Thủy phân protein bằng enzyme là một trong những các phương pháp hiệu quả nhất để thu hồi protein và không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cuối cùng (Trần Kiều Anh cộng sự, 2017), sản phẩm dễ dàng được tinh sạch (Herpandi et al., 2011). Quá trình thủy phân sẽ cắt các phân tử có kích thước lớn thành các phân tử nhỏ hơn tạo điều kiện cho quá trình tiêu hóa được thực hiện dễ dàng. Độ nhớt dịch thủy phân càng thấp, kích thước phân tử càng nhỏ thì dịch thủy phân càng dễ hấp thụ. Các enzyme được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu thủy phân bằng enzyme là Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex, Kojizyme (Nguyen et al,. 2011). Protamex được biết đến là loại enzyme cho sản phẩm thủy phân ít đắng nhất và do đó đã được lựa chọn cho nghiên cứu này. Hiện nay, nhu cầu protein toàn cầu tăng cao cho thấy tầm quan trọng của protein đến sức khỏe con người (Boland et al., 2013). Đồng thời, các sản phẩm thủy phân từ protein đã được các nhà nghiên cứu quan tâm từ nhiều năm qua, vì các thành phần trong sản phẩm như acid amin tự do có giá trị dinh dưỡng và các peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học đáp ứng các chức năng sinh lý cho con người (Chalamaiah et al., 2012). Vì vậy, Trần Thị Bích Thủy Đỗ Thị Thanh Thủy (2006) cũng đã nghiên cứu ứng dụng enzyme Protamex để thủy phân cá trích thu hồi dịch đạm thủy phân; Đỗ Thị Thanh Thủy Nguyễn Anh Tuấn (2017) đã nghiên cứu chế độ thủy phân thu hồi dịch đạm thủy phân có chất lượng cao và có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực; Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá Ngừ Sọc Dưa (Sarda orientalis) với xúc tác của enzyme Protamex để thu dịch protein thủy phân của Bùi Xuân Đông, Ngô Thị Ngọc Bích Bùi Viết Cường (2018); Chun cộng sự (2006) đã nghiên cứu thủy phân cá Nục Sồ bằng enzyme Protamex; Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu ứng dụng enzyme Protamex để thủy phân phụ phẩm đầu cá lóc. Do vậy, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện thủy phân sản xuất dịch đạm từ đầu cá lóc (Chana striata) bằng enzyme Protamex” được thực hiện là cần thiết nhằm đưa ra được thông số kỹ thuật của quá trình tối ưu thu hồi protein có chất lượng tốt, nâng cao giá trị phụ phẩm sau chế biến, tránh lãng phí và giúp giảm ô nhiễm môi trường.Thủy phân protein bằng enzyme là một trong những các phương pháp hiệu quả nhất để thu hồi protein và không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cuối cùng (Trần Kiều Anh cộng sự, 2017), sản phẩm dễ dàng được tinh sạch (Herpandi et al., 2011). Quá trình thủy phân sẽ cắt các phân tử có kích thước lớn thành các phân tử nhỏ hơn tạo điều kiện cho quá trình tiêu hóa được thực hiện dễ dàng. Độ nhớt dịch thủy phân càng thấp, kích thước phân tử càng nhỏ thì dịch thủy phân càng dễ hấp thụ. Các enzyme được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu thủy phân bằng enzyme là Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex, Kojizyme (Nguyen et al,. 