DNA marker

1 K thut DNA Marker DNA MARKER ăăăă Nhúm thc hiện: Trần Như Khoa Nguyễn Duy Lan Nguyễn Thị Bích Liễu Lê Hồng Lâm Nguyễn Thị Kim Ngân ðặng Thị Ái Trinh Nội dung Khái niệm DNA marker Các kỹ thuật: Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism) Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) Kỹ thuật RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA) Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) DNA MARKER Về chất, chuỗi mã DNA ñược dùng để phân biệt hai cá thể, hai dịng hai giống khác xem DNA marker Các DNA marker chia thành hai nhóm: -Marker dựa sở lai DNA: RFLP, minisatellite -Marker dựa khuếch ñại DNA kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD Dựa kiểu hình phân loại DNA marker thành loại: -Marker đồng trội: marker phân biệt ñược cá thể ñồng hợp tử cá thể dị hợp tử, marker allozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP Trong trường hợp tần số alen ñược tính trực tiếp từ liệu kiểu gen -Marker trội: RAPD marker phân biệt cá thể ñồng hợp tử cá thể dị hợp tử Marker Tên ñầy ñủ RFLP ALP AFLP RAPD Restriction fragment length polymorphism Amplicon length polymorphism Amplified freagment lenth polymorphism Random Amplification Polymorphic DNA DAF DNA amplification fingerprinting SSR AP-PCR SSCP Single sequence repeat (microsatellite) Arbitrary primer-PCR Single strand conformation polymorphism MRDHV-DNA Moderately repeated, dispersed and highly variable DNA (minisatellite) Kỹ thuật DNA Marker Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ðịnh nghĩa: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc / ri-flip/- viết tắt Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP ñược ñịnh nghĩa tính đa hình chiều dài phân đoạn cắt giới hạn, biểu khác kích thước phân ñoạn ñược tạo cắt DNA enzyme cắt giới hạn có thay đổi trình tự DNA nhân bào quan khác Nguyên tắc Dựa ñộ ñặc hiệu enzyme cắt hạn chế (RE) vị trí nhận biết chúng DNA gen DNA gen ñược cắt enzyme cắt giới hạn, chạy ñiện di qua gel agarose, thấm qua màng lai lai với mẫu dị DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể tạo phân ñoạn cắt khác Kỹ thuật DNA Marker T-RFLP method Kỹ thuật DNA Marker Ưu nhược ñiểm Ưu ñiểm : Là marker ñồng trội cho phép phân biệt ñược cá thể ñồng hợp dị hợp Do kích thước DNA khảo sát RFLP lớn số lượng marker tạo nhiều ñủ ñáp ứng nhu cầu nghiên cứu Hạn chế: Do qui trình thực phức tạp, nguy hiểm sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu) DNA yêu cầu có chất lượng cao Ứng dụng 1.Xác định thơng tin di truyền: Schematic for RFLP by cleavage site loss 2.Phân tích cấu trúc di truyền DNA ứng dụng Y pháp nhận dạng : Từ năm 30s dấu vân tay ñược ñưa vào ứng dụng Y Pháp (Forensics) trở thành công cụ cần thiết phịng thí nghiệm cảnh sát hình thám tử ñể nhận dạng Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết áp dụng thực tế Chẳng hạn, dấu vân tay thông thường lấy mẫu từ đầu ngón tay mà thơi ðã ngày khơng cịn đặc hiệu cho cá thể từ phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta chủ ñịnh thay ñổi dấu vân tay qua phẫu thuật Chỉ vòng 50 năm từ cấu trúc chuỗi di truyền DNA ñược Watson Crick cơng bố [1], ngành sinh học phân tử phát