DOANKIMMAI_CHUYENDE1_58CNSH_bn_chinh_da

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA/ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN KHI SỬ DỤNG CHỂ PHẨM VI SINH Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Tấn Sỹ TS Phạm Thị Minh Hải Sinh viên: Đoàn Kim Mai Mã số sinh viên: 57130707 22 Khánh Hòa, 28 tháng năm 2020 22 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN KHI SỬ DỤNG CHỂ PHẨM VI SINH GVHD: TS.Nguyễn Văn Sỹ ThS Phạm Thị Minh Hải SVTH: Đoàn Kim Mai MSSV: 57130707 Khánh Hòa, tháng năm 2020 22 LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Tấn Sỹ- Giảng viên Viện Nuôi trồng Thủy sản giảng dạy học phần tận tình chi tiết, cung cấp đầy đủ giảng, tài liệu học tập, kiến thức chuyên sâu ứng dụng công nghệ sinh học nuôi trồng thủy sản Tôi xin trân trọng cảm ơn cô Phạm Thị Minh Hải hướng dẫn cho cách viết làm báo cáo chuyên đề nhiệt tình cụ thể Đồng thời tơi xin cảm ơn cô Phạm Thị Minh Thu, cô Nguyễn Thị Kim Cúc nhà trường giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình học tập Xin trân trọng cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 28 tháng năm 2020 Sinh viên Đoàn Kim Mai 22 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT WHO: World Heath Organi zation Tổ chức Y tế Thế giới NTTS: Nuôi trồng thủy sản CPSH: Chế phẩm sinh học LAB: Lactic acid bacteria 22 DANH MỤC HÌNH 22 MỤC LỤC MỞ ĐẦU I KHÁI QUÁT VỀ PROBIOTIC .7 Khái niệm lịch sử hình thành Probiotic nuôi trồng thủy sản: Thành tựu Vai trị lợi ích 10 3.1 Vai trò: 10 3.2 Lợi ích probiotic nuôi trồng thủy sản: 11 Tình hình NTTS ngồi nước: .13 4.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản thế giới 13 4.2 Tình hình ni trờng thủy sản ở Việt Nam 14 II Tiêu chí đánh giá độ an tồn sử dụng probiotic 15 Nguồn gốc chủng vi sinh: 15 1.1 Nhóm Bacillus: .15 1.2 Nhóm vi khuẩn lactic 17 1.1 Nhóm vi khuẩn Arthrobacter: .18 1.2 Nhóm vi khuẩn Bacillus: 18 Kháng với điều kiện thí nghiệm in vivo in vitro: 20 Khả bám dính khu trú biểu mơ ruột: 21 Hoạt tính kháng vi khuẩn bệnh: 21 Kích thích đáp ứng miễn dịch: 21 Khả bảo toàn mật số (bền nhiệt sống trình bảo quản): 21 III Kết luận .22 22 IV 22 Tài liệu tham khảo .22 MỞ ĐẦU Việt Nam có tiềm lớn diện tích ni trồng thủy sản nước lợ với đường bờ biển dài tới 3260km nhiều đảo lớn nhỏ, nhiều đầm phá, eo vịnh, đặc biệt có tới 250.000 rừng ngập mặn 290.000 bãi triều Tuy nhiên, năm gần ngành nuôi trồng đối mặt với khó khăn dẫn đến nguy thất bại nhiều sở nuôi trồng Nguyên nhân nhiễm mơi trường nước đầm ni, dịch bệnh hệ thống sinh thái bị phá hủy Các đầm NTTS, đặc biệt đầm quảng canh khơng có hệ thống cấp, nước xử lí nước thải nên q trình ni, phân sinh vật, thức ăn thừa, xác động vật thủy sinh, xác rong, tảo, loại hóa chất sử dụng q trình nuôi, loại vi khuẩn gây bệnh làm cho nước đầm bị ô nhiễm Các chất hữu tích tụ lại đáy đầm bị phân hủy kị khí sinh sản phẩm NH3, H2S, NO3… làm cho cá tôm bị sốc gây hại cho tôm cá sinh vật khác sống đầm Khi đầm ni bị nhiễm nhóm vi sinh vật có hại có hội phát triển mạnh mẽ, khơng kiểm sốt hậu vật nuôi bị bệnh Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý mơi trường ao ni phịng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường người Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh gây vấn đề dư lượng kháng sinh vật nuôi vi phạm vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm Do đó, cần