BÁO CÁO MÔN HỌC CÔNG NGHỆ ENZYM VÀ PROTEIN ĐỀ TÀI ENZYM BIOSENSOR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÁO CÁO MÔN HỌC: CÔNG NGHỆ ENZYM VÀ PROTEIN ĐỀ TÀI: ENZYM BIOSENSOR GV:Th.S LÊ VĂN HUẤN NHÓM: Nguyễn Thị Thanh Thảo: 17070018 Mã Nữ Si Ty: 17070027 BÌNH DƯƠNG 2019_2020 MỤC LỤC GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR 1.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR 1.2 KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR 1.3 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR 1.4 PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ XÚC TÁC PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSOR 2.1 CHỌN LỰA BỘ THỤ CẢM SINH HỌC (Bioreceptor) 2.2 CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG 2.3 SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR ĐO NHỊP TIM VÀ HÀM LƯỢNG OXY TRONG MÁU SỬ DỤNG BIOSENSOR GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh khái niệm điện cực sinh học (Biosensor) có cơng bố điện cực Oxy Dựa kinh nghiệm tâm huyết mình, ơng phát triển lĩnh vực phân tích giúp đo lường thể Năm 1962, Hội nghị Khoa học Viện hàn lâm New York, ơng có diễn thuyết: “Làm để điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thơng minh hơn” Trong đó, ơng trình bày cách làm điện cực điện hóa thơng minh cách thêm enzym vào máy chuyển đổi bánh sandwich bao bọc lớp màng Năm 1975, ý tưởng Clark trở thành thực với công bố công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) máy phân tích glucose dựa việc đo dịng điện hydro peroxide Đây lần phịng thí nghiệm giới phân tích dựa Biosensor Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm bước Divis đề xuất vi khuẩn dùng yếu tố sinh học điện cực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser – LA640) sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan để chuyển electron từ lactatdehydrogenase tới điện cực Mặc dù không thành công thương trường bước đột phá quan trọng cho hệ Biosensor ứng dụng thể thao chẩn đoán lâm sàng Năm 1987, điện cực enzym screen-printed công bố Medisense (Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước bút cho phép giám sát lượng glucose máu nhà Điện cực thiết kế lại làm cho thông dụng số lượng bán Medisense đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 họ Abbort mua lại Hiện Hãng Boehringer, Manheim Bayer cạnh tranh gay gắt Biosensor lượng bán ba công ty chiếm ưu thị trường Biosensor giới tới 85% 1.2 KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR Biosensor thực chất thiết bị phân tích chuyển tín hiệu sinh học thành tín hiệu điện.Đầu tiên, Biosensor nhận dạng tượng biên dịch thành đặc tính định lượng được, sau đặc tính định lượng chuyển đổi thành tín hiệu điện biến Trong Biosensor, tượng nhận dạng hệ thống sinh học gọi quan thụ cảm sinh học (bioreceptor) Hệ thống tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây phản ứng tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor.Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt chất phân tích Sơ đồ cấu tạo biosensor 1.3 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR Các chất cần phân tích mẫu phân tích vào điện cực.Màng (external membrane) biosensor cho chất cần phân tích thấm qua Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, quan) phản ứng với chất cần phân tích tạo đáp ứng mà biến (transducer) phát Các thành phần sinh học thực hoạt động sau: Biến đổi chất cần phân tích thành chất hóa học khác thơng qua phản ứng sinh hóa (biểu diễn vịng trịn rỗng sơ đồ) Giải phóng sản phẩm hóa học từ tạo tác nhân kích thích Thay đổi đặc tính quang học, điện học, học Tạo số đáp ứng khác với lượng đo Cịn có số màng khác gần phận transducer, màng có đặc tính thấm khác so với màng bên ngồi.Tín hiệu điện cực thường phụ thuộc vào loại biến mà sử dụng 6 Hình 1: Nguyên lý hoạt động chung Biosensor: - Chất cần phân tích - Tác nhân kích thích (chất tạo tín hiệu) 1.4 PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ XÚC TÁC Phân loại: Trên thực tế có vơ vàn loại cảm biến khác chia cảm biến thành hai nhóm chính: Cảm biến vật lí: kể đến vài ví dụ dễ hình dung sóng điện từ, ánh sáng, hồng ngoại, tia X, hạt xạ, nhiệt độ, áp suất, âm thanh, từ trường, gia tốc,… Cảm biến hóa học: thường thấy độ ẩm, độ PH, ion, khói,… Ngồi ta có số hình thức phân chia khác Cảm biến chủ động bị động Cảm biến chủ động: không sử dụng điện bổ sung để chuyển sang tín hiệu điện Điển hình cảm biến áp điện làm vật liệu gốm, chuyển áp suất thành điện tích bề mặt Cảm biến bị động có sử dụng điện bổ sung để chuyển sang tín hiệu điện Điển hình photodiode có ánh sáng chiếu vào có thay đổi điện trở tiếp giáp bán dẫn p-n phân cực ngược Phân loại theo nguyên lí hoạt động Theo nguyên lí hoạt động ta kể đến loại cảm biến bật như: Cảm biến điện trở: hoạt động dựa theo di chuyển chạy góc quay biến trở, thay đổi điện trở co giãn vật dẫn 7 Cảm biến cảm ứng: cảm biến biến áp vi phân, cảm biến cảm ứng điện từ, cảm biến dịng xốy, cảm biến cảm ứng điện động, cảm biến điện dung,… Cảm biến điện trường: cảm biến từ giảo, cảm biến áp điện,… Và số cảm biến bật khác như: cảm biến quang, cảm biến huỳnh quang nhấp nháy, cảm biến điện hóa đầu dò ion độ pH, cảm biến nhiệt độ,… CƠ CHẾ XÚC TÁC: Đặc hiệu tương đối : enzym có tác dụng lên kiểu nối hóa học định phân tử chất mà không phụ thuộc vào chất hóa học cấu tử tham gia tạo thành liên kết Đặc hiệu nhóm: Enzym có khả tác dụng lên kiểu liên kết định hay hai cấu tử tham gia tạo thành liên kết có cấu tạo định PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSOR Việc chế tạo Biosensor bao gồm ba bước: Chọn lựa thụ cảm sinh học Chọn lựa biến Cố định thành phần sinh học lên biến 2.1 CHỌN LỰA BỘ THỤ CẢM SINH HỌC (Bioreceptor): Bộ thụ cảm sinh học đóng vai trị thiết bị nhận dạng sinh học.Khi có mặt chất cần kiểm tra, thụ cảm sinh học phải tạo hiệu ứng hóa lý có khả phát biến năng.Điều liên quan nhiều trình chẳng hạn xúc tác sinh học, cặp đơi miễn dịch hay nhận cảm hóa học 2.1.1Enzym: Chất xúc tác sinh học thường sử dụng enzym có sẵn thị trường, chẳng hạn glucose oxidase (enzym oxy hóa glucose) urease (Enzym thủy phân ure) Các enzym thu nhận từ nhiều nguồn sinh học khác sử dụng hay kết hợp với cofactor chúng NAD+ NADP+ Sự sử dụng enzym thương mại có nhiều thuận lợi chẳng hạn khả sản xuất hàng loạt với đặc điểm, thời gian sống biết trước sẵn có.Vì enzym thương mại đóng vai trị quan trọng Biosensor có mặt thị trường Nhưng bên cạnh chúng có bất lợi bền hoạt động cần có cofactor kết hợp, đồng thời enzym đơn lẻ khơng xúc tác hồn tồn cho chuỗi phản ứng, biosensor thường kết hợp nhiều enzym với theo trình tự hợp lý để đảm bảo hoạt động tối ưu Biosensor 8 2.1.2 Vi sinh vật: Cơ thể vi sinh vật có đầy đủ enzym cofactor cần thiết mơi trường tối ưu hóa Trong mơi trường thích hợp, Vi sinh vật sản sinh đền bù mát hoạt tính Enzym theo thời gian 2.1.3 Mơ quan: Có thể tận dụng phần mơ thực vật hay mô động vật làm nguồn nguyên liệu cung cấp enzym chúng có khả gắn kết cao, có cấu trúc đủ mạnh để gắn kết trực tiếp lên biến mà không cần đến kỹ thuật cố định protein Mô thực vật – động vật: Thực vật nguồn enzym hữu dụng cho hóa học phân tích.Bằng việc sử dụng biến thích hợp, chế tạo Biosensor có tính ổn định cao enzym trì hoạt tính mô thực vật.Tương tự vậy, mô động vật xem thụ cảm sinh học hữu dụng cho phát chọn lọc L-amiono acid mà không bị ảnh hưởng đáng kể D-amino acid.