerase (5 units/µL) 6,5 μL, primer xi (10 nM) 26 μL, primer ngược (10 nM) 26 μL, dNTP mixture (2 mM) 26 μL, 10X PCR buffer + 25 mM MgCl2 26 μL, nước tinh khiết 139,5 μL Tổng thể tích phản ứng 250 μL Chu trình phản ứng khuếch đại gồm chu kỳ 95°C, 90 giây 24 chu kỳ (30 giây 94°C, 30 giây 45°C, 90 giây 72°C) 420 giây 72ºC 2.3.4 Đánh giá độc tính mẫu phân lập B thuringiensis var kurstaki sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) điều kiện phịng thí nghiệm Sâu nhân ni phịng thí nghiệm (nhiệt độ phịng 28 – 30oC, ẩm độ 75%) vịng đời, đồng tuổi (đang giai đoạn tuổi 2) Cây cải 15 ngày tuổi, có từ – 12 trồng chậu đường kính 25 cm Trên cải thả 10 sâu tuổi Chậu đặt dĩa nhựa có chứa nước để đảm bảo cho sâu khơng bị khỏi cải Mỗi chậu cải đặt lồng lưới vải thưa để đảm bảo môi trường bên ln thống khí Bố trí lồng thí nghiệm nơi thoáng mát Dịch chủng vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki phân lập pha loãng 1% phun lên cải vào buổi chiều Nghiệm thức đối chứng phun nước lã Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, yếu tố, lần lặp lại Theo dõi đếm số sâu sống sau ngày, ngày, ngày, ngày ngày sau phun dịch vi khuẩn Hiệu lực diệt sâu tính theo cơng thức Abbott (1925): A (%) = (1 – T/C) x 100 Trong A (%) số hiệu lực diệt sâu; C số sâu sống sót nghiệm thức đối chứng; T số sâu sống sót nghiệm thức thí nghiệm 2.3.5 Xác định giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki tuyển chọn 2.3.5.1 Xác định giá trị LC50 Sau chọn chủng vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki có khả diệt sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng, giá trị LC50, LT50 chủng xác định sâu hai giai đoạn tuổi tuổi Thí nghiệm tiến hành sâu giai đoạn tuổi tuổi Sâu cân trọng lượng nhằm đảm bảo đồng Thí nghiệm với 50 sâu/mật độ/độ tuổi, sâu cho vào 10 hộp (5 sâu/hộp) nhằm tạo mơi trường thơng thống Chuẩn bị dịch vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki thành mật độ 103, 105, 107, 109 CFU/mL đối chứng (sử dụng nước cất) Tiến hành lây nhiễm cách phun dung dịch chứa B thuringiensis var kusrtaki lên cải để cho vào hộp để sâu ăn, bổ sung thức ăn cho sâu cải (khơng phun dung dịch có chứa B 11 chủng với tỷ lệ 1: Tiến hành thử nghiệm hiệu diệt sâu tơ, sâu khoang sâu xanh da láng (sâu giai đoạn tuổi 2) Dịch vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki phân lập pha loãng 1% với nồng độ 107, 108, 109 CFU/mL phun lên cải vào buổi chiều Nghiệm thức đối chứng phun nước lã Cây cải 15 ngày tuổi, có từ – 12 trồng chậu đường kính 25 cm Trên cải thả 10 sâu tuổi Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn toàn ngẫu nhiên, yếu tố, lần lặp lại Theo dõi đếm số sâu sống sau ngày, ngày, ngày, ngày ngày sau phun dịch vi khuẩn 2.3.7.5 Khảo sát mức nhiệt độ bảo quản chế phẩm VBt Nhân sinh khối chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki có hiệu lực diệt sâu cao môi trường dịch chiết nấm men tạo chế phẩm VBt điều kiện nhiệt độ 33oC, pH 7, thời gian lên men 48 1% dịch tăng sinh (với mật độ 105 CFU/mL) Chế phẩm VBt bảo quản mức nhiệt độ 4oC, 25oC 35oC thời gian 12 tháng Định kỳ hàng tháng tiến hành đếm bào tử để xác định diện vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki điều kiện nhiệt độ 2.3.8 Khảo sát khả tăng sinh vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki bằng hệ thống lên men tự động Lít BioFlo 120 Phương pháp thực hiện: sử dụng lít mơi trường dịch chiết nấm men cho vào bình ni cấy hấp tiệt trùng (121oC/20 phút) Lên men điều kiện nhiệt độ 33oC, pH 7, tốc độ khuấy 170 vòng/phút, DO 30, khơng khí 100%, dịch tăng sinh (với mật độ 103 CFU/mL) Thí nghiệm bố