2011). Protamex được biết đến là loại enzyme cho sản phẩm thủy phân ít đắng nhất và do đó đã được lựa chọn cho nghiên cứu này. Hiện nay, nhu cầu protein toàn cầu tăng cao cho thấy tầm quan trọng của protein đến sức khỏe con người (Boland et al., 2013). Đồng thời, các sản phẩm thủy phân từ protein đã được các nhà nghiên cứu quan tâm từ nhiều năm qua, vì các thành phần trong sản phẩm như acid amin tự do có giá trị dinh dưỡng và các peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học đáp ứng các chức năng sinh lý cho con người (Chalamaiah et al., 2012). Vì vậy, Trần Thị Bích Thủy Đỗ Thị Thanh Thủy (2006) cũng đã nghiên cứu ứng dụng enzyme Protamex để thủy phân cá trích thu hồi dịch đạm thủy phân; Đỗ Thị Thanh Thủy Nguyễn Anh Tuấn (2017) đã nghiên cứu chế độ thủy phân thu hồi dịch đạm thủy phân có chất lượng cao và có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực; Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá Ngừ Sọc Dưa (Sarda orientalis) với xúc tác của enzyme Protamex để thu dịch protein thủy phân của Bùi Xuân Đông, Ngô Thị Ngọc Bích Bùi Viết Cường (2018); Chun cộng sự (2006) đã nghiên cứu thủy phân cá Nục Sồ bằng enzyme Protamex; Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu ứng dụng enzyme Protamex để thủy phân phụ phẩm đầu cá lóc. Do vậy, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện thủy phân sản xuất dịch đạm từ đầu cá lóc (Chana striata) bằng enzyme Protamex” được thực hiện là cần thiết nhằm đưa ra được thông số kỹ thuật của quá trình tối ưu thu hồi protein có chất lượng tốt, nâng cao giá trị phụ phẩm sau chế biến, tránh lãng phí và giúp giảm ô nhiễm môi trường.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ HUYỀN LINH TỐI ƯU HÓA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI ĐIỂM BỔ SUNG FLAVOURZYME THỦY PHÂN ĐẦU CÁ LÓC (Channa striata) SẢN XUẤT BỘT ĐẠM BẰNG ALCALASE VÀ FLAVOURZYME LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ HUYỀN LINH TỐI ƯU HÓA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI ĐIỂM BỔ SUNG FLAVOURZYME THỦY PHÂN ĐẦU CÁ LÓC (Channa striata) SẢN XUẤT BỘT ĐẠM BẰNG ALCALASE VÀ FLAVOURZYME LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS TRƯƠNG THỊ MỘNG THU 2021 TỐI ƯU HÓA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI ĐIỂM BỔ SUNG FLAVOURZYME THỦY PHÂN ĐẦU CÁ LÓC (Channa striata) SẢN XUẤT BỘT ĐẠM BẰNG ALCALASE VÀ FLAVOURZYME Trần Thị Huyền Linh Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ ABSTRACT The study was conducted to investigate optimal hydrolysis conditions from sneakehead fish (Chana striata) head by using flavourzyme, alcalase and making protein powder with hight quality The research included two experiment: (i) optimizing of hydrolysis condition, (ii) the effect of evaporating time on quality of concentrated protein hydrolysate The results showed that the optimal hydrolysis conditions for snakehead fish head were alcalase concentration (51.9U/g), concentration flavourzyme (107.1 U/g), hydrolysis time (31.5 hours), flavourzyme addition time (7.9 hours) gave high degree of hydrolysis (53.1%), amino acid content (14.4 g/L), protein recovery (66.1%) Concentrated protein hydrolysate had high amino acid of (1.36%) and protein contents (7.84%) when fish hydrolysate was evaporated for 30 minutes Keywords: Alcalase, flavourzyme, optimizing, snakehead fish head Title: Optimization concentration and flavourzyme