chọn giải pháp thích hợp để giải vấn đề Thay sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh cho tơm cá có giải pháp dùng chế phẩm vi sinh Các loại vi sinh vật dùng ngày nhiều xử lý môi trường nước NTTS đem lại nhiều lợi ích cho người môi trường sống mà phương pháp khác khơng như: an tồn với người động vật, đặc hiệu vật chủ, thích hợp với phương pháp phòng trừ khác, thời gian phân hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả tự nhân lên ức chế vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá Với đề tài “Tiêu chí đánh giá độ an tồn sử dụng chế phẩm vi sinh” sâu tìm hiểu yêu cầu chủng vi sinh vật, khả bám dính hay hoạt tính vi khuẩn… để tìm giải pháp tốt giúp nâng cao giá trị kinh tế ngành NTTS I KHÁI QUÁT VỀ PROBIOTIC Khái niệm lịch sử hình thành Theo định nghĩa tổ chức y tế tế giới WHO, probiotic “những vi sinh vật sống đưa vào thể lượng đầy đủ có lợi cho sức khỏe thể”(1) Probiotics có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp, ghép từ chữ pro biotic sống, tiếng Việt thường gọi trợ sinh Thuật ngữ probiotic dung để mô tả chất sinh từ vi sinh vật có tác dụng tăng trưởng vi sinh vật sinh vật khác Năm 1959, Rl Fuller định nghĩa rõ hơn: Probiotic hay vi sinh vật probiotic vi sinh vật sống, bở sung vào thức ăn có tác dụng cân hệ đường ruột có tác dụng hữu ích cho động vật chủ(54) Gần đây, định nghĩa mở rộng hơn: Probiotic chế phẩm bao gồm vi sinh vật sống có tác dụng hữu ích cho động vật người sử dụng Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụng làm cân hệ vi sinh đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá thể hay tăng lượng kháng thể kích thích hệ thống miễn dịch đặc hiệu cung cấp enzyme q trình trao đởi chất vi khuẩn Probiotc giảm vi sinh vật có hại (các vi sinh vật cạnh thranh thức ăn tiết chất độc ảnh hưởng xấu tới hoạt động sống vật chủ), làm tăng vi sinh vật có lời (đó vi sinh vật cạnh tranh thức ăn vị trí bám vào mơ với sinh vật có hại, chúng tiết chất diệt khuẩn vitamin K cho thể) Ngày nay, khái niệm probiotic cịn mở rộng sang lĩnh vực mơi trường đưa probiotic vào môi trường nước để tạo cân vi sinh vật môi trường nước ta, việc sử dụng chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản (NTTS) sản xuất giống ứng dụng nhiều từ năm 2000 trở lại đây, qua thực tế sử dụng cho thấy kết tốt Hiện nay, Việt Nam hầu hết sở nuôi tôm cá sử dụng chế phẩm vi sinh vật probiotic Với mục tiêu tăng nhanh sản lượng, người ta thả tôm, cá với mật độ dày khơng có biện pháp xử lý mơi trường thích hợp, dẫn đến tượng thối đầm, làm giảm oxy hịa tan khiến tơm, ngạt thở Hàm lượng NH 3, NH4+, NO2, H2S… tăng cao 22 Hệ miễn dịch khơng đặc hiệu kích thích probiotics Việc bở sung Clostridium butyricum vào thức ăn cho cá hồi cầu vòng (rainbow trout) làm tăng hoạt động thực bào leucocytes Đối với tơm sú (Penaeus monodon) việc sử dụng Bacillus sp cho thấy tăng cường miễn dịch thể dịch miễn dịch tế bào tôm 3.2.6 Cải thiện chất lượng nước ao Cá thải nitơ (nitrogen) dạng NH NH4+, làm tăng hàm lượng ammonia nước ao ni, hình thành khí độc ao ni Một số dịng vi khuẩn Nitrsomonas (có khả chuyển hóa ammonia thành nitrate), Nitrobacter chuyển hóa nitrite thành nitrate Nitrate gây độc với hàm lượng cao Vi khuẩn khử Sulface oxy hóa hợp chất hữu nước (ethanol, methanol, lactace, acetace) giải phóng ion Sunlfide độc cho động vật nuôi Một số vi khuẩn có khả làm giảm hàm lượng