trí đơn yếu tố với lần lặp lại nghiệm thức: Lên men tự động BioFlo 120 với dịch tăng sinh 0,1%, 0,5%, 1,0% đối chứng Lên men thông thường với dịch tăng sinh 1,0% Chi tiêu theo dõi: Mật độ vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki 12, 24 48 sau lên men 2.3.9 Đánh giá độc tính chế phẩm VBt sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) điều kiện nhà lưới Tiến hành thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki lên men hệ thống lên men tự động (gọi tắt chế phẩm VBt) với đối tượng thử nghiệm: sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng Phương pháp bố trí: Mỗi nghiệm thức chậu cải với đường kính 20 – 25 cm thả 10 sâu/nghiệm thức, chế phẩm phun lần, lúc sâu tuổi Thí nghiệm bố trí với lần lặp lại, nghiệm thức: Chế phẩm VBt lên men tự động với liều lượng 1.000 mL/ha, Chế phẩm VBt lên men 12 thơng thường với liều lượng 1.000 mL/ha, Vi-Bt® 32000 WP với liều lượng 1.000 mL/ha đối chứng phun nước cất Chỉ tiêu theo dõi: Số sâu sống, chết trước phun, 1, 2, 3, ngày sau phun chế phẩm VBt tất nghiệm thức 2.3.10 Đánh giá độc tính chế phẩm VBt sâu tơ (Plutella xylostella) đồng ruộng Qua kết thử nghiệm hiệu lực diệt sâu điều kiện nhà lưới nội dung 2.3.9 tiến hành thử nghiệm đồng ruộng chế phẩm VBt với đối tượng thử nghiệm sâu tơ Trung tâm Giống trồng, vật nuôi thủy sản Thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp: Thí nghiệm bố trí theo khối đầy đủ ngẫu nhiên, lần lặp lại, thí nghiệm có diện tích 30 m2 Ruộng bố trí thí nghiệm: khơng phun thuốc BVTV vụ Cây trồng: giống cải bẹ xanh Thuốc phun lần, lúc sâu tuổi mật độ sâu tơ – con/cây (cây cải giai đoạn 20 ngày sau trồng) Phun thuốc vào buổi chiều mát Lượng nước thuốc: 400 L/ha Dụng cụ xử lý: phun bình bơm tay đeo vai Chỉ tiêu phương pháp điều tra: Mật số sâu tơ vào thời điểm: trước xử lý thuốc 1, 3, 5, 7, 14 ngày sau phun thuốc Mỗi thí nghiệm chọn 05 điểm đường chéo góc, điểm điều tra 04 2.5 Xử lý phân tích số liệu Kết giải trình tự xử lý phần mềm Bioedit (ver 5.20), so sánh với trình tự gen sở liệu Genbank (NCBI) Số liệu thí nghiệm thu thập tổng hợp phần mềm Microsoft Excel 2016 xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), kết phân hạng theo Duncan chương trình SPSS phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design - Expert 11.0 phần mềm PoloPlus© để thực phép tính mơ tả phân tích probit Finney (Finney, 1971) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân bố vi khuẩn B thuringiensis chọn lọc vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki đất tỉnh, thành Việt Nam 3.1.1 Phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 13 Bảng 3.1 Số mẫu đất có khuẩn lạc theo nguồn mẫu thu thập Chỉ tiêu Số mẫu có khuẩn lạc nghi ngờ B thuringiensis Số mẫu thu thập % (*)/Số mẫu thu thập % (*)/Tổng số mẫu Đất không canh tác Cát ven Hải Ven Rừng biển đảo đường Đất canh tác Trầm tích 220 10 10 20 20 476 46,2 35,7 20 50,0 1,6 20 25,0 0,8 20 50,0 1,6 40 50,0 3,2 40 50,0 3,2 Số mẫu có khuẩn lạc nghi ngờ B thuringiensis (*) Theo Martin Travers (1989) mẫu đất châu Á có số Bt 0,85 Ở Việt Nam, Bùi Thị Hương ctv (2005) cho thấy mẫu đất tỉnh Miền Bắc có số Bt 0,35 với chủng vi khuẩn thuộc loài B thuringiensis var kurstaki, var aizawai, var morrisoni Trong nghiên cứu này, B thuringiensis diện vùng địa lý khác Việt Nam với số Bt từ 0,2 đến 0,41 3.1.2 Xác định chủng vi khuẩn B thuringiensis bằng thử nghiệm sinh hóa Từ 1.337 khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác thu 285 chủng vi khuẩn có đặc điểm hình que, Gram dương, sinh bào tử, catalase dương tính, có khả thủy phân tinh bột, phản ứng V.P dương tính Sau