addition time to produce protein powder by combining alcalase and flavourzyme TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm mục đích tối ưu hóa điều kiện thủy phân đầu cá lóc (Chana striata) enzyme flavourzyme, alcalase, đồng thời sản xuất bột đạm có chất lượng tốt Nội dung nghiên cứu bao gồm thí nghiệm: (i) tối ưu hóa điều kiện thủy phân, (ii) ảnh hưởng thời gian cô quay đến chất lượng dịch đạm cô đặc Kết cho thấy điều kiện thủy phân tối ưu với nồng độ alcalase (51,9 U/g), nồng độ flavourzyme (107,1U/g), thời gian thủy phân (31,5 giờ), thời điểm bổ sung flavourzyme (7,9 giờ) cho dịch đạm thủy phân có hiệu suất thủy phân đạt 53,1%, hàm lượng đạm acid amin 14,4 g/L hiệu suất thu hồi protein 66,1% Dịch đạm đặc có hàm lượng đạm acid amin cao 1,36% protein 7,84% cô quay dịch thủy phân 30 phút Từ khóa: Alcalase, đầu lóc, flavourzyme, tối ưu hóa 1 GIỚI THIỆU Cá lóc đối tượng dễ nuôi nên nuôi nhiều tỉnh đồng sơng Cửu Long, diện tích sản lượng cá lóc ni ngày tăng mạnh (Đỗ Minh Chung & Lê Xuân Sinh, 2011) Việc phát triển mạnh mẽ nghề ni cá lóc thúc đẩy u cầu cấp thiết phát triển sản phẩm chế biến từ cá lóc khơ, mắm, chà bơng chả tăng, dẫn đến việc loại bỏ lượng lớn phụ phẩm lóc bán với giá thấp trực tiếp sở sản xuất khô, chợ (Trần Thanh Trúc & Nguyễn Văn Mười, 2019) Theo Ung Minh Anh Thư (2018) phụ phẩm bị loại bỏ gồm đầu, xương, vây, đuôi, da ruột chứa hàm lượng protein cao 13,85% Do đó, tận dụng nguồn phụ phẩm để sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng, giúp giảm ô nhiễm môi trường phụ phẩm cá thải vấn đề cần thiết Trong việc sản xuất bột đạm, dịch đạm phương pháp thủy phân protein sử dụng protease phương pháp hiệu Có nhiều enzyme khác dùng để thủy phân protein papain, alcalase, protamex, flavourzyme, neutrase (Aspmo et al., 2005) Hơn nửa, tối ưu hóa q trình thủy phân protein phương pháp hợp lí tiết kiệm thời gian mà lại cho hiệu cao (Nguyễn Hữu Thanh, 2006) Do đó, Đinh Hữu Đơng ctv (2021) tối ưu hóa q trình thủy phân sụn cá mập (Carcharhinus dussumieri) hỗn hợp alcalase-papain theo phương pháp bề mặt đáp ứng xác định thơng số tối ưu cho q trình thủy phân thu dịch thủy phân với hiệu suất thu chondroitin sulphate cao; Đỗ Thị Thanh Thủy Nguyễn Anh Tuấn (2017) nghiên cứu chế độ thủy phân thu thu hồi dịch đạm thủy phân có chất lượng cao có tiềm ứng dụng nhiều lĩnh vực; Phan Thị Yến Nhi ctv (2017) nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân chế phẩm protein từ rong Cheatomorpha sp alcalase; Amiza et al (2011) tối ưu hóa q trình thủy phân xương đầu cá tra enzyme alcalase Tuy nhiên chưa có nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ thời điểm bổ sung flavouzyme thủy phân đầu cá lóc để sản xuất bột đạm theo phương pháp bổ sung alcalase trước flavourzyme sau Vì đề tài “Tối ưu hóa nồng độ thời điểm bổ sung enzyme flavourzyme thủy phân đầu cá lóc (Channa striata) sản xuất bột đạm enzyme alcalase flavourzyme’’ thực nhằm thu hồi protein giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường phụ phẩm cá thải 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Đầu cá lóc mua sở sản xuất khơ cá lóc Chóp (Thoại Sơn, An Giang) Đầu cá thu mua sở làm đông tủ -20±2ºC, đóng thùng vận chuyển