Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác động của GCSF trên bệnh tổn thương gan do hẹp đường mật. Chuột nhắt trắng chủng Swiss Albino được gây tạo mô hình tổn thương gan bằng phẫu thắt ống dẫn mật chủ.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học TÁC ĐỘNG CỦA NHÂN TỐ KÍCH THÍCH BẠCH CẦU HẠT TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO TẮC MẬT Lê Phạm Tiến Triều*, Trần Văn Luân Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: lpttrieu@gmail.com TÓM TẮT Tổn thương gan tắc mật tổn thương nguy hiểm có tỉ lệ tử vong cao thời gian ngắn không ghép tạng kịp thời Gần đây, nhân tố kích thích bạch cầu hạt (GCSF) chứng minh giúp cải thiện chức gan kéo dài thời gian sống số bệnh gan mạn tính giai đoạn cuối nên chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá tác động GCSF bệnh tổn thương gan hẹp đường mật Chuột nhắt trắng chủng Swiss Albino gây tạo mơ hình tổn thương gan phẫu thắt ống dẫn mật chủ (BDL) Sau ngày, chuột BDL điều trị GCSF 61.5µg/kg/ngày ngày Các kết hiệu ghi nhận vào ngày 19 26 sau BDL: Chuột BDL điều trị GCSF giúp giảm biểu gen liên quan đến trình viêm xơ hóa (TGF-β1, IL-1β, procollagen type α 1, α -SMA, MMP9, TIMP1), phục hồi chức tổng hợp ALB huyết tương giảm mức độ xơ hóa hình thái mơ học so với chuột đối chứng Kết luận, GCSF có tác động giảm viêm, cải thiện chức giảm xơ hóa gan chuột tổn thương tắc mật Từ khóa: Nhân tố kích thích bạch cầu hạt, GCSF THERAPEUTIC EFFECT OF GRANULOCYTE-COLONY TIMULATING FACTOR ON BILE DUCT LIGATED MOUSE MODEL Le Pham Tien Trieu*, Tran Van Luan University of science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: lpttrieu@gmail.com ABSTRACT Biliary atresia (BA) is the condition of obstructed bile duct leading to cholestatic liver injury and liver fibrosis eventually So far, the required option for patients of BA is liver transplantation facing many challenges mostly because of organ shortage Recently, many reports have proven the beneficial role of Granulocytecolony stimulating factor (GCSF) in patients with liver fibrosis induced by viruses and alcohol based on improvement of liver function and prolonging survival lifetime via hematopoietic stem cell mobilization from bone marrow to the damaged tissue Therefore we hypothesiza that GCSF have therapeutic effect on bile duct obstruction mouse models Swiss Albino mouse underwent bile duct ligation (BDL) In 7th day post-BDL, mouse models were treated with GCSF 61,5µg/kg/day in continuous days Results showed that inflammation- and fibrosis-related genes (TGF-β1, IL-1β, procollagen type α 1, α -SMA, MMP9, TIMP1) were down-regulated; concentration of serum ALB was improved and collagen-positive area on liver tissue was decreased In conclusion, GCSF reduced inflammation, improved function and reduced fibrosis in the liver of bile duct ligated mouse model Keywords: Granulocyte-colony stimulating factor, GCSF 136 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 TỔNG QUAN Bệnh lý tắc nghẽn hẹp ống mật (biliary atresia) bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân khác nhau, hậu làm hẹp tắc nghẽn ống mật, gây ứ đọng mật gan Sự ứ đọng mật không gây nhiều biến đổi cấu trúc ống mật mà gây chết tế bào gan, chí suy gan Thống kê cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Mỹ 1:19.000, Anh nước châu Âu 1:16.000, tỷ lệ mắc bệnh Việt Nam cao 1:2400 (Holterman et al, 2017) Bệnh lý tắc ống mật nguyên nhân dẫn đến ghép gan hàng đầu trẻ sơ sinh.Tuy nhiên việc ghép gan gặp nhiều khó khăn, đặc biệt vấn đề khan nguồn nội tạng nên giải pháp mang tính lâu dài Ở Việt Nam, trẻ sinh mắc bệnh lý ống mật không ghép gan, dẫn đến tử vong vòng hai năm sau phẫu thuật Kasai Vì cần có liệu pháp để hỗ trợ điều trị thay cho việc ghép gan bệnh lý ống mật Gần đây, Yếu tố kích thích bạch cầu hạt (GCSF) (Granulocyte-colony stimulating factor), loại glycoprotein, sản xuất chủ yếu tế bào