nhuộm 261/285 chủng vi khuẩn có tinh thể bắt màu đỏ, bào tử có viền màu đỏ Đa số chủng vi khuẩn sinh tinh thể hình thoi tập trung mẫu đất canh tác (Bảng 3.2) A C B A B Hình 3.1 Tinh thể độc mẫu vi khuẩn quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 4,06 KX (A) Tinh thể hình thoi; (B) Tinh thể hình cầu; (C) Tế bào vi khuẩn 14 Bảng 3.2 Các dạng tinh thể độc B thuringiensis từ mẫu phân lập Địa điểm Hà Nội Vĩnh Phúc Thái Bình Hải Phịng Hải Dương Hưng n Bắc Ninh Hà Nam Nam Định Đà Nẵng Quảng Nam Bình Thuận Lâm Đồng Đồng Nai Bà Rịa –Vũng Tàu TP.Hồ Chí Minh Tây Ninh Tiền Giang Bến Tre An Giang Đồng Tháp Kiên Giang Tổng số tinh thể %/tổng số tinh thể Số chủng vi khuẩn sinh tinh 10 3 3 70 16 10 62 30 1 261 100 Hình dạng tinh thể độc Hình thoi Hình ovan Hình cầu Hình trám 1 3 29 10 34 15 1 126 48,3 1 1 1 14 1 11 50 19,2 1 2 15 12 52 19,9 1 1 12 33 12,6 3.2 Xác định diện gen cry vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Kết phân tích trình tự gen thuộc nhóm cry1Aa, cry1Ac, cry2Ac, cry4 cry9 mẫu phân lập cho thấy tương đồng cao trình tự với trình tự DNA mục tiêu Sự xuất nhóm gen cry1 nhiều (63,3%), cry2 (28,7%), cry4 (6,9%) cry9 15 (0,1%) Có chủng vi khuẩn diện gen (cry1, cry2, cry4, cry9), đến gen (cry1 cry2, cry1 cry4, cry2 cry 4, cry1 cry9, cry1, cry2 cry4) mẫu So với công bố nước, nghiên cứu luận án cho thấy tần suất xuất gen cry1, cry2 cry4 tương đối cao thường xuất Gen cry9 có tần suất xuất tương đối thấp từ 2,6% – 15,5% (Ben Dov ctv, 1997; Bravo ctv, 1998; Zhang ctv, 2000; Wang ctv, 2003; ) xuất gen cry1 cry2 Ben Dov ctv (1999) phát số mẫu có gen cry9 diện hai gen cry1 gen cry2 3.3 Xác định diện gen vip3a vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki M 10 11 27 bp Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR vùng gen vip3a M thang protein chuẩn 10 – 200 kDa.(Promega); (1) dòng VBt2119.1; (2) dòng VBt21110.1; (3) dòng VBt2751.3; (4) dòng VBt27510.2; (5) dòng VBt2736.2; (6) dòng VBt2735.1; (7) dòng VBt2751.2; (8) dòng VBt26313.2; (9) dòng VBt26311.1; (10) dòng VBt26323.1; (11) đối chứng dương Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy có mẫu (VBt2119.1, VBt21110.1, VBt2735.1, VBt2736.2 VBt27510.2) có sản phẩm khuếch đại với kích thước khoảng 3,4 kb xuất băng khơng có sản phẩm phụ (Hình 3.2) So với gen gây độc khác cry hay cyt, vip3a có phổ kháng sâu bệnh côn trùng rộng Bên cạnh đó, vip3a cịn có khả kiểm sốt số đối tượng sâu bệnh trùng nhạy cảm với gen cry1 cry2 (Estruch ctv, 1996; Lee ctv, 2003) 3.4 Khả gây chết sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki phân lập Từ 261 mẫu vi khuẩn sinh tinh thể xác định 20 chủng vi khuẩn mang gen cry1, cry2, cry4, cry9 vip3a phân lập tỉnh Vĩnh 16 Phúc, Lâm Đồng, Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Tiền Giang Bến Tre Một ngày sau xử lý, ghi nhận có sâu chết tăng dần đến ngày thứ sau xử lý Hiệu lực diệt sâu tơ, sâu khoang sâu xanh da láng chủng vi khuẩn nghiên cứu đạt từ 72 – 80% Một số mẫu vi khuẩn B thuringiensis gen cry1 cry2 có khả diệt sâu tơ, sâu khoang sâu xanh da láng VBt2119.1 (mẫu phân lập từ tỉnh Vĩnh Phúc mang cry1), VBt26317.2 (Lâm Đồng, cry2), VBt2735.1 (Tiền Giang, cry1), VBt2767.6 (Tây Ninh, cry1 cry2) chủng có hiệu lực gây chết sâu cao 3.5 Giá trị LC50, LT50 chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) điều kiện phịng thí nghiệm Kết thử hoạt tính LC50 sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng điều kiện phịng thí nghiệm chủng vi khuẩn cho thấy hiệu lực diệt sâu mật độ bào tử 107 CFU/mL cho hiệu lực diệt sâu tốt, mật độ thấp 105 CFU/mL 103 CFU/mL cho hiệu lực thấp Qua thí