methane (CH4) nước, làm cho methane giải phóng khơng khí qua chất lượng nước cải thiện 3.2.7 Tác động đến hệ phiêu sinh thực vật Probiotics có khả diệt tảo ao nuôi đặc biệt tượng tảo đỏ Do đó, khơng nên sử dụng probiotics q trình ương ni ấu trùng với mơ hình nước xanh Trường hợp cải tạo ao muốn gây màu nước kích thích phát triển tảo nên hạn chế việc sử dụng probiotics giai đoạn 3.2.8 Kháng virus Một số probiotic có khả ức chế hoạt động virus Một số chiết xuất từ tảo biển chiết xuất từ tế bào vi khuẩn có khả ức chế hoạt động virus phản ứng hóa sinh bề mặt Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas sp., Aeromonas sp., 22 vài nhóm vi khuẩn hình que phân lập q trình ương ấu trùng cá hồi có khả chống lại virus gây bệnh hoại tử từ khả tạo máu cá hồi Tình hình NTTS ngồi nước: 4.1 Tình hình ni trờng thủy sản thế giới NTTS ngành sản xuất động thực vật thủy sinh điều kiện kiểm soát bán kiểm sốt, người ta thường nói, NTTS sản xuất nông nghiệp môi trường nước(8) Trong thời gian qua, ngành thủy sản ngày phát triển dần trở thành ngành kinh tế mũi nhọn nhiều quốc gia ngành cung cấp thwujc phẩm quan trọng cho cộng đồng dân toàn giới phát triển số lượng giá trị, ngành thủy sản cịn có bước thay đổi cấu sản xuất từ ngành thủy sản công nghiệp với khai thác thủy sản đóng vai trị chủ đạo quốc gia có sản lượng lớn nước phát triển có đội tàu khai thác xa bờ công nghiệp chế biến đại năm trước thập kỉ 90, giai đoạn từ 10 năm trở lại đây, ngành thủy sản phát triển theo hướng nông nghiệp, nghĩa NTTS tăng nhanh tỷ lệ đóng góp nước nơng nghiệp nước có sản lượng đứng đầu giới Chỉ tính giai đoạn 10 năm từ 1993-2003, sản lượng khai thác đứng yên, tăng 1,2% sản lượng NTTS tăng năm 9,4% Năm 2003, tỷ lệ NTTS tổng sản lượng thủy sản giới tăng lên 31,7%(8) Theo thống kê FAO, năm 2003 tổng sản lượng thủy sản giới đạt gần 132 triệu tấn, lĩnh vực khai thác đạt 90 triệu nuôi đạt gần 42 triệu đó, lượng thủy sản dung làm thực phẩm khoảng 101 triệu tấn, chiếm 76,5%(8) Nếu phân theo môi trường nuôi, snr lượng laoif nước chiếm tỷ lệ cao Năm 2003 nuôi nnuowsc đạt 25,2 triệu tấn, chiếm 60,14% sản lượng 48,7% giá trị) Thủy sản nước mặn chiếm 36,5% sản lượng 35,7% giá trị Mặc dù sản lượng nuôi nước lợ chiếm 5,8% ( năm 2002), lại chiếm tới 15,9% giá trị phần lớn sản phẩm có giá trị cao 22 4.2 Tình hình ni trờng thủy sản ở Việt Nam Với đường bờ biển dài 3200km; Việt Nam có vùng đặc quyền kinh tế biển rộng triệu km2 Việt Nam có vùng mặt nước nội địa lớn rộng 1,4 triệu nhờ hệ thống song ngịi, đàm phá dày đặt, vị trí địa lý điều kiện tự nhiên thuận lợi giúp Việt Nam có nhiều mạnh nổi trội để phát triển ngành thủy sản Từ lâu Việt Nam trở thành quốc gia sản xuất xuất thủy sản hang đầu khu vực với Asia Thái Lan Xuất thủy sản trở thành lĩnh vực quan trọng kinh tees96) Theo số liệu thống kê, 11 tháng đầu năn 2009 xuất thủy sản đạt 3.928 triệu la, 93,8% so với kì năm ngối; chiếm 7,6% tởng xuất nước(6) Việt Nam có triệu km đường bờ biển 1,4 triệu hecta mặt nước nội địa nguồn cung thủy sản dồi ổn định Trữ lượng hải sản Việt Nam ước tính có khoảng 4,2 triệu nguồn tái khoảng 1,73 triệu Mở rộng diện tích NTTS cải thiện khả khai thác đánh cá xa bờ giúp sản lượng thủy sản Việt Nam không ngừng tăng cao năm qua Mức tăng trưởng trung bình từ năm 2006-2008 khoảng 11% Đến hết tháng 11 năm 2009, sản lượng thủy sản đạt 4,4 triệu tấn(6) Trong năm gần đây, sản phẩm mặt hang thủy sản Việt Nam nganyf đa dạng hóa Các sản phẩm tôm, cá tra, cá ngừ, hang khô, mực, bạch tuộc chiếm tỷ trọng lớn kim ngạch xuất thủy sản Trong đó, tơm đứng đầu kim ngạch xuất khẩu, chiếm 38,4% II Tiêu chí đánh giá độ an tồn sử dụng probiotic Các chủng vi sinh phải xếp vào nhóm GRAS (Generally Recognized As Safe), với ý nghĩa vi sinh cơng nhận an tồn Các chế phẩm vi sinh phép thương mại hóa châu Âu chứa vi sinh xếp vào nhóm an tồn 22 Nguồn gốc chủng vi sinh: Các chủng vi sinh cần phân lập định danh dòng (strain) Các dịng (strain) khác lồi (species) có ảnh hưởng có lợi khác động vật sử dụng ( Bermadeau Vermoux, 2013) Hầu hết vi sinh vật có CPSH thường có từ mơi trường ni trồng thủy sản từ nước hay cát, từ lớp nhớt da cá Đơi CPSH có nguồn gốc từ “ sưu tập” vi khuẩn nuôi cấy từ phịng thí nghiệm sản phẩm thương mại Khả ức chế mầm bệnh yếu tố đáng để xem xét loại bỏ CPSH, có tác dụng khác khơng phần quan trọng 1.1 Nhóm Bacillus: Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng tự nhiên, nhiều mơi trường (đất, nước, khơng khí, thực phẩm…) gồm nhiều nhóm sinh lí sinh thái khác (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa lạnh…), với gần khoảng gần 500 loài loài Do đa dạng sinh thái đa dạng loài hoạt chất sinh học chúng vô phong phú: enzym ngoại bào, chất kháng khuẩn kháng nấm, chất kích thích sinh trưởng thực vật, chất hoạt động bề mặt…[32] Ngoài chức phân giải hợp chất hữu làm môi trường chúng cịn có tác dụng kiểm sốt phát triển mức vi sinh vật gây bệnh chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường trạng thái cân sinh học 22 Đặc điểm quan trọng chi Bacillus có khả tạo nội bào tử, điều kiện bất lợi cạn kiệt nguồn dinh 28 dưỡng hay điều kiện bất lợi nhiệt độ cao, tia xạ hóa chất… Bào tử Bacillus tồn lâu chí nhiều năm, gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng Trong trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh hợp chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng nhiều lĩnh vực Một đặc tính sinh enzym phân hủy hữu proteaza, amylaza, xenlulaza Proteaza enzym xúc tác thủy phân liên kết peptit (CO-NH) phân tử protein chất tương tự Sản phẩm thủy phân axit amin, sản phẩm trung gian peptit có mạch dài ngắn khác Enzym amylaza có tác dụng thủy phân tinh bột Quá trình trải qua giai đoạn dextrin hóa, số liên kết phân tử chất bị thủy phân tạo thành lượng dextrin giai đoạn đường hóa Trong giai đoạn dextrin vừa tạo thành bị phân hủy tiếp thành phân tử thấp maltozơ, isomaltozơ, glucozơ Enzym xenlulaza xúc tác thủy phân xenlulozơ thành sản phẩm trung gian xenlubiozơ sản phẩm cuối glucozơ Các sản phẩm cuối phân hủy chất hữu nhờ hệ enzym proteaza, amylaza, xenlulaza axit amin glucozơ Đó nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh làm cải thiện chất lượng nước [32] 1.2 Nhóm vi khuẩn lactic 22 Một nhóm vi khuẩn điển hình có ích mơi trường đầm ni tơm cá nhóm vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacteriacae Chúng không đồng mặt hình thái, giống khác có hình dạng kích thước khác Nhưng nhìn chung chúng chia thành hai loại hình cầu hình que Ngồi hình dạng kích thước tế bào vi khuẩn lactic cịn phụ thuộc vào mơi trường, điều kiện ni cấy, có mặt oxy t̉i tế bào Streptococcus có tế bào hình cầu hình ovan, đường kính khoảng 0,5 -1,0 µm, xếp riêng biệt, cặp đôi thành chuỗi dài Tuy nhiên, số chủng thuộc lồi có dạng