triển mạnh mẽ ñược ứng dụng rộng rãi Một ứng dụng quan trọng sinh học phân tử sử dụng đặc tính cấu trúc chuỗi di truyền DNA cá thể vào Y pháp ñể nhận dạng ñối tượng coi cách mạng Y học hình nhân loại Tương tự dấu vân tay, người có đặc trưng riêng cấu trúc di truyền mình, xác định chuỗi di truyền DNA Cấu trúc DNA [1], và"ñiểm chỉ" DNA: ðặc tính tất sinh vật, kể người, ñều ñược cấu tạo từ ñơn vị tế bào, từ nguyên thuỷ hợp tử ñược thụ tinh trứng tinh trùng Về phương diện sinh học phân tử, tế bào thể (trừ hồng cầu) có nhân, nhân chứa chất liệu di truyền, nhiễm sắc thể (chromosome) định cấu trúc đặc tính cho cá thể Con người có 23 nhiễm sắc thể (22 đơi thường đơi xác định giới tính) Các nhiễm sắc thể ñược tạo chuỗi chất liệu chứa đựng thơng tin di truyền DNA (viết tắt từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha mẹ Mỗi cá thể sống nhận chất liệu DNA 50% từ cha 50% từ mẹ Kỹ thuật DNA Marker Có thể hình tượng cấu trúc phân tử DNA phéc-mơ-tuya (zip), kéo bốn khối chất liệu bản, viết tắt ký tự A (adenine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine), mà ký tự gọi nucleotide, chúng đứng song đơi kéo phéc-mơ-tuya theo cặp cố ñịnh A-T G-C Thơng tin chứa đựng DNA xác định chuỗi tiếp nối ký tự dọc theo "phéc-mơ-tuya" di truyền Các 'ký tự' ñứng theo thứ tự số lượng ñịnh ñể tạo thành ñơn vị lớn gọi gien Nhiều gien nối lại với tạo thành nhiễm sắc thể Theo ước tính nhất, người có khoảng 35000 gien Trong có 1% số lượng gien đóng vai trị chức (thí dụ gien quy định màu da, tóc v.v ), 99% cịn lại gien khơng có chức năng, gien ña dạng, khác cá thể Cho nên chẳng thể có người giống người cấu trúc di truyền DNA cả, trừ người sinh đơi trứng 'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA profiling) phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn chuỗi DNA (của cá thể), tức gien thuộc phần gien khơng có chức năng, đủ để phản ánh đặc thù riêng cá thể không lẫn lộn với người khác Và từ mà thuật ngữ "ðiểm chỉ" DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- 'hồ sơ DNA', nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys đề xuất, để nói lên đặc trưng cho cá thể giống dấu vân tay (hay ñiểm chỉ) 'ðiểm chỉ' DNA hoàn toàn giống tất tế bào, tổ chức mô, tạng phủ thể; điểm DNA khơng thay đổi hình thức với tri thức nhân loại Về nguyên lý nhận dạng cá thể sống DNA đơn giản, ngun lý so sánh ghép cặp ðối với nhận dạng vết tích người ta đem mẫu DNA vết tích so sánh với mẫu DNA dự trữ với mẫu nghi ngờ ðối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn), người ta ñem so sánh DNA cha, mẹ với cá thể để xem có quan hệ di truyền hay khơng Nói nơm na biển số ñăng ký xe Mỗi xe có biển số riêng, người ta dựa vào hồ sơ đăng ký xác ñịnh xác chủ nhân thời xe ñó, tương tự chủ nhân có thẻ ñăng ký xe, xe họ dùng số đăng ký truy tìm xe đâu Kỹ thuật nhận dạng DNA y điều đặc biệt DNA khơng thể thay đổi ñược, 'ẩn' bên thể, phải dùng phương pháp kỹ thuật định để đọc mà thơi Tuy nhiên trình bày cấu trúc di truyền DNA đầy đủ cá thể phức tạp, người ta khơng cần thiết phải sử dụng tồn 35 nghìn gien để phân tích, so sánh Do sử dụng gien (khoảng chừng 12 gien hơn) marker (đoạn đặc trưng) gien (khơng có