nghiệm cho thấy giá trị LC50 chủng B thuringiensis var kurstaki khoảng 2,5 x 105 – 4,5 x 107 CFU/mL LT50 từ – ngày sau xử lý giai đoạn sâu tuổi Ở giai đoạn sâu tuổi LC50 chủng B thuringiensis var kurstaki khoảng 1,5 x 106 – 2,5 x 108 CFU/mL LT50 từ – ngày sau xử lý Trong trình theo dõi, số sâu cịn sống nghiệm thức xử lý vi khuẩn có triệu chứng biếng ăn, giảm khả gây hại chết – 14 ngày sau xử lý Do mật độ bào tử tốt gây chết sâu hại từ 107 CFU/mL trở lên, thuận lợi cho việc sản xuất sử dụng Bên cạnh đó, hiệu lực diệt sâu thay đổi phụ thuộc vào độ tuổi sâu, hiệu sâu tuổi 3.6 Chọn tạo chủng B thuringiensis var kusrtaki kháng tia UV 3.6.1 Khả chống chịu tia UV chủng vi B thuringiensis var kurstaki bước sóng 254 nm 365 nm Ở bước sóng 254 nm, sau 30 phút, mật độ bào tử chủng vi khuẩn giảm, chủng VBt2119.1 (3,0 x 102 CFU/mL) VBt2735.1 (2,8 x 105 CFU/mL) giảm mạnh so với chủng vi khuẩn khác Khi tăng thời gian chiếu 60 phút, 90 phút 120 phút, mật độ tất chủng vi khuẩn giảm rõ rệt Ở mức thời gian 60 phút, mật độ bào tử cao chủng VBt2762.1 (2,7 x 106 CFU/mL) thấp chủng VBt2119.1 (0,0 17 CFU/mL) Ở 90 phút có chủng vi khuẩn khơng có khả chống chịu tia UV Ở 120 phút chủng VBt21110.1 (5,4 x 103 CFU/mL), VBt26310.1 (2,8 x 102 CFU/mL) VBt2751 (4,0 x 103 CFU/mL) tồn Khi tăng thời gian chiếu tia UV lên 150 phút tất chủng vi khuẩn chết Khi chiếu tia UV 120 phút bước sóng 365 nm, hai chủng VBt2736.2 VBt2767.6 (0,0 CFU/mL) khơng có khả chống chịu Các chủng vi khuẩn cịn lại có khả chống chịu tia UV, chủng VBt21110.1 (6,23 x 104 CFU/mL), VBt26310.1 (3,1 x 105 CFU/mL), VBt2762.1 (3,8 x 105 CFU/mL) chủng vi khuẩn VBt2751 (6,2 x 104 CFU/mL) có mật độ cao chủng lại Từ kết thực nghiệm ba chủng VBt21110.1, VBt26310.1, VBt2751 có khả chống chịu tia UV cao đánh giá hiệu gây chết sâu tơ (Plutella xylostella) 3.6.2 Hiệu gây chết sâu tơ chủng vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki có khả chống chịu UV điều kiện phịng thí nghiệm Bảng 3.3 Hiệu gây chết (%) sâu tơ (Plutella xylostella) chủng vi khuẩn chiếu tia UV Hiệu gây chết (%) sâu tơ Chủng vi khuẩn NSXL NSXL NSXL NSXL NSXL VBt21110.1ΔUV 15,0 bcd 40,0 b 52,5 ab 60,0 b 65,0 b VBt26310.1ΔUV 7,5 cde 15,0 c 17,5 c 35,0 b 45,0 c VBt2751ΔUV 10,0 de 17,5 c 30,0 d 45,0 d 50,0 c VBt21110.1 30,0 a 50,0 a 62,5 a 72,5 a 80,0 a VBt26310.1 20,0 ab 35,0 b 45,0 b 55,0 b 70,0 b VBt2751 22,5 abc 32,5 b 47,5 b 62,5 b 77,5 a ĐC 0,0 e 0,0 d 0,0 e 0,0 e 0,0 d Mức ý nghĩa ** ** ** ** ** CV (%) 5,4 4,7 8,0 7,8 8,2 Trong cột, giá trị có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa; **: khác biệt mức có ý nghĩa; NSXL: Ngày sau xử lý; Mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL, Đối chứng phun nước cất với liều lượng 100 mL 18 Bảng 3.4 Hiệu gây chết (%) sâu khoang (Spodoptera litura) chủng vi khuẩn chiếu tia UV Hiệu gây chết (%) sâu khoang Chủng vi khuẩn NSXL NSXL NSXL NSXL NSXL VBt21110.1ΔUV 12,5 c 20,0 b 30,0 cd 42,5 d 57,5 c VBt26310.1ΔUV 10,0 c 17,5 b 22,5 d 35,0 d 50,0 c VBt2751ΔUV 7,5 cd 15,0 b 20,0 d 25,0 e 32,5 d VBt21110.1 32,5 a 45,0 a 57,5 a 70,0 a 77,5 a VBt26310.1 15,0 bc 22,5 b 40,0 bc 52,5 c 67,5 b VBt2751 22,5 b 42,5 a 50,0 a 62,5 b 72,5 a ĐC 0,0 d 0,0 c 0,0 e 0,0 f 0,0 e Mức ý nghĩa ** ** ** ** ** CV (%) 6,3 10,9 10,1 6,3 3,9 Trong cột, giá trị có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa; **: khác biệt mức có ý nghĩa; NSXL: Ngày sau xử lý; Mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL, Đối chứng phun nước cất với liều lượng 100 mL Bảng 3.5 Hiệu gây chết (%) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) chủng vi khuẩn chiếu tia UV điều kiện phịng