phịng thí nghiệm Bộ mơn Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ, thời gian vận chuyển không Đầu cá rửa nhớt, máu nước muối lỗng 0,5%, sau loại bỏ mắt, mang bơng nhớt, q trình xử lý rửa đầu cá giữ lạnh nước đá Rửa sạch, để ráo, cho vào túi PE (1 kg/túi) bảo quản đông nhiệt độ -20±2ºC Khi tiến hành thí nhiệm đầu cá rã đơng, cắt làm đôi cho vào máy xay công nghiệp thời gian khoảng phút Flavourzyme enzyme protease sản xuất công ty Novozyme Đan Mạch Enzyme flavourzyme có hoạt độ 2450 LAPU (Leucine Aminopeptidase Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp 50÷55°C, pH=5,0÷7,0 Enzyme alcalase 2,4L sản xuất công ty Novozyme – Đan Mạch Alcalase enzyme protease vi khuẩn từ Bacillus licheniformis hiệu để sản xuất loại protein thủy phân (Kristinsson & Rasco, 2000) Alcalase 2,4L hoạt tính 825 U/g, điều kiện hoạt động tốt pH 6,5 - 8,5, nhiệt độ 45 - 65ºC (Ng & Mohd, 2012) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc phương pháp bổ sung alcalase trước flavourzyme sau Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với nhân tố lặp lại lần: Nhân tố X1: Nồng độ alcalase với mức khảo sát, mức thấp -1,68 ứng với nồng độ alcalase (U/g protein) 23,18; mức -1 (30); mức (40) hai mức cao +1 (50) +1,68 (56,81) Nhân tố X2: Nồng độ enzyme flavourzyme (U/g protein) với mức khảo sát, mức thấp -1,68 ứng với nồng độ flavourzyme (U/g protein) 69,54; mức -1 (90); mức (120) hai mức cao +1 (150) +1,68 (170,45) Nhân tố X3: Thời điểm bổ sung enzyme flavourzyme (giờ) với mức khảo sát, mức thấp -1,68 ứng với thời điểm bổ sung (giờ) 6,95; mức -1 (9); mức (12) hai mức cao +1 (15) +1,68 (17,04) Nhân tố X4: Tổng thời gian thủy phân (giờ) với mức khảo sát mức thấp -1,68 ứng với thời gian thủy phân (giờ) 19,91; mức -1 (24); mức (30) hai mức cao +1 (36) +1,68 (40,09) Bảng Ma trận quy hoạch thực nghiệm trình tối ưu hóa điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc phương pháp bổ sung alcalase trước flavourzyme sau Giá trị mã hóa Giá trị thực nghiệm Nồng độ Nồng Thời Thời A (U/g độ điểm gian NT X1 X2 X3 X4 protein) F bổ (giờ) (U/g sung protein) F (giờ) 0 1,68 40 120 12 40,09 0 0 40 120 12 30 -1 -1 -1 -1 30 90 24 0 0 40 120 12 30 -1 -1 50 90 36 -1 -1 -1 30 90 15 24 1 -1 50 150 15 24 0 -1,68 40 120 6,95 30 1,68 0 56,81 120 12 30 10 -1 1 50 90 15 36 11 -1 1 30 150 15 36 12 0 0 40 120 12 30 13 1 -1 -1 50 150 24 14 0 1,68 40 120 17,04 30 151 -1,68 0 40 69,54 12 30 0 -1,68 40 120 12 19,91 17 -1 -1 30 150 36 181 1,68 0 40 170,45 12 30 -1,68 0 23,18 120 12 30 (Ghi chú: Giá trị mã hóa -1,68, -1, , +1, +1,68 thể mức độ khảo sát tương ứng với nồng độ enzyme alcalase (U/g protein) 23,18; 30; 40; 50 56,81; nồng độ flavourzyme (U/g protein) 69,54; 90; 120; 150 170,45; thời điểm bổ sung flavourzyme (giờ) 6,59; 9; 12; 15 17,04; thời gian thủy phân (giờ) 19,91; 24; 30; 36 40,09 tương ứng với giá trị mã hóa -1,68, -1, , +1, +1,68) A: alcalase; F: flavourzyme Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) thiết kế Draper-Lin small composite design bố trí thí nghiệm với nhân tố lần lặp lại Các yếu tố nghiên cứu với mức (-α; -1; 0; 1; +α) Thực thí nghiệm, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM với 19 nghiệm thức Trong có nghiệm