Để tăng khả chọn lọc kết hợp chất kháng khuẩn để tránh nhiễm khuẩn, chẳng hạn thêm 0.02% NaOH vào điện cực glutamine Bộ phận quan: Các xúc tác sinh học tìm thấy quan tế bào lysosome, lục lạp, thể hạt vi thể chúng chứa nhiều hệ thống enzym dùng biosensor Chẳng hạn vi thể gan có hệ thống enzym monooxidase với cytochrome P 450 xúc tác cho phản ứng oxy hoá nhiều acid béo, hormone steroids… Các quan tế bào gắn trực tiếp lên biến đo dòng điện thiết bị Biosensor 2.1.4 Tác nhân miễn dịch: Kháng nguyên kháng thể sử dụng làm thụ cảm sinh học Tính chọn lọc Biosensor định kháng thể tính nhạy cảm định enzym kết hợp Kháng thể cố định vào biến nhờ vào kỹ thuật Miễn dịch học Enzym (EIA).Hoặc thay enzym chất mang ion đóng vai trị chất trung gian q trình điện hóa miễn dịch.Kháng ngun thích hợp với kháng thể kết hợp với chất mang ion tạo tiếp hợp phát biến điện hóa 2.1.5 Bộ thụ cảm hóa học: Màng tế bào sử dụng khả kích thích hóa học gây thay đổi cấu tạo Các tế bào thần kinh dùng phát thuốc, độc tố hay chất khác 9 2.2 CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG: Bảng 3.1: Hiện trạng nghiên cứu Biosensor với biến tương ứng: Bộ biến Enzym Đo dịng Tế bào điện Đo điện điện hóa Bán dẫn (IFET) Đo nhiệt (Thermistor) Đo quang (sợi quang Tế bào, vi Biosensor Tác nhân Mô thực vật- sinh vật miễn dịch động vật xxx xx xx x xxx xx xx x xx x x x x học) Ap điện x Cơ hóa học x Chú thích: x: Đang nghiên cứu Bộ thụ cảm hóa học x x x xx: Đã nghiên cứu phát triển mẫu xxx: Những thiết bị có mặt thị trường Phụ thuộc vào kiểu phản ứng ứng dụng cụ thể Biosensor mà chọn biến phù hợp Nếu dùng sinh học cần phải đáp ứng tiêu chuẩn tương ứng khả tách protein, lipid hay tế bào Nếu dùng invivo cần phải giảm kích thước tối thiểu địi hỏi hình dạng phải phù hợp để khơng phá huỷ mơ thực vật-động vật, đồng thời có khả loại bỏ độc tố, kim loại thành phần đa phân tử khỏi biến Vấn đề tác động hóa học ảnh hưởng đến chọn lựa biến Có thể kết hợp enzym urese vào điện cực pH, pCO 2, hay pNH3 Bộ biến tốt cho việc xác định ure mẫu sinh học điện cực pCO 2, pNH3 chúng có màng thẩm thấu để loại bỏ tất ảnh hưởng cation anion 2.3 SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG: Việc cố định thành tố sinh học, enzym thường đem lại nhiều lợi nhuận việc ứng như: Làm cho enzym nhiều trường hợp bền Tách phức enzym – chất mang khỏi mẫu dễ dàng 10 Hoạt độ enzym giữ ổn định thời gian dài Tuy nhiên, việc sử dụng enzym cố định có hạn chế định như: Sự chuyển khối bị hạn chế Có thể hoạt tính cố định Khơng có hiệu chất rắn Mất tính thích nghi hình thể Nhưng hạn chế không đáng kể so với lợi ích mà enzym cố định mang lại Do ngày có nhiều nghiên cứu công nghệ để cố định enzym Người ta thường cố định thành phần sinh học lên chất mang rắn nhiều cách Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo yêu cầu định, điện cực sinh học (biosensor) đưa vào sử dụng thực tế: Các cấu tử sinh học phải giữ hoạt độ gắn bề mặt biosensor Màng sinh học phải gắn chặt với bề mặt cảm biến giữ cấu trúc chức Màng sinh học cố định phải ổn định bền thời gian dài Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng cấu tử sinh