thí nghiệm Hiệu gây chết (%) sâu xanh da láng Chủng vi khuẩn NSXL NSXL NSXL NSXL NSXL VBt21110.1ΔUV 12,5 cd 27,5 bc 32,5 bc 37,5 b 52,5 c VBt26310.1ΔUV 5,0 de 17,5 cd 25,0 bc 35,0 b 47,5 c VBt2751ΔUV 0,0 e 15,0 d 22,5 c 30,0 b 37,5 d VBt21110.1 35,0 a 47,5 a 55,0 a 65,0 a 77,5 a VBt26310.1 20,0 bc 27,5 bc 35,0 b 50,0 b 67,5 b VBt2751 27,5 ab 37,5 ab 47,5 a 60,0 ab 70,0 ab ĐC 0,0 e 0,0 e 0,0 d 0,0 d 0,0 e Mức ý nghĩa ** ** ** ** ** CV (%) 7,6 3,6 7,1 8,9 7,4 Trong cột, giá trị có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa; **: khác biệt mức có ý nghĩa; NSXL: Ngày sau xử lý; Mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL, Đối chứng phun nước cất với liều lượng 100 mL Kết cho thấy hiệu gây chết sâu khoang sâu xanh da láng chủng vi khuẩn chiếu tia UV NSXL thấp, chủng vi 19 khuẩn VBt21110.1ΔUV đạt 57,5% sâu khoang, 52,5% sâu xanh da láng, 65,0% sâu tơ chủng VBt2751ΔUV đạt 32,5% 37,5% sâu khoang sâu xanh da láng Khả phát triển độc tính vi khuẩn giảm đáng kể, ảnh hưởng đến khả diệt sâu sau chiếu xạ tia UV bước sóng từ 250 đến 380 nm (Setlow, 1994; Mark ctv, 2000) 3.7 Tối ưu điều kiện lên men vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki 3.7.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh khối vi khuẩn Ba chủng vi khuẩn VBt21110.1 (mẫu phân lập từ tỉnh Vĩnh Phúc), VBt26310.1 (Lâm Đồng), VBt2751 (Bến Tre) mang gen cry1, cry2, cry9 gen độc gây chết cho cánh vảy thử nghiệm nhân sinh khối với bốn loại môi trường điều kiện nhiệt độ 300C, pH 1% dịch tăng sinh (105 CFU/mL) Bảng 3.6 Mật số vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki loại môi trường Mật số vi khuẩn (CFU/mL) Nghiệm thức VBt21110.1 VBt26310.1 VBt2751 8 5,4 x 10 a 3,3 x 10 b 2,1 x 108 b MT 7 5,2 x 10 c 7,1 x 10 d 3,6 x 107 d MT 6,7 x 108 a 5,2 x 108 a 3,7 x 108 a MT 3,1 x 108 b 1,6 x 108 c 1,5 x 108 c MT Mức ý nghĩa ** ** ** CV (%) 0,59 0,56 0,64 Sau 48 giờ, mật độ trung bình ba chủng vi khuẩn môi trường (dịch chiết nấm men khoáng) đạt khoảng 108 CFU/mL, cao so với loại mơi trường cịn lại (Bảng 3.20) Mơi trường chọn để tăng sinh ba chủng vi khuẩn 3.7.1.1 Ảnh hưởng thời gian lên men đến sinh khối vi khuẩn Mật độ ba chủng vi khuẩn đạt cao sau 48 nuôi cấy khác biệt mốc thời gian lại, chủng VBt21110.1 đạt 6,8 x 108 CFU/mL, chủng VBt26310.1 đạt 5,3 x 108 CFU/mL, chủng VBt2751 đạt 5,8 x 108 CFU/mL Theo Nguyễn Thị Hoài Hà Ngô Giang Liên (2003), thời gian sinh trưởng vi khuẩn B thuringiensis ngắn, thời gian dài sinh khối vi khuẩn nhân lên giảm Kết thí nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn sinh trưởng, phát triển tốt đạt mật độ tối ưu thời gian 48 giờ, sau 48 sinh khối bắt đầu giảm nhanh 20 Thời gian tối ưu nhân sinh khối chủng B thuringiensis 48 giờ, sử dụng cho thí nghiệm 3.7.1.2 Ảnh hưởng pH đến sinh khối vi khuẩn Mật độ vi khuẩn chủng VBt21110.1 đạt giá trị cao 5,07 x 108 CFU/mL pH 8, không khác biệt pH 7,5 Mật độ vi khuẩn chủng VBt26310.1 VBt2735.1 pH 7,5 đạt cao 6,1 x 108 CFU/mL 4,5 x 108 CFU/mL, nhiên không khác biệt so với pH Chủng vi khuẩn VBt2751 đạt mật độ cao 4,4 x 108 CFU/mL nuôi cấy mơi trường có pH Do đó, pH điều kiện tối ưu để nhân sinh khối chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki 3.7.