chức năng) cho ñủ ñể ñặc trưng cho cá thể ñể phân tích mà thơi Ứng dụng thực tế cơng nghệ ñiểm DNA: ðiểm DNA ñược ứng dụng sống hàng ngày với mục đích: (a) Trong Y pháp, hình : để xác định quan hệ phụ mẫu hệ; ñể nhận dạng tội phạm loại trừ nghi can thông qua dấu vết thể ñể lại trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân vơ thừa nhận (b) Trong Y học điều trị: ñể chẩn ñoán bệnh di truyền; phát triển phương pháp ñể chữa rối loạn di truyền (c) Trong ngành khoa học khác: Như khảo cổ học; nơnglâm-ngư nghiệp dùng để vẽ ñồ gien (mapping), tạp giao, lai giống, chuyển gien, ñể nhận dạng dấu vết loài thú quý Một ứng dụng công nghệ phân tích điểm DNA nơng nghiệp để bảo vệ tác quyền thương mại sản phẩm, hay giống lai tạo Tuỳ theo mục đích khác mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu ñể có ñược chuỗi DNA ñầu tiên ñể phân tích khác Trong ứng dụng nhận dạng người mẫu thu thập tuỳ theo yêu cầu mà lấy mẫu máu, tóc, lơng, da v v đặc biệt nhận dạng tội phạm hình sự, mẫu thu thập đa dạng tuỳ theo tính chất kiện dấu vết ñược ñể lại trường Kỹ thuật DNA Marker Các kỹ thuật phân tích ñiểm DNA hành [2]:Có nhiều kỹ thuật phân tích hai kỹ thuật thơng dụng là: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc / ri-flip/- viết tắt Restriction Fragment Length Polymorphism) (tạm dịch đoạn gien có độ dài giới hạn đa hình thái) Xuất phát từ thực tế ñoạn DNA chức đoạn DNA khơng chức tồn nhiều hình thái khác Bằng cách sử dụng enzyme ñặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, cắt đoạn gien RFLP Người ta nhận dạng đến vài nghìn loại RFLP, ñặc hiệu cho thể Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain reaction/Short Tandem Repeat) Tức kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme ña phân ñể 'khuếch đại' đoạn gien ngắn có độ lặp ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR) Ở ñây polymesase tức loại enzyme cho phản ứng tạo nhiều copy ñoạn DNA ñó; phản ứng chuỗi tức phản ứng diễn liên tục Như kỹ thuật PCR thời gian ngắn tạo hàng triệu triệu ñến hàng tỷ copy STR Kỹ thuật cịn gọi kỹ thuật "khuếch đại DNA" hay "Photocopy phân tử" lối nói rộng rãi ðây kỹ thuật ñại ñược dùng Y pháp DNA Về mặt kỹ thuật tiến hành tương tự kỹ thuật RFLPs Lợi ñiểm kỹ thuật so với RFLP là: - Mẫu thu thập không thiết phải ñạt tiêu chuẩn cao, mẫu lấy từ mô bị huỷ hoại cháy bỏng nặng, xác thối rữa chơn lâu dùng được, lấy 'vi vết' tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn máu nạn nhân lẫn với máu hay dịch phạm nhân Các ñặc ñiểm khác kỹ thuật PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận dạng quan hệ huyết thống, phân tích gien kỹ thuật RFLP cho tối ña hai dị hợp tử (allele) ba kiểu gien (genotype), dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại số lượng gien lên, cho ñến 20 dị hợp tử ñến (20x21)/2 kiểu gien, kỹ thuật cho phép đánh giá xác hơn, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang tốt, nên dễ phát tự động, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản dễ phục hồi số liệu Sau có ñoạn gien cần thiết ñược cắt ñoạn, xếp theo kích thước, phân loại, thơng qua hai kỹ thuật trên, ñoạn DNA ñược chuyển dạng, nhuộm màu gắn huỳnh quang tạo