học Để cố định thành phần sinh học Biosensor, người ta thường sử dụng kỹ thuật hấp thụ vật lý, bao gói khn gel polymer, liên kết đồng hóa trị với chất mang liên kết chéo protein Hình 3.1: Một số phương pháp cố định thường dùng điện cực sinh học 2.3.1 Sự cố định Enzym: a Sự cố định hấp thụ vật lý: 11 Điện cực Enzym chế tạo Updike Hicks cách cố định Enzym Glucose oxidase lớp gel polyacrylamide, sau Enzym gắn lên màng Plastic điện cực oxy Hoặc cố định enzym lên thành phần nhạy cảm điện cực màng thẩm thấu ngăn cản khuếch tán protein Guibault Shu chế tạo điện cực enzym nhạy cảm với ure cách trải dung dịch huyền phù enzym urease lên bề mặt điện cực có màng nilon bao bọc khít hồn tồn màng thẩm thấu, sau điện cực enzym rửa với nước sẵn sàng để sử dụng Nguyên tắc phương pháp hấp phụ vật lý sau: Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu chất mang protein lực Valderwaalls, liên kết hydro liên kết kỵ nước Khi chất mang lỗ xốp, enzym bám bề mặt chất mang Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào lỗ xốp chất mang Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết chất mang enzym liên kết ion (Liên kết bền so với hấp phụ) Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym phương pháp hấp phụ hay liên kết ion: Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide kim loại Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl Phương pháp điều chế: Cho enzym chất mang tiếp xúc với (khuấy trộn), sau rửa để loại bỏ phân tử bị gắn yếu lên chất mang Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định độ bền liên kết cố định: Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với nồng độ giới hạn định pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng chất nhóm tích điện chất mang protein enzym Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định liên kết ion Đồng thời thay đổi pH đột ngột thường dẫn đến nhả hấp phụ enzym Lực ion mơi trường: có mặt muối tích điện trái dấu với chất mang kéo theo kết tủa cục protein dung dịch Tuy nhiên, có mặt 12 muối làm tăng độ hịa tan protein ảnh hưởng xấu đến hiệu cố định Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, làm hoạt tính enzym Khối lượng phân tử chất chất mang: enzym có khối lượng phân tử nhỏ hấp phụ cao Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt bền Tuy nhiên cố định vật lý ngày sử dụng có mặt enzym dung dịch khơng giữ hoạt tính thời gian dài Do cố định hóa học, sử dụng liên kết đồng hóa trị đảm bảo độ bền enzym thời gian dài b Sự cố định liên kết ngang (cross – linking immobilization): Sự tạo liên kết ngang trình sử dụng tác nhân đa chức để tạo cầu nối nhóm xúc tác sinh học khác hay protein khác để tạo hợp chất có trọng lượng phân tử lớn nhiều khơng có tính hịa tan Có thể tạo liên kết ngang phân tử enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với (enzym với enzym hay enzym với protein nhiều enzym protein mang chẳng hạn albumin huyết bò (BSA) Ngay quan hay tế bào kết dính việc tạo liên kết ngang Glutaraldehyde tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng Tác nhân có hai nhóm chức aldehyde đầu mạch phản ứng với nhóm amine phân tử protein hay enzym tạo hợp chất mang tính base: Cũng thay Glutaraldehyde tác nhân hai chức khác hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang Có phương pháp để cố định enzym liên kết ngang: Phương pháp ngâm (Immersion method) Ứng dụng: Phương pháp ngâm dùng để cố định enzym urease lên điện cực thủy tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với