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh khối vi khuẩn Mật độ vi khuẩn chủng VBt21110.1 đạt mật độ cao 33oC 6,15 x 108 CFU/mL Chủng vi khuẩn VBt2751 36oC có mật độ đạt cao 6,0 x 108 CFU/mL, khác biệt với mức 27oC 33oC Chủng VBt26310.1 đạt cao 5,5 x 108 CFU/mL nhiệt độ 33oC (Bảng 3.23) Qua cho thấy nhiệt độ 30 – 36oC nhiệt độ thích hợp nhân sinh khối chủng vi khuẩn Vi khuẩn B thuringiensis sinh trưởng nhiệt độ từ 15oC đến 45oC, nhiệt độ tối ưu 30 – 35oC, nhiệt độ thấp sinh trưởng chậm, nhiệt độ cao từ 35oC đến 40oC sinh trưởng nhanh chóng lão hóa Từ thấy, nhiệt độ khác khả nhân sinh khối chủng vi khuẩn Bacillus sp khác (Ngơ Đình Bính ctv, 2010; Stanford ctv, 2015) 3.7.2 Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm a pH – Thời gian b Nhiệt độ - Thời gian c Nhiệt độ - pH Hình 3.3 Bề mặt đáp ứng cặp yếu tố ảnh hưởng đến lên men vi khuẩn 21 Các thí nghiệm tăng sinh khối thực với chủng VBt21110.1 với ba yếu tố thời gian (X1), pH (X2), nhiệt độ (X3) ba mức gồm 17 nghiệm thức Giá trị F mơ hình 70,84 tương ứng với p < 0.0001 (99,99%), chuẩn F cho khơng tương thích mơ hình 4,31 (p=0,0959), hệ số hồi quy R2 = 0,9891 > 0,75 chứng tỏ mơ hình tương thích với thực nghiệm Từ giá trị thực nghiệm, phương trình hồi quy nhận sau: Y = 8,85 - 0,0062X1 – 0,0662X2 - 0,0925X3 + 0,0725X1X2 – 0,0550X1X3 + X2X3 - 1,26X12 -0,1988X22 + 0,0188X32 3.7.3 Hiệu gây chết sâu kết hợp hai chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Từ kết khảo sát khả gây chết sâu hại, kháng tia UV, yếu tố môi trường, nhiệt độ, pH, độ ẩm, thời gian nuôi cấy, hai chủng vi khuẩn VBt2110.1, VBt26310.1 phối hợp thử nghiệm gây chết sâu hại Tiến hành nhân sinh khối hai chủng vi khuẩn môi trường dịch chiết nấm men nồng độ 107 CFU/mL, 108 CFU/mL, 109 CFU/mL thể qua hiệu lực gây chết chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Kết thí nghiệm cho thấy hiệu lực diệt sâu 109 CFU/mL cao đạt 97,5% Hai chủng vi khuẩn VBt21110.1, VBt26310.1 mang gen vip3a (VBt21110.1), gen cry1 (VBt21110.1, VBt26310.1) gen cry9 (VBt26310.1) bổ trợ với để phòng trừ sâu hại Qua kết nghiên cứu tác giả nước minh chứng vip3a cịn có khả kiểm sốt số đối tượng trùng mẫn cảm với gen cry cry1 cry2, cry9, có khả hỗ trợ cho việc gây chết sâu hại có tính kháng dịng cry1 (Tabashnik ctv, 2000; Jain, 2012; Shu ctv, 2013) 3.7.4 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ bảo quản đến chế phẩm VBt Hai chủng vi khuẩn VBt21110.1, VBt26310.1 tăng sinh mơi trường lỏng để tạo chế phẩm VBt có khả diệt sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng Mật độ vi khuẩn chế phẩm VBt vừa sản xuất 7,65 x 108 CFU/mL Mật độ vi khuẩn kiểm tra theo tháng bảo quản mức nhiệt độ 4oC, 25oC 35oC thời gian năm Kết thí nghiệm cho thấy nhiệt độ 4oC, 25oC thời gian – tháng, tháng nhiệt độ 35oC mật số vi khuẩn giảm không đáng kể Sau tháng vi khuẩn giảm nhiều khả diệt sâu Kết nghiên cứu Moustafa1 ctv (2018) cho thấy giảm 60% độc tính thuốc Dipel × 6.4% WP sau bảo quản 35 ± 20C 12 tuần khoảng 70% sau 22 lưu trữ ánh sáng mặt trời ngày Do vi khuẩn bị ảnh hưởng nhiều vào điều kiện độ ổn định nhiệt độ bảo quản, thời gian lưu trữ, cách thức bảo quản lưu trữ kho nóng, kệ lưu trữ trời 3.8 Tăng sinh vi khuẩn bằng hệ thống lên men tự động lít BioFlo 120 Khi tăng sinh vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki hệ thống lên men tự động lít BioFlo 120 (Eppendorf – Đức) mật độ vi khuẩn đạt từ 1,8 x 1014 CFU/mL đến 6,2 x 1014 CFU/mL vào thời điểm 48 sau lên men, cao nhiều lần so với lên men thông thường thời gian Lượng dung dịch vi khuẩn thu với khối lượng lớn, thuận lợi cho nghiên cứu tạo chế phẩm phòng trừ sâu hại Bảng 3.7 Mật số vi khuẩn (CFU/mL) sau lên men hệ thống lên men tự động lít BioFlo 120 Mật số vi khuẩn (CFU/mL) Nghiệm thức 24 48 12 Lên men tự động, dịch tăng sinh 0,1% 3,5 x 10 a 1,8 x 1014 a Lên men tự động, dịch tăng sinh 0,5% 1,8 x 1013 a 4,7 x 1014 a Lên men tự động, dịch tăng sinh 1,0% 1,6 x 1013 a 6,2 x 1014 a Lên men thông thường, dịch tăng sinh 1,0% 2,0 x 10 b 4,3 x 108 b