thành (như mã (bar codes) gói hàng bán siêu thị), dùng ñể so sánh ñối chiếu Tuy nhiên công nghệ DNA moị công nghệ khoa học khác, ưu điểm nhược điểm ln song ñôi với Một số vấn ñề ñối với ñiểm DNA Kết sai lầm ñiểm DNA trùng hợp cấu trúc di truyền nhiều người mà sai sót khâu kỹ thuật ñiều kiện tối ưu ñể cho kết xác Ngồi kỹ thuật phân tích điểm DNA cịn liên hệ đến mặt đạo ñức Thứ phải kể ñến tình trạng nhiễm DNA ngoại lai, có bị nhiễm kính hiển vi soi tiêu Do cần phải đặt vấn đề tiêu chuẩn chất lượng phịng thí nghiệm phải đạt u cầu Ngay Mỹ có 20 tổng số 60 phịng thí nghiệm làm DNA tiêu Ban giám đốc kiểm nhận phịng thí nghiệm Hiệp Hội Tội phạm Mỹ công nhận ñạt tiêu chuẩn mà Ở Úc, cho ñến 1991 chưa có quan kiểm nhận chất lượng phịng thí nghiệm DNA [3], khơng có chương trình kiểm tra chất lượng nội phịng thí nghiệm Thứ hai, liên quan đến kỹ thuật chọn mẫu, nhiều mẫu khơng đại diện, khơng điển hình, mẫu bị thối hố Tuy nhiên với kỹ thuật PCR/STR nêu khắc phục ñược nhược ñiểm này, kỹ thuật lại khơng cho độ xác cao Cũng vấn đề phân tích kết quả, cần phải đề cập đến độ tin cậy kiện quần thể (population data) Ví dụ FBI xây dựng hệ liệu thống kê quần thể tham khảo Kỹ thuật DNA Marker cho sắc dân da trắng, ñen, da màu dân Á châu Vấn ñề nhóm sắc dân có biến đổi (chẳng hạn Á châu gồm ðơng Á, Tây Á, ðơng Nam Á v.v ) Xác suất để khớp ñược mẫu DNA với mẫu quần thể tham khảo thấp (1 phần triệu!), xác suất cao dùng phụ nhóm quần thể tham khảo (có thể tăng lên 1/800000) Một trở ngại khác liên quan ñến chứng Kết báo cáo chuyên viên DNA tồ ghi nhận, lại khơng có chứng cụ thể ñể xác nhận mẫu DNA ñó sản phẩm lấy từ mẫu bệnh phẩm nguyên thuỷ ðiểm sau tính phức tạp kỹ thuật ñiểm DNA liên quan ñến vấn ñề ñạo ñức pháp lý ðây vấn ñề tranh cãi nhiều chưa hoàn toàn thống hệ thống pháp luật nhiều quốc gia Thứ ngân hàng liệu DNA tội phạm Luật lệ nhiều nước gần thống tội phạm nghi phạm bắt buộc phải làm DNA Cịn người bình thường khơng có sở luật pháp bắt họ phải làm, mặt liệu bị thiếu hụt Trong số trường hợp bệnh nhân bình thường, lý phải xét nghiệm DNA trường hợp nguy kết DNA bị lạm dụng Hoặc giả sử trường hợp khác vừa liên quan đến đạo đức, vừa luật pháp Ví dụ đơi vợ chồng có đứa bị bệnh Cystis Fibrosis (hay CF, dịch bệnh xơ nang tổn thương chủ yếu tuỵ tạng phối) bệnh di truyền lặn, di truyền bố mẹ phải có gien ẩn bịnh 'truyền' ñược cho ñưá Nhưng khốn thay, xét nghiệm có người mẹ mang gien lặn mà thơi Vấn đề đặt là, liệu có nên thơng báo cho người chồng bà mẹ biết ông khơng phải bố đứa trẻ hay khơng? Và có nên thơng báo cho cha thức đứa trẻ ơng có mang gien lặn bệnh CF, mặt di truyền ông không nên cưới vợ có mang gien lặn bệnh ơng nữa, hay không? ðiểm DNA vụ thảm hoạ hoả hoạn ITC thành phố HCM tháng 10/2002: Áp dụng ñiểm DNA nhận dạng tử thi thảm hoạ hoả hoạn vừa xảy hạ tuần tháng 10 vừa qua ITC, thành phố HCM [4], theo báo cáo nhà chức trách có 60 người tử vong, huỷ hoại lửa, tử thi khơng có khả nhận dạng Giới chun mơn có thẩm quyền có hứa hẹn thu mẫu làm điểm DNA cho trường hợp Vậy ta có quyền hy vọng khơng? Câu trả lời hồn tồn dưạ tổng quan ñây Thực nhận dạng cá thể trường hợp khơng hồn tồn phức tạp truy tìm dấu vết tội phạm Các