cation hóa trị I 13 Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hòa tan 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8 Thêm vào ml dung dịch albumine huyết bị 17.5%, sau thêm 0.07 ml dung dịch glutaraldehyde 25% để thu nồng độ cuối 0.8% Khuấy dung dịch phút Chuẩn bị bề mặt hoạt động: Đầu tiên điện cực cation rửa nước cất, sau lau khơ giấy lọc Nhúng ngập bầu điện cực dung dịch cố định trên, xoay điện cực nhẹ nhàng xung quanh trục điện cực 15 phút để tạo lớp dung dịch cố định đồng nhất.Một vòng “O” gắn khít vào để giữ cho màng enzym bám chặt lên bầu điện cực.Sau rửa điện cực nước cất, dung dịch glycine, cuối nước cất để tách rửa hay trung hòa tác nhân tạo liên kết ngang Hình 3: Nguyên tắc phương pháp ngâm Ưu điểm: Phương pháp thực đơn giản, thích hợp cho việc cố định Enzym lên đa số biến năng, đặc biệt biến nhỏ Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method): Nguyên tắc: Nhỏ 10 ml dung dịch chứa enzym lên đỉnh điện cực, sau nhỏ 10ml dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde Phương pháp dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước điện cực cảm ứng khí màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene 14 Hình 3.3: Phương pháp kết hợp trực tiếp Ưu điểm: Tiết kiệm enzym, dùng để cố định enzym có giá thành cao Phương pháp sử dụng bình phun (Use of aerosol): Nguyên tắc: đầu nhạy cảm điện cực rửa ngâm dung dịch enzym khoảng 20 phút để đảm bảo hấp thu enzym lên điện cực enzym Điện cực sau sấy khơ 4oC xoay.Glutaraldehyde bơm lên điện cực từ khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt Sau tạo liên kết ngang, điện cực enzym rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng Ưu điểm: bề dày lớp enzym mỏng (1-2mm) biosensor tạo có thời gian đáp ứng cực ngắn (5-10s) Ứng dụng: Phương pháp dùng để cố định enzym pennicilinase, urease acetylcholinesterase, cố định protein lên nhiều chất mang Hình 3.4: Phương pháp sử dụng bình phun Sử dụng màng membrane: Các màng membrane tăng cường-gia cố (Re-inforced membranes): Enzym cố định lên diện tích rộng màng nylon dĩa nhỏ chứa membrane enzym có mẻ cố định giống Sau màng kẹp vào biến 15 Màng membran tăng cường-gia cố có phần sợi cải thiện tính chất học màng enzym Các màng membrane gắn nhóm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng màng membrane xốp sẵn có thị trường Những màng có nhóm chức liên kết có khả phản ứng với vị trí tự enzym Các màng sau đem ngâm dung dịch chứa enzym chọn để thu màng enzym với tính chất học hữu dụng Sự cố định cofactor: Cofactor cố định lên chất mang đồng thời lúc với enzym phương pháp hấp thụ vật lý, hay liên kết ngang 2.3.2 Cố định Vi sinh vật Vi sinh vật có kích thước lớn enzym dễ dàng cố định phương pháp vật lý Chúng cố định gel agar hay polyacrylamide màng thẩm thấu màng lọc membrane millipore 0.22 mm – chế tạo từ ester cellulosic Toàn tế bào vi sinh vật cố định huyền phù collagen xử lý glutaraldehyde Màng collagen sử dụng chất mang vật lý Màng kỵ nước vi sinh vật gắn đồng thời lên điện cực khuếch tán khí chẳng hạn điện cực pNH3, pO2, pCO2 Vi sinh vật nhốt lỗ màng lọc cellulose acetate, sau rửa tế bào vi sinh vật tự bề mặt đặt màng vi sinh vật vào điện cực dùng màng thẩm thấu ngâm dung dịch đệm để loại bỏ thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo Các điện cực vi sinh vật bảo quản nhiệt độ 40C dung dịch đệm phosphate Hình 3.5: Điện cực vi khuẩn đo dịng điện 16 Cũng cố định enzym tế bào vi sinh vật lên biến Vi sinh vât cố định phương pháp vật