Mức ý nghĩa ** ** CV (%) 0,24 0,26 3.9 Hiệu chế phẩm VBt sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) điều kiện nhà lưới Hiệu phịng trị chế phẩm VBt bắt đầu có hiệu lực từ ngày sau phun tăng cao vào lúc ngày sau phun (hiệu lực dao động khoảng 70,0 – 87,5%) Kết nghiên cứu nhiều tác giả cho thấy vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki làm cho sâu cánh vảy thường chết vòng 12 đến 120 tùy thuộc vào lượng B thuringiensis var kurstaki sâu ăn vào (Chilcott ctv, 1993; Liliana, 2013; Leopoldo Palma, 2014) Do đó, khoảng thời gian từ 12 đến 72 khoảng thời gian vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki có tích lũy dần mật số từ 120 sau xử lý bắt đầu phát huy hiệu gây chết sâu Kết đánh giá chế phẩm VBt gây chết sâu hại điều kiện nhà lưới với hiệu tương đối cao (từ 70 – 87,5%), luận án tiến hành 23 thử nghiệm đồng sâu tơ gây hại trồng Thành phố Hồ Chí Minh 3.10 Hiệu chế phẩm VBt sâu tơ (Plutella xylostella) đồng ruộng Mật số trung bình sâu tơ nghiệm thức từ 12 đến 15 con/m2 sâu số giai đoạn tuổi vào thời điểm trước phun thuốc Tại thời điểm ngày sau phun, mật số sâu đối chứng giảm xuống – con/m2, mật số sâu nghiệm thức chế phẩm VBt Vi-Bt® 32000WP tiếp tục giảm nhanh khác biệt mức có ý nghĩa so với đối chứng Giữa nghiệm thức phun chế phẩm VBt khơng có khác biệt mật số sâu tơ thấp VBt lên men tự động BioFlo 120 (3,3 con/cây), chế phẩm ViBt® 32000WP (4,3 con/cây) cao VBt lên men thông thường (5,0 con/cây) Bảng 3.8 Mật số sâu tơ nghiệm thức thí nghiệm Mật số sâu tơ (con/cây) Nghiệm Liều lượng thức (mL, g/ha) TP NSP NSP NSP NSP NT 1.000 14,3 6,0 a 4,0 a 3,3 a 3,3 a NT 1.000 13,5 7,5 a 6,0 b 5,0 b 5,0 b NT 1.000 14,8 7,0 a 5,3 ab 4,8 b 4,3 ab NT 1.000 12,5 13,8 b 15,0 c 16,3 c 14,0 c Mức ý nghĩa ns ** ** ** ** CV (%) 2,1 5,6 8,9 7,9 Trắc nghiệm phân hạng theo phép thử DUNCAN mức %; **: khác biệt mức có ý nghĩa; NSP: Ngày sau phun; NT (Lên men tự động BioFlo 120), NT (Lên men thơng thường), NT3 (Vi-Bt® 32000 WP) NT (Phun nước cất) Khi so sánh nghiệm thức phun chế phẩm (VBt Vi-Bt® 32000WP) với nghiệm thức đối chứng không phun thuốc (NT4) ta nhận thấy khác biệt rỏ rệt mật số sâu hại Các nghiệm thức phun chế phẩm VBt có mật số sâu hại thấp so với nghiệm thức đối chứng không phun thuốc Qua kết luận chế phẩm VBt có hiệu lực việc phịng trừ sâu tơ gây hại cải 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Thông qua kết phân tích 616 mẫu đất 22 tỉnh, thành xác định phân bố vi khuẩn B thuringiensis có 261 chủng sinh tinh thể với hình dạng tinh thể protein độc như: hình thoi (48,3%), hình ovan (19,2%), hình cầu (19,9%) hình trám (12,6%) Đồng thời xác định diện gen độc tính dòng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki như: gen cry1 nhiều (63,4%), gen cry2 (28,7%), cry4 (6,9%) cry9 (1,0%) có dịng xuất vip3a Đã xác định 20 chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki tỉnh, thành có độc tính cao nguồn vật liệu sản xuất chế phẩm sinh học an tồn, thân thiện với mơi trường, phù hợp với nông nghiệp hữu Với giá trị LC50 đối tượng sâu thí nghiệm chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki khoảng 2,5 x 105 – 4,5 x 107 CFU/mL LT50 từ đến ngày sau xử lý giai đoạn sâu tuổi Ở giai đoạn sâu tuổi LC50 khoảng 1,5 x 106 – 2,5 x 108 CFU/mL LT50 từ đến ngày sau xử lý Bên cạnh đó, xác định ba chủng vi khuẩn VBt2110.1ΔUV, VBt26310.1ΔUV VBt2751ΔUV có khả chống chịu tia UV tốt bước sóng 254 nm 365 nm với thời gian mức 120 phút Hiệu phòng trừ sâu hại ba chủng vi khuẩn đạt từ 52,0% đến 65,0%, có tiềm ứng dụng phòng trừ sinh học sâu hại rau Điều kiện tối ưu để tăng sinh vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki môi trường dịch chiết nấm men khoáng với điều kiện nhiệt độ 28oC, pH 7,5, sau 48 nuôi cấy Hiệu diệt sâu tơ đồng ruộng cải Thành phố Hồ Chí Minh chế phẩm VBt đạt 79,6% vào thời điểm ngày sau phun Đề nghị Có thể áp dụng điều kiện tăng sinh vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki quy mô lớn để ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho phòng trừ sâu hại Tiếp tục đánh giá hiệu chế phẩm VBt loài sâu cánh vảy hai cánh gây hại rau vùng rồng rau Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh Mở rộng đối tượng đánh giá hiệu chế phẩm VBt đối tượng sâu hại loại trồng khác DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CƠNG BỐ Các báo khoa học Dương Kim Hà, Trương Phước Thiên Hoàng, Châu Thanh Phong, Trần Thị Mộng Xinh, Trần Thị Anh Thương, Phạm Nhật Quỳnh, Trần Thị Hồng Nhung, Đoàn Thị Thùy Linh Lê Đình Đơn, 2017 Phân Lập đánh giá độc tính trùng gây hại Bacillus thuringiensis phân lập từ mẫu đất Tạp chí Bảo vệ thực vật 6: 23 – 27, (ISSN 2354 – 0710) Trương Phước Thiên Hoàng, Dương Kim Hà, Tơn Bảo Linh, Lê Đình Đơn Trần Thị Hồng Nhung, Đặng Thị Thủy Huỳnh Nguyễn Chí Linh, 2019 Xác định gen cry2 mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tỉnh thành khu vực miền nam Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển, 18(1): 106 – 116 (pISSN 2615 – 9503, eISSN 2615 – 949X) Dương Kim Hà, Trương Phước Thiên Hoàng, Trần Thị Kim Oanh, Trần Thị Hồng Nhung Lê Đình Đơn, 2019 Xác định gen Vip3A vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki kỹ thuật sinh học phân tử độc tính gây bệnh trùng gây hại Tạp chí Bảo vệ thực vật, : 33 – 38 (ISSN 2354 – 0710) Dương Kim Hà, Trương Phước Thiên Hoàng, Lê Hoàng Phúc, Nguyễn Khoa Thảo, Nguyễn Vũ Phong Lê Đình Đơn, 2021 Chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki kháng UV có khả diệt sâu tơ Tạp chí Bảo vệ thực vật, (ISSN 2354 – 0710) Dương Kim Hà, Trương Phước Thiên Hoàng, Đổng Hắc Thanh Thi, Nguyễn Thị Lệ Thương, Võ Thí Thúy Huệ, Nguyễn Vũ Phong, Lê Đình Đơn 2021 Tối ưu hóa điều kiện lên men tăng sinh vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki phân lập Việt Nam phương pháp đáp ứng bề mặt Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Bài Hội thảo Duong Kim Ha, Ton Bao Linh, Truong Phuoc Thien Hoang, Tran Thi Kim Oanh, Nguyen Bao Quoc and Le Dinh Don, 2018 Generation gene toxic of Bacillus thuringiensis var kurstaki by PCR and SDS-PAGE method (Poster) 1st INDO – ASEAN Conference on Innovative Approaches in Applied Sciences and Technologies The Journal of Agriculture and Development Dương Kim Hà, Trần Thị Kim Oanh, Trần Thị Hồng Nhung, Trương Phước Thiên Hồng, Nguyễn Bảo Quốc Lê Đình Đơn, 2019 Xác định mẫu Bacillus thuringiensis var kurstaki có hoạt tính sinh học dựa vào VIP3A Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam Nhà Xuất Nông nghiệp, 43 – 48 ISBN 978-604-60-2664-8 ... dụng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki phòng trừ sâu hại từ sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học rau, luận án ? ?Nghiên cứu đa dạng độc tính vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki sâu ăn. .. sâu ăn hại rau Vi? ??t Nam? ?? thực từ năm 2015 đến 2021 Mục tiêu nghiên cứu Xác định phân bố vi khuẩn B thuringiensis đa dạng di truyền vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki số tỉnh, thành Vi? ??t Nam Lập... loại vi khuẩn có khả diệt sâu phân lập từ thể sâu, đất, có vài loại nghiên cứu Nhiều nghiên cứu nước giới Vi? ??t Nam tập trung vào vi khuẩn tự nhiên để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, vi khuẩn Bacillus