bước cần phải làm cần thu mẫu mô bệnh phẩm, lấy mẫu thân nhân có người tích nghi ngờ vụ hoả hoạn Chế khắc nhược điểm mơ bị cháy, nhiễm bẩn kỹ thuật phân tích PCR/STR hồn tồn có khả Vấn đề cịn kinh phí khả thực kỹ thuật Về mặt thực tế, giới chun mơn Phillipines thành cơng việc ứng dụng cơng nghệ điểm DNA để nhận dạng nạn nhân vụ thảm hoạ hoả hoạn [5] trại mồ côi Paco, Manila năm 1998 Vụ hoả hoạn cướp 28 sinh mạng, hầu hết trẻ em ðiều phức tạp tất thi thể gần cháy thành than ngồi khả nhận dạng học, thi thể lý vệ sinh lúc chơn cất ñến tháng ñược khai quật ñể lấy mẫu Vấn ñề ñạo ñức ñặt trường hợp sau vụ thảm nạn, nhiều bố mẹ trước ñã gửi vào trại mồ côi ñây, khơng biết nạn nhân có phải khơng, nhận dạng họ làm điều họ nhang khói cho đứa xấu số q khứ họ khơng có khả ni dưỡng Mặc dù có số nhược điểm, ñiểm DNA ñược coi công nghệ tối tân khoa học nhận dạng cá thể ñặc hiệu xác, tính đặc trưng cho cá thể ðiểm DNA khơng ñưa hình Y pháp lên bước tiến mà cịn ứng dụng rộng rãi ngành khoa học khác, kể ứng dụng nghiên cứu tế bào mầm tạo sinh vơ tính 3.Xét nghiệm phát quan hệ huyết thống, truy tầm tông tích, phát thủ phạm Kỹ thuật DNA Marker Một người da ñen (gọi "X") sinh Anh ñã bỏ qua sống với cha Ghana Sau xin qua trở lại Anh để sống với mẹ (gọi "M") ba người anh chị em ruột bị từ chối cho nhập cảnh người ta nghi ngờ bị thay người cháu hay người không thân thuộc với bà mẹ Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh xảy vào năm 1985, lúc xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) ñã ñược thực xác định bà mẹ có liên hệ với "X?", nhiên khơng thể loại trừ M hay dì "X?" Thắc mắc tưởng chừng bế tắc, khơng có cách giải quyết, may mắn Jeffereys cộng ñã ñược nhờ ñến lần ñầu tiên xét nghiệm dấu ấn DNA ñược áp dụng trường hợp Kết xét nghiệm xác định "X?" "X" "X?" có mang dấu ấn DNA từ M, đồng thời có chung dấu ấn DNA với đứa "M" thừa hưởng từ người cha Vậy dấu ấn DNA gì? Ngun tắc hoạt động xét nghiệm dấu ấn DNA nào? Những tiến phạm vi ứng dụng xét nghiệm dấu ấn DNA sao? DNA gen người có đến 30% chứa trình tự base lặp lại không mang mã có ý nghĩa chức Cũng trình tự base có ý nghĩa chức (gọi gen), trình tự base lặp lại di truyền từ cha mẹ sang theo ñịnh luật phân ly ñộc lập Mendel Tuy nhiên khác với gen, khó tìm thấy khác biệt trình tự base gen cá nhân, có nhiều trình tự base lặp lại giúp phân biệt cá nhân với nhân khác, thế, giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với hay khơng? Các trình tự base lặp lại gọi dấu ấn DNA Có hai loại dấu ấn DNA ñang ñược dùng xét nghiệm dấu ấn DNA là: Các tiểu vệ tinh (minisatellite) Ðó trình tự base lõi lặp lại, gọi tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi trình tự base lặp lại), có kích thước thay đổi từ 1.000 base (1 KB) ñến 30.000 base (30 KB) Các VNTRs diện rải rác nhiều vị trí gen, tiểu vệ tinh đa vị trí (multilocus minisatellite); Hay có vị trí gen, tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus minisatelite) Xét nghiệm dấu ấn DNA mà Jeffereys thực năm 1985 xét nghiệm phát tiểu vệ tinh đa vị trí kỹ thuật phát ña hình chiều dài ñoạn DNA gen bị cắt men cắt hạn chế (Restriction Fragments Lenght Polymorphism = RFLP) Kỹ thuật tóm