lý enzym cố định phương pháp liên kết đồng hóa trị để tránh nhả protein Vi khuẩn acetic thuộc lồi Acetobacter xylinum có khả tạo màng mỏng môi trường tĩnh sau xử lý với glutaraldehyde có tính chất học định cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà không cần dùng màng thẩm thấu 2.3.3 Cố định tác nhân miễn dịch: Nhiều điện cực miễn dịch tạo cố định tác nhân miễn dịch lên biến khác a) Cố định kháng thể (Immobillization of antibodies): Mục đích: Để phát kháng nguyên tương ứng tạo kháng thể Do kháng thể có cấu trúc protein nên phương pháp cố định kháng thể tương tự phương pháp cố định enzym: dùng phương pháp cố định trực tiếp hay sử dụng màng membrane Cố định trực tiếp lên biến năng: Các kháng thể gắn lên điện cực carbon liên kết cộng hóa trị.Các nhóm COOH tạo điện cực carbon phản ứng điện hóa mơi trường acid nitric HNO3 kali bicromat K2Cr2O7 gắn với kháng thể tác nhân tạo liên kết ngang carbodiimide Hoặc cố định phương pháp hấp phụ kháng thể lên lớp kim loại vàng hay bạc lắng thủy tinh Sau dùng phương pháp dò cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt Sự cố định màng membrane: Các kháng thể cố định lên màng membrane theo trình tự sau: màng bromo-acetylcellulose ngâm dung dịch chứa hexamethylene diamine, sau ngâm dung dịch diepoxy butadiene, dung dịch tạo nhóm phản ứng với kháng thể, cuối màng với kháng thể đuợc cố định rửa với dung dịch ethanolamine để loại bỏ nhóm epoxy khơng phản ứng Kháng thể cố định mạng nylon hấp thụ vật lý màng collagen polyvinylbutyral, sau lắp vào điện cực ISFET.Màng hoạt hóa với glutaraldehyde trước kết hợp với kháng thể.Các kháng thể cố định lên sợi quang học b) Sự cố định kháng nguyên: Kháng nguyên hợp chất bao gồm protein, hydratcarbon,…chúng cố định cách khác nhau, không kháng thể enzym Yếu tố định tính kháng 17 ngun dinitrophenol (DNP) kết hợp với chất mang ion dibenzo-18crown-6 (DB18C6) sau cố định màng polymer.Đầu tiên, ether chuyển thành dẫn xuất dạng trans-dinitro sau thành dẫn xuất arylaminey thích hợp cho việc kết hợp với fluorodinitrobenzene Phức hợp hòa tan tetrahydrosulfan thêm dibutylsebacate, sau kết hợp phức hợp màng polyvinylchloride (PVC) Cuối màng kháng nguyên chia thành đĩa nhỏ gắn lên đỉnh điện cực.Các biosensor tạo nhạy cảm trực tiếp với kháng thể Tuy nhiên, điện cực tạo cách có nhược điểm DNP có lực ion K+ dung dịch chất điện phân bên điện cực, cho kết khơng xác Để hạn chế điều này, điện cực rắn với nhựa epoxy nhồi đá granite chế tạo Đầu tiên, người ta đổ nhựa thông vào bên ống PVC chứa dĩa Pt đường kính với ống, sau đổ dung dịch tetrahydrofuran, 10 mg/ml DNP-kháng nguyên 15% triocyl acetate vào lỗ khoan nhựa thơng Hình 3.6: Sự cố định kháng thể lên màng membrane bromo-acetylcellulose 18 Hình 3.7: Điện cực kháng nguyên dùng PVC rắn với DNP c) Sự gắn enzym: Khi tác nhân miễn dịch cố định lên biến hay lên màng membrane kết hợp miễn dịch kháng nguyên kháng thể xảy khó phát biến năng, thơng thường phản ứng miễn dịch dị bổ sung vào enzym để xúc tác trình phản ứng Kháng nguyên hay kháng thể gắn với enzym sử dụng kỹ thuật EIA (miễn dịch enzym) hay ELISA Enzym gắn với tác nhân miễn dịch tác nhân tạo liên kết ngang hai chức glutaraldehyde Tuỳ thuộc vào loại biến mà gắn kháng nguyên hay kháng thể với enzym cho phù hợp: Nếu sử dụng biến điện cực pO kháng nguyên gắn với enzym glucose oxidase catalase Khi biến điện cực pNH 3kháng nguyên gắn với enzym urease 2.3.4 Cố định mô, quan chemoreceptor: a) Cơ quan mô thực vật – động vật: Đầu tiên, lát