giống trực khuẩn có kích thước chiều dài lớn chiều rộng, chẳng hạn Streptococus lactic [9] Leuconostoc có hình dạng dài hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm chiều dài khoảng 1,6µm Đơi chúng có dạng trịn, chiều dài khoảng - 3µm, xếp thành chuỗi khơng tạo thành đám [9] Lactobacillus có hình que Đây loại vi khuẩn phở biến Hình dạng chúng thay đởi từ hình cầu hình que dài Chẳng hạn L plantatum có 29 dạng hình que kích thước từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, xếp thành chuỗi đứng riêng lẻ, L casei có dạng hình que ngắn hình que dài, tế bào hình que mảnh, đơi cong, xếp thành cặp hay chuỗi [9] Về hình thái, vi khuẩn lactic có hình dạnh khơng đồng Nhưng mặt sinh lý chúng lại có điểm tương đối đồng Chúng vi khuẩn Gram (+), khơng có khả tạo bào tử, khơng di động, sinh axit lactic q trình phát triển, catalase, oxydase khử nitrat âm tính, khơng chứa xitocrom, hơ hấp kỵ khí vi hiếu khí [10] Mỗi lồi vi khuẩn khác có nhu cầu dinh dưỡng khác Chúng cần cung cấp đủ chất dinh dưỡng: cacbon, nitơ, muối khống… mà cịn cần chất kích thích sinh trưởng Nhóm vi khuẩn lactic có khả kiểm sốt vi sinh vật gây bệnh môi trường nhờ sinh chất đối kháng axit lactic, bacteriocin Ngồi vai trị kiểm sốt vi sinh vật gây bệnh mơi trường chúng có tác dụng làm giảm mùi đầm ni Quan trọng cả, sử dụng nhóm vi khuẩn cịn có tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm thủy sản Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bở sung vào thức ăn tơm cá, ngồi mục đích làm cân khu hệ vi 22 sinh vật đường ruột, ngăn cản xâm nhập vi sinh vật có hại, tăng khả phịng ngừa số bệnh đường ruột chúng cịn có tác dụng tăng khả tiêu hóa hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [5] 1.3 Nhóm vi khuẩn Arthrobacter: Vi khuẩn Arthrobacter chủng MCCB 104 giúp ấu trùng tôm sú P Monodo chống lại vi khuẩn phát sáng V Harveyi Chủng Arthrobacter XE-7 giúp nâng cao tiêu thuộc hệ miễn dịch tôm thẻ chân trắng L Vannamei giúp tôm giảm tỉ lệ chết gây cảm nhiễm vi khuẩn V Parahaemolyticus (vi khuẩn cho tác nhân gây bệnh ESM/AHPND) 1.4 Nhóm vi khuẩn Bacillus: Có nhiều nghiên cứu chứng tỏ khả thành công bổ sung loài vi khuẩn thuộc giống Bacillus vào thức ăn giúp nâng cao chất lượng nước nuôi trồng thủy sản cá động vật khơng xương sống, ví dụ như: tôm thẻ chân trắng Bandyopdhyay and Das Mohapatra báo cáo vi khuẩn Bacillus circulans PB7 phân lập từ ruột cá Catla catla có tác dụng chất kích thích miễn dịch quan trọng giúp cá nâng cao tỷ lệ sống cá gây cảm nhiễm vi khuẩn A Hydrophila Khi bổ sung dạng bào tử hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus licheniformis (BioPlus2B) vào thức ăn cá hồi giúp nâng cao khả để kháng lại khả vi khuẩn gây bệnh Y Ruckeri Ngồi ra, bở sung hai chủng vi khuẩn vào thức ăn hồi cầu vồng giúp nâng cao hiệu sử dụng protein, tố độ tăng trưởng đặc biệt giảm hệ số chuyển hóa thức ăn Bở sung vi khuẩn Bacillus megaterium vào thức ăn giúp nâng cao hoạt động quần thể vi khuẩn đường ruột, nâng cao khả miễn dịch đề kháng bệnh tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm virus đốm trắng WSSV bổ sung vi khuẩn sống Bacillus pumilus giúp nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng tôm he Nhật Bản P 22 Japonicus Bổ sung vi khuẩn B Pumilus với nồng độ 106 1012 tế bào/g thức ăn giúp gia tăng tốc độ tăng trưởng, gia tăng khả hệ miễn dịch tỷ lệ sống cá rô phi