tắt sau (hình 1): (1) Trước hết mẫu máu lấy từ người cần thử nghiệm ñể tách ñược bạch cầu, sau ly trích tồn bộ gen nguyên vẹn bạch cầu mẫu thử nghiệm; (2) Cắt đoạn gen ly trích men cắt hạn chế, loại men cắt nhận diện trình tự base đặc hiệu, nhờ ñó cắt ñoạn ñược gen thành mảnh DNA dài ngắn khác nhau, có mảnh chứa trình tự base lặp lại; (3) Ðiện di mẫu thử nghiệm ñể phân tách ñoạn DNA thạch agarose, sau chuyển đoạn DNA thạch qua màng nylon kỹ thuật thấm Southern (Southern blotting); (4) phát vị trí trình tự base lặp lại màng nylon cách lai với dị DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ đặc hiệu cho trình tự base lặp lại Trong thử nghiệm, Jeffereys ñã thiết kế dị DNA có mã số 33.6 33.15 Kết xét nghiệm trường hợp ñã cho thấy "X?" có 61 vị trí trình tự lặp lại ñặc hiệu với hai loại dò 33.6 33.15, tất 61 vị trí thấy diện ñược M (do "X?" ñã di truyền ñược từ "M") người "M" (do "X?" họ di truyền từ cha mình, tức chồng "M" dù khơng có mẫu thử nghiệm lấy từ ông này) Xét nghiệm phát tiểu vệ tinh đa vị trí, dùng kỹ thuật RFLP, nên ñược gọi ngắn gọn xét nghiệm RFLP Xét nghiệm ñược dùng nhiều xác ñịnh quan hệ huyết thống Xin dẫn thêm trường hợp bị chứng minh loạn luân Anh (ảnh 1) Kết xét nghiệm RFLP cho thấy mẹ ñứa bé "D" cha "F" có đến 62% vạch vị trí tiểu vệ tinh đa vị trí trùng nhau; đồng thời "F" "B" lại có đến 78% vạch trùng Chính nhờ mà xác ñịnh ñược "F" cha "D" ñồng thời cha "B", có nghĩa "F" vừa ông ngoại, vừa cha "D" Tuy nhiên xét nghiệm RFLP có hạn chế phải có mẫu thử nhiều tế bào để Kỹ thuật DNA Marker trích gen ngun vẹn (phải lấy khơng 10ml máu để tách đủ bạch cầu dùng ly trích gen) 4.Phân tích ña dạng di truyền số mẫu nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trrên cao su (Hevea brasiliensis) phương pháp RFLP – PCR (VŨ THỊ QUỲNH CHI ðại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2005 Hướng dẫn khoa học: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN, ThS PHAN THÀNH DŨNG.) Bệnh rụng Corynespora cao su bệnh nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây có tác hại lớn ñến kinh tế nhiều nước, ñặc biệt nước sản xuất cao su thiên nhiên Triệu chứng biểu bệnh biến thiên dễ nhầm lẫn với bệnh khác Do tìm hiểu phương pháp chẩn đốn, phát nhanh bệnh Corynespora cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước bệnh lây lan Những nghiên cứu giới cho thấy, nấm C cassiicola có phân hóa lồi, C cassiicola dịng vơ tính cao su khác có khác biệt di truyền, nhờ nhận biết C cassiicola qua khả gây bệnh cho dịng vơ tính cao su khác Việc nghiên cứu ña dạng di truyền nấm C cassiicola cao su nước ta việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ ña dạng di truyền C cassiicola với tính kháng số dịng vơ tính cao su trồng Việt Nam Kết đạt : • Nhận diện triệu chứng ñặc trưng bệnh rụng Corynespora cao su • Thu thập mẫu bệnh 32 dịng vơ tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đốn phân tích đa hình vùng ITS nấm C cassiicola phương pháp RFLP – PCR dịng vơ tính Qua phân tích đến kết luận: • Quy trình phản ứng PCR nấm C cassiicola Silva cộng (1998) sử dụng ñể nghiên cứu vùng ITS nấm C cassiicola Việt Nam • Chẩn đốn bệnh Corynespora cách nhận diện sản