mô thực vật hay động vật cắt ra, chèn vào hai màng bán thấm gắn chúng lên biến Thường dùng điện cực pO 2, pCO2, hay pNH3 Mơ động vật gan bị, gan thỏ, bắp thịt thỏ hay ruột, hay thành phần tế bào Các quan gắn vào biến làm cho Biosensor chọn lọc chúng chứa enzym đặc biệt Biosensor gắn mô thực vật – động vật nhìn chung có thời gian đáp ứng dài Biosensor gắn enzym Thời gian đáp ứng nhanh Biosensor đạt gắn mô bột than dạng paste nhằm tạo tiếp xúc lớn chất xúc tác sinh học thành phần cảm ứng: Cắt lát mơ nhồi vào hồ vữa, sau trộn với dầu khống bột than chì để tạo hỗn hợp nhão cuối trải lên đầu điện cực b) Chemoreceptor: 19 Receptor râu nhỏ lồi cua xanh Callinectes sapidus có sợi thần kinh sử dụng biến để truyền dẫn xung động thần kinh gây khứu giác hay vị giác, chúng cố định trực tiếp vào điện cực dò Pt điện cực đo điện Điện cực so sánh Ag/AgCl nhúng vào dung dịch muối, tạo chênh lệch điện so với điện cực dò Bằng việc dùng liều tác nhân kích thích khác vào dịng chất mang gây thay đổi cấu tạo receptor kết tạo thay đổi khả thấm màng kích thích hay thay đổi hoạt tính enzym gắn lên màng Sự phân cực sợi trục axon làm tăng điện đo Biosensor dựa receptor thần kinh dùng để phát độc tố hay chất độc hóa học sử dụng chiến tranh Sử dụng receptor acetylcholine xác định acetylcholine cách dò trở kháng đặc trưng so với truyền thần kinh khác, receptor gắn enzym acetylcholinesterase nhạy cảm với hợp chất phosphor hữu carbamate, receptor cố định lên biến thích hợp cách ngâm đầu nhạy cảm điện cực vào dung dịch liposome chứa receptor Ứng dụng biosensor ĐO NHỊP TIM VÀ HÀM LƯỢNG OXY TRONG MÁU SỬ DỤNG BIOSENSOR 1.1 Các phương pháp phổ biến đo nhịp tim thể người Có nhiều phương pháp để đo xác định nhịp tim khác ngồi nước Nhìn chung phương pháp đo giống nhau, khác hình thức đo chia làm ba phương pháp là:thủ công, xâm lấn, không xâm lấn Phương pháp 1: Phương pháp thủ cơng Đo nhịp tim nhấn ngón tay: Sử dụng măt ngón tay áp sát vào mặt cổ tay bên - chỗ có nếp gấp cổ tay (hai tay ngược nhau) Bấm nhẹ vào cảm thấy nhịp đập Nếu cần thiết, di chuyển ngón tay xung quanh bạn cảm thấy nhịp đập Sau dùng đồng hồ để xác định số nhịp tim Hoặc đặt ngón tay vào bên cổ nơi giao khí quản lớn cổ Bấm nhẹ bạn cảm thấy nhịp đập 20 Hình 1: Cách đo thủ cơng tay Đo nhịp tim dùng ống nghe: đeo tai nghe kiểm tra ống nghe, mùa đông cần xoa làm ấm loa nghe trước nghe Đặt ống nghe lên vị trí nghe tim, lần đặt ống nghe 10 -20 giây Sau dùng đồng hồ để xác định số nhịp tim Hình 2: Đo thủ cơng ống nghe > Nhận xét: phương pháp phổ biến ,đơn giản, dễ đo Chi phí đo khơng đáng kể Kết đo có độ xác phụ thuộc vào người đo, có sai sót chênh lệch thời gian đếm người đo đồng hồ đếm thời gian Tốn nhiều thời gian, công sức để đo Phương pháp 2: Phương pháp xâm lấn Sử dụng điện cực để đo nhịp tim khoảng thời gian, dòng điện từ nguồn qua điện cực vào thể phản hồi lại thông tin nhịp tim Trước đo phải cần lưu ý vấn đề: không ăn uống, không sử dụng loại phấn, dầu hay mỹ phẩm vùng ngực Các điện cực gắn lên vùng ngực cồn khử trùng, dùng dán cố định dây điện cực, dụng cụ khởi động đo liên tục từ 24-48 tiếng, liệu lưu trữ vào nhớ 21 >Nhận xét: phương pháp có độ xác cao, sử dụng nhiều bệnh viện, trung tâm khám sức khỏe, đo nhiều thông số khoảng thời gian Nhưng gây tác dụng phụ dị ứng da tiếp xúc dòng điện cực hay chất để dán cố định , gây cảm giác khó chịu Vì thiết bị đại nên sai số trung bình thiết bị đo 1% chi phí trung bình lần đo 150 USD Hình 3: Đo điện cực Phương pháp 3: Phương pháp không