nội mô tế bào miễn dịch, có khả huy động tế bào gốc tạo máu (Heamatopoietic stem cell) (HSC) từ tủy xương máu ngoại vi, chứng minh có tác động cải thiện rõ rệt tình trạng tổn thương xơ hóa gan mơ hình động vật người (Gustot, 2014) Đối với tổn thương gan mãn tính, GCSF cải thiện số chức gan, làm giảm xơ hóa mơ gan Đối với tổn thương gan cấp tính, GCSF cải thiện tỷ lệ thời gian sống rõ rệt, số chức gan cải thiện Đối với bệnh nhân suy gan cấp tính cồn virus viêm gan có nguy tử vong vịng 28 ngày cao, việc điều trị GCSF giúp kéo dài Kỷ yếu khoa học thời gian sống cho bệnh nhân (Hu J H et al, 2013) Điều có ý nghĩa vô quan trọng điều trị bệnh gan việc cấy ghép gan phương pháp hiệu nhất, thiếu hụt nguồn nội tạng nên bệnh nhân suy gan cấp tính thường khơng cấy ghép kịp thời Việc kéo dài sống nhờ GCSF phương pháp hỗ trợ tốt, giúp tăng hội sống cho bệnh nhân Đến nay, chưa có cơng bố tác động GCSF bệnh lý ống mật hay mơ hình chuột tổn thương gan tắc mật Cho đến năm 2018, thí nghiệm lâm sàng việc điều trị GCSF bệnh nhân tắc mật sau phẫu thuật phương pháp Kasai thực nhiên giai đoạn đầu việc thu nhận kết VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mô hình chuột thắt ống dẫn mật Chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino), giới tính đực, 7-8 tuần tuổi (cân nặng 25-30 gam), mua từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh ni hệ thống chuồng với chu kỳ 12 sáng-tối Mơ hình tạo phương pháp phẫu thuật thắt ống mật (BDL) nhằm mô lại tắc nghẽn củ bệnh lý ống mật Các thao tác thí nghiệm động vật chấp thuận Hội đồng Y đức Viện Tế bào Gốc Liệu trình tiêm GCSF GCSF từ sản phẩm thương mại Neupogen (Filgrastim) tiêm da với liều lượng 61.5 ug/Kg/ngày, ngày liên tục từ thời điểm ngày sau BDL Đánh giá sinh hóa Máu thu từ tĩnh mạch cảnh chuột ly tâm thu nhận huyết tương vào thời điểm ngày 19 26 sau BDL Định lượng nồng độ Alanine transaminase (ALT) Aspartate Transaminase (AST) 137 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học huyết tương kit IFCC od.liquiUV ngày 26 sau BDL sử dụng cho việc test (HUMAN – Đức) Định lượng đánh giá mức độ biểu gen gen Albumin huyết tương kit đo liên quan đến viêm xơ hóa gan albumin (Hãng Bioassay Systems, Mỹ) đánh giá phương pháp PCR phiên mã ngược (qRT – PCR) Với Đánh giá mức độ biểu gen Mô gan thu nhận vào ngày 19 cặp mồi sử dụng bảng Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng đề tài Nhiệt Gen Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngược (5’-3’) độ bắt cặp mồi TGACGTCACTGGAGT GGTTCATGTCATGGA TGF β1 600C TGTACGG TGGTGC ACTCCTTAGTCCTCG TGGTTTCTTGTGACCC IL-1β GCCA TGAGC GCATCCACGAAACCA CACGAGTAACAAATC α – SMA CCTA AAAGC Procolla CCTGGACGCCATCAA CCAAGTTCCGGTGTG gen type GGTCTAC ACTCG I α1 620C CGTGTCTGGAGATTC TGGAAGATGTCGTGT MMP9 GACTTGA GAG GCATCTCTGGCATCT GCGGTTCTGGGACTT TIMP1 GGCATC GTGGGC AAGTTGTCATGGATG TCACCATCTTCCAGG GAPDH ACC AGC Đánh giá mơ học Hình thái mơ học gan đánh giá vào ngày 19 ngày 26 sau BDL Mô gan sau thu nhận cố định paraformadehide 4% cắt lát mô Đánh giá mức độ viêm mô hoại tử phương pháp nhuộm HE Đánh giá mức độ xơ hóa phương pháp nhuộm sirius red Hình ảnh ghi nhận phần mềm Axixovision với độ phóng đại 100 lần 10 cấu trúc tiểu thùy gan định lượng diện tích vùng xơ hóa phần mềm ImageJ Xử lý số liệu Kết xử lý thống kê phần mềm Prism với phương pháp thống kê: Student’s T test one-way ANOVA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết sinh hóa ALT AST hai enzyme nội bào tế bào gan, điều kiện bệnh lý dẫn đến chết tế bào gan hai enzyme giải phóng ngồi làm tăng nồng độ chúng huyết tương Kết định lượng cho thấy khơng có khác biệt hai nhóm, điều đồng nghĩa với việc tổn thương gan tương tự nhóm điều trị khơng điều trị ALB sản phẩm tạo tế bào gan nồng độ ALB cho biết chức hoạt động gan Kết nồng độ ALB huyết tương cho thấy khác biệt rõ rệt vào ngày 19 sau BDL, nồng độ ALB huyết tương nhóm BDL+GCSF nhóm BDL+PBS với p