phẩm khuếch ñại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A ITS B không hiệu quả, sản phẩm thu nhận khơng đặc trưng cho nấm C cassiicola • Khơng tìm thấy ña hình vùng ITS mẫu nấm nghiên cứu sử dụng phương pháp RFLP – PCR với enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI • Các mẫu nấm dùng phân tích thuộc chủng nấm C cassiicola chủng gây bệnh cao su Việt Nam Amplified Fragment Length Polimorphism (AFLP) Khái niệm AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) đa hình chiều dài đoạn DNA ñược khuếch ñại chọn lọc, kỹ thuật kết hợp RFLP PCR 1975 Vos cộng ñã phát minh kỹ thuật 1993 Vos Zabeau cho protocol ñầu tiên cho kỹ thuật AFLP nhấn mạnh quan trọng việc làm khiết hai enzyme sử dụng (EcoRI MseI), sau chuẩn bị adapter thiết kế primer cách thận trọng Ngày cải tiến khán nhiều với cơng dụng sau: - Cơng cụ có hiệu phát tính chất đa hình - Xây dựng ñồ di truyền có mật ñộ cao genome Kỹ thuật DNA Marker 10 - Xây dựng ñồ DNA marker có hiệu so với marker khác (Vos cộng tác viên 1995) - Khám phá clone genome, vd YAC - Fingerprinting ñoạn DNA ñã ñược cloned cosmid, P1, BAC, YAC (Vos cộng tác viên 1995) AFLP marker dựa khuếch ñại DNA kỹ thuật PCR AFLP marker trội -Marker trội: marker phân biệt cá thể ñồng hợp tử cá thể dị hợp tử Kỹ thuật AFLP Nguyên tắc kỹ thuật AFLP giống RFLP, điểm khác biệt AFLP khơng cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), thực hành nhanh NÔI DUNG CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP 1.1 Cắt DNA RE có bổ sung adaptor đặc hiệu tạo nên đoạn có đầu mút giống nhau, ñặc trưng cho mồi ñã chọn trước 1.2 Nhân ñoạn DNA kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác QUI TRÌNH THỰC HIỆN AFLP: bước 1.1 Tách chiết tinh DNA 1.2 Cắt mẫu DNA nghiên cứu cặp RE chọn lọc có bổ sung adaptor (trình tự nối mạch đơi- ðoạn adaptor gồm phần: phần trình tự lõi phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme ) phù hợp 1.3 Tiến hành PCR ngắt quãng với hai loại mồi ñặc hiệu primer 1+1 nucleotid primer 2+ nucleotid 1.4 Phân tích kết phần mềm thông dụng, lập dendrogram ñể xác ñịnh khác biệt di truyền ña dạng sinh học mẫu nghiên cứu Kỹ thuật DNA Marker 11 Ứng dụng So sánh đa hình AFLP hai nhóm cá thể cá tra (pangasius hypophthalmus) có trọng lượng phân biệt NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu: Mẫu cá tra ñược thu từ trung tâm Cái Bè – Tiền Giang, ñược bảo quản cồn 700, 40C cho ñến sử dụng (Mẫu Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I cung cấp) Từ 282 mẫu cá, chọn 10 mẫu Kỹ thuật DNA Marker 12 có trọng lượng lớn (trung bình 3,9 gam) 10 mẫu có trọng lượng nhỏ (trung bình 2,2 gam) Tách chiết DNA: DNA cá tra ñược tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3] Cụ thể: khoảng 50 mg mẫu ñược rửa cồn 0,9 ml ñệm TLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0) Thêm vào 0,9 ml ñệm phá tế bào (10 mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS, pH 8.0) Bổ sung 5µl enzyme protease K (20 mg/ml), ủ 550C 14-16 ðể mẫu nhiệt độ phịng bổ sung 4µl RNAase A (10mg/ml), ủ 370C 30 phút Thêm vào 0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM Ammonium Acetate), trộn ñều ủ ñá 30 phút Ly tâm lần ñể