xâm lấn Khi tim đập, máu dồn khắp thể qua động mạch, tạo thay đổi áp suất thành động mạch lượng máu chảy qua động mạch Vì ta đo nhịp tim cách đo thay đổi Khi lượng máu thành động mạch thay đổi làm thay đổi mức hấp thụ ánh sáng động mạch, tia sáng truyền qua động mạch cường độ ánh sáng sau truyền qua biến thiên đồng với nhịp tim Khi nhịp tim giãn ra, lượng máu qua động mạch nhỏ nên hấp thụ ánh sáng, ánh sáng sau truyền qua động mạch có cường độ lớn, ngược lại tim co vào, lượng máu qua động mạch lớn hơn, ánh sáng sau truyền qua động mạch có cường độ nhỏ hơn.Ánh sáng sau truyền qua ngón tay gồm hai thành phần AC DC + Thành phần DC đặc trưng cho cường độ ánh sáng cố định truyền qua mô, xương tĩnh mạch + Thành phần AC đặc trưng cho cường độ ánh sáng thay đổi lượng máu thay đổi truyền qua động mạch, tần số tín hiệu đồng với tần số nhịp tim > Nhận xét: có độ xác cao, đơn giản, dễ sử dụng, thiết bị gọn nhẹ, sử dụng thoải mái, khơng gây khó chịu, thời gian đo nhanh Các phương pháp quang học có đánh giá sai số 15% chi phí trung bình 20USD 22 So sánh phương pháp :Phương pháp không sử dụng biosensor dẫn tới độ sai lệch cao Phương pháp sử dụng biosensor nên có độ xác cao thuận lợi cho việc chuẩn đoán 4.Các loại thiết bị đo nhịp tim có sử dụng biosensor Hình 4: Thiết bị đo nhịp tim Hình 5:Thiết bị đo nhịp tim tích hợp thiết bị đeo tay đồng hồ KẾT LUẬN 23 Biosensor phát triển vượt bậc nhanh chóng suốt nhiều năm qua Nhờ vào phương pháp kết hợp thụ cảm với nhiều biến Đặc điểm, tính chất biosensor cải thiện tính xác thực ngày cao tạo nhiều ứng dụng Ứng dụng Biosensor lĩnh vực y khoa (chăm sóc sức khỏe bệnh nhân).Biosensor đặc biệt thích hợp cho phân tích mẫu môi trường sinh học phức tạp mà không cần tác nhân phản ứng hóa học.Biosensor dùng in-vivo tạo tín hiệu liên tục, điều khiển nồng độ chất tạo thành trình trao đổi chất thời gian định nên ứng dụng quan trọng kiểm soát nồng độ đường máu người bệnh Các ứng dụng Biosensor công nghệ thực phẩm phát triển.Đột phá quan trọng khả khử trùng q trình lên men.Biosensor đóng vai trị quan trọng kiểm soát trực tiếp chất lượng thực phẩm Mơi trường cần có kiểm sốt chất lượng liên tục mà kỹ thuật hóa lý giới hạn đặc biệt kiểm tra độ độc hại môi trường.Biosensor đời đáp ứng nhu cầu Nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện tính nhạy cảm tính chọn lọc biosensor.Nhiều cơng ty Nhật Bản phát triển sản xuất nhiều loại biosensor.Năm 2000, thị trường Biosensor thành lập tổ chức năm lần.Tại tập trung nghiên cứu phát triển biosensor nhiều lĩnh vực khác chuyên gia đầu ngành có giải thưởng trao tặng.Điều khẳng định phát triển nhanh chóng Biosensor TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TRAN MINH CANH, Biosensor, Chapman & Hall [2] TRAN MINH CANH, BROUN G., Construction and study of electrodes using cross – linked enzymes [3] http://thuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/16138/1/Nguyen-Van-Hai.pdf ... có tính hịa tan Có thể tạo liên kết ngang phân tử enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với (enzym với enzym hay enzym với protein nhiều enzym protein mang chẳng hạn albumin huyết bò (BSA) Ngay... làm tăng độ hịa tan protein ảnh hưởng xấu đến hiệu cố định Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, làm hoạt tính enzym Khối lượng phân... vào biến làm cho Biosensor chọn lọc chúng chứa enzym đặc biệt Biosensor gắn mơ thực vật – động vật nhìn chung có thời gian đáp ứng dài Biosensor gắn enzym Thời gian đáp ứng nhanh Biosensor đạt gắn