gây cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh A Hydrophila Vi khuẩn Bacillus P64 gây ức chế giúp điều hịa hệ miễn dịch tơm thẻ chân trắng L Vannamei Sử dụng CPSH có chứa vi khuẩn Bacillus ổ sung vào môi trường nước giúp gia tăng tỷ lệ sống tốc độ tăng trưởng tôm thẻ chân trắng giai đoạn zoea mysic Bacillus spp hiệu việc chống lại vi khuẩn gây bệnh phát sáng vi khuẩn V Harveyi tôm sú giống Bốn dòng vi khuẩn Bacillus phân lập từ ống tiêu hóa tơm thẻ chân trắng khỏe mạnh bổ sung vào môi trường nước ương nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắng với hàm lượng 1x10 CFU/ ml hàng ngày giúp gia tăng tỷ lệ sống sức khỏe ấu trùng tôm Phương pháp xác định số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọn  Xác định khả hình thành bào tử vi khuẩn Tiến hành pha lỗng dịch ni cấy vào ống nghiệm Đem ống đun cách thủy 80oC 10 phút Sau đó, dùng Pipetman hút 50µl dịch cấy trải mơi trường thạch thường, đặt vào tủ ấm 30oC Sau thời gian, đĩa thạch xuất khuẩn lạc chủng vi khuẩn có khả hình thành bào tử ngược lại  Xác định khả hóa lỏng gelatin Cấy vi khuẩn theo phương pháp thẳng đứng, sâu vào ống nghiệm gelatin đứng Sau ngày đặt 30oC, lấy ống nghiệm giữ oC Kiểm tra kết thấy mơi trường hóa lỏng kết luận chủng vi khuẩn có khả hóa lỏng gelatin ngược lại  Xác định khả chịu muối Cấy vi khuẩn lên đĩa peptri chứa môi trường thạch thường với nồng độ muối khác từ 1-13% giữ tủ ấm Vi khuẩn mọc nồng độ muối ta kết luận chúng có khả chịu muối nồng độ  22 Xác định hoạt tính catalaza 43 Ni vi khuẩn hộp petri, chúng tạo thành khuẩn lạc ta nhỏ giọt dung dịch H2O2 3% lên khuẩn lạc Nếu thấy bọt khí xuất chứng tỏ có enzym catalaza  Khả đồng hóa nguồn cacbon: vi khuẩn ni cấy mơi trường thạch thường có bổ sung 1% nguồn đường: Glucozơ, Dextrin, lactozơ, sacarozơ, tinh bột… Sau ngày lấy quan sát sinh trưởng Đối chứng dương mơi trường có glucoza, đối chứng âm mơi trường khơng có đường + Nếu vi khuẩn sinh trưởng mạnh đối chứng dương nghĩa có khả sử dụng loại đường đó, ký hiệu (+) + Nếu vi khuẩn sinh trưởng mạnh đối chứng dương, ký hiệu (++) + Nếu vi khuẩn sinh trưởng đối chứng âm hay khơng mọc nghĩa khơng có khả sử dụng loại đường đó, ký hiệu (-) + Nếu vi khuẩn sinh trưởng tốt đối chứng âm đối chứng dương nhiều, ký hiệu (±) Kháng với điều kiện thí nghiệm in vivo in vitro: Lý để sử dụng CPSH kiểm soát dịch bệnh khả ức chế mầm bệnh mục tiêu chứng minh nghiên cứu ống nghiệm in vitro có mối liên hệ mong manh sử dụng thể sống in vivo Sau sử dụng Probiotic, vi sinh vật chế phẩm không bị giết chế bảo vệ vật chủ kháng lại điều kiện bất lợi đường ruột pH, dịch mật dịch tụy 2.1 Xác định tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus điều kiện in vitro: 22 Vibrio parahaemolyticus gây bệnh Phục hồi TCBS agar 28oC, 24 Cấy chuyền môi trường NA agar (+1.5% NaCl) ủ 28oC, 24 Nhuộm Gram để kiểm tra tính Nuôi tăng sinh ml môi trường Pha loảng vi khuẩn đến mật độ 108 Trãi 50 µl dịch ni lên bề mặt mơi Tạo giếng với đường kính 6mm Ủ 28oC, 24 Đo đường kính vơ trùng - Phương pháp xác định tính đối kháng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Ngô Thị Phương Dung ctv., 2011): Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus nhận từ Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ nuôi sinh khối môi trường TSB + 1,5% NaCl 24 giờ, đếm mật số phương pháp so màu quang phở, pha lỗng mật số khoảng 108 22