thức tâm phương án để kiểm tra ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy Đầu cá lóc sau xử lý mục 2.1 tiến hành thủy phân theo phương pháp bổ sung alcalase trước flavourzyme sau với thông số cố định lựa chọn dựa kết thí nghiệm khảo sát sơ pH tự nhiên, nhiệt độ 55ºC, tỉ lệ dung dịch ethanol 20o so với nguyên liệu 1:1 Nồng độ flavourzyme, alcalase, thời điểm bổ sung flavourzyme tổng thời gian thủy phân khảo sát bố trí thí nghiệm Bảng với 19 nghiệm thức, lần lặp lại 57 đơn vị thí nghiệm Sau kết thúc trình thủy phân, bất hoạt enzyme 95ºC thời gian 10 phút, lọc để tách riêng phần bã đầu thu phần dịch lọc Phần dịch lọc ly tâm 7.500 vòng/phút 4ºC với thời gian 30 phút Sau ly tâm, thu phần: lớp lipid, lớp dịch thuỷ phân, lớp đáy cặn ly tâm (rắn) Tiến hành xác định hiệu suất thủy phân, hiệu suất thu hồi protein, hàm lượng đạm acid amin, để xác định nồng độ alcalase, flavourzyme, thời điểm bổ sung flavourzyme thời gian thủy phân thích hợp q trình thủy phân theo phương pháp bổ sung alcalase trước flavourzyme sau đem lại hiệu thủy phân protein từ đầu cá lóc tốt 2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian cô quay đến chất lượng dịch đạm đặc Tiến hành thí nghiệm: Sau chọn điều kiện thủy phân tối ưu thí nghiệm 1, tiến hành thí nghiệm Sử dụng 50 mL dịch đạm tiến hành cô quay chân không với nhân tố (thời gian cô quay) thay đổi 20; 30; 40 50 phút, nhiệt độ 40ºC, áp suất 70 mbar Tổng số nghiệm thức với lần lặp lại 12 đơn vị thí nghiệm Sau quay tiến hành xác định hàm lượng protein, hàm lượng đạm amin tổng số hiệu suất thu hồi để chọn thời gian cô quay thích hợp Mẫu dịch đạm từ mẫu tối ưu sấy phun với nhiệt độ khơng khí đầu vào 170oC; nhiệt độ đầu ra: 60-70oC; cường độ: 7-9A; nguồn điện: 219-222V, lưu lượng 500 mL/giờ theo nghiên cứu Souissi et al., (2007) để thu bột đạm Tiến hành xác định thành phần hóa học protein, lipid, khống, ẩm tổng số vi khuẩn hiếu khí bột đạm thủy phân 2.3 Phương pháp phân tích Thành phần hóa học bột đạm độ ẩm, lipid, protein khoáng xác định theo AOAC (2000) Tổng số vi khuẩn hiếu khí bột đạm xác định theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 5165:1990) Hoạt tính alcalase, flavourzyme xác định theo phương pháp Cupp-Enyard (2008) Hiệu suất thủy phân (%) xác định theo phương pháp OPA (ophthalaldehyde), dựa nguyên tắc nhóm amin acid amin peptide phản ứng với Ortho-phthaldialdehyde với có mặt –SH dithiothreitol mercaptoethanol tạo hợp chất có khả hấp thụ bước sóng 340 nm (Nielsen et al., 2001) Xác định hàm lượng đạm acid amin theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 3708-90) Xác định hiệu suất thu hồi protein theo phương pháp Wang et al (2018) Hiệu suất thu hồi protein: PR (%) = (Hàm lượng protein tổng số dịch thủy phân*khối lượng dịch đạm)*100/(Hàm lượng protein tổng số nguyên liệu đầu cá *khối lượng nguyên liệu) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập tính trung bình, độ lệch chuẩn sử dụng chương trình Microsoft Excel 2010 Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XVI version 15.1.02 để xử lý kết thí nghiệm chương trình Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 16.0 phân tích ANOVA nhân tố với mức ý nghĩa 95% phép thử Ducan (p