loại tủa protein thu dịch DNA Kết tủa DNA 0,9 ml isopropanol, ñể -200C giờ, ly tâm thu tủa DNA Rửa DNA 0,75 ml cồn 700 Hòa tan DNA 100µl đệm TLE Bảo quản 40C để sử dụng cho thí nghiệm Kỹ thuật AFLP: AFLP ñược tiến hành theo Liu cs [6] Các bước phương pháp tóm tắt sau: DNA ñược cắt enzyme EcoRI MseI: 300 ng DNA, 3U enzyme EcoRI MseI 370C Sau đó, đoạn DNA cắt ñược gắn vào adapter EcoRI MseI nhờ enzyme T4 DNA ligase 200C Các ñoạn DNA tạo trước hết ñược khuếch ñại PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc (preselective primer) sau mồi chọn lọc (selective primer) Bảng 1: Trình tự adapter mồi sử dụng phân tích AFLP Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, thể tích formamide dye thêm vào phản ứng Mẫu biến tính nhiệt 950C phút, ñặt vào ñá Sản phẩm AFLP ñược ñiện di gel polyacrylamide biến tính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE buffer ) Bản gel ñược cố ñịnh axit axêtic 10%, nhuộm bạc nitơrat 1%, natricacbơnat 2,5% cố định lại axit axêtic 10% [1] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN DNA hệ gen từ hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn nhỏ ñược tách chiết Kết ñánh giá ñiện di agarose cho thấy chất lượng DNA ñạt tiêu chuẩn cho phân tích ðể chuẩn bị khn DNA cho AFLP, DNA hệ gen cắt đồng thời enzyme giới hạn EcoRI có trình tự nhận biết base pair (G(AATTC) MseI có trình tự nhận biết base pair (T(TAA) Thành cơng kỹ thuật AFLP phụ thuộc vào cắt hoàn toàn phản ứng cắt chất lượng DNA Các ñoạn DNA tạo ñược gắn với adapter EcoRI MseI để tạo thành khn cho phản ứng khuyếch ñại sau này, ñồng thời ngăn cản tái kết hợp ñoạn DNA vừa ñược tạo Trước hết, số ñoạn DNA tạo ñược nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc Kỹ thuật DNA Marker 13 (PSP - preselective primers) PSP chứa trình tự: i) bổ trợ với adapter; ii) bổ trợ với trình tự nhận biết enzyme giới hạn; iii) nucleotid Các ñoạn DNA mà nucleotid liền kề với trình tự nhận biết enzyme giới hạn bổ trợ với nucleotid PSP ñược nhân lên (theo xác suất phần tư số ñoạn DNA ñược nhân lên) Tương tự, ñoạn DNA mà nucleotid liền kề với trình tự nhận biết enzyme giới hạn bổ trợ với nucleotid mồi chọn lọc (SP - selective primers) ñược nhân lên Theo xác suất qua lần PCR, 1/256 số ñoạn DNA ñược nhân lên ðối với cá thể mang ñột biến nucleotid bổ trợ với PSP SP (so với mẫu chuẩn), ñoạn AND khơng nhân lên Do đó, điện di vị trí khơng xuất băng 54 tổ hợp mồi sử dụng để phân tích đa hình AFLP hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn nhỏ Mỗi tổ hợp mồi tạo từ 27 đến 94 băng, trung bình 55 băng tổ hợp mồi Trong đó, cao tổ hợp mồi E-ACC/M-CAG: 94 băng/mẫu, thấp tổ hợp mồi E-ACG/M-CTG: 27 băng/mẫu Trong 54 tổ hợp mồi nghiên cứu, 11 tổ hợp mồi không tạo băng AFLP 43 tổ hợp mồi tạo 204 băng AFLP Tỷ lệ băng đa hình mẫu cá tra 1,35% cho thấy đa hình AFLP mẫu loài thấp Kết phù hợp với phân tích Liu cs [6] tiến hành cá tra Mỹ (Ictalurus punctatus Ictalurus furcatus) Tỷ lệ băng đa hình lồi I punctatus 3,4 %, I furcatus dao ñộng từ 1,7% -3,3% [6] ða hình AFLP tổ hợp mồi EACA/M-CAG nhóm cá lớn nhỏ thể hình Hình ða hình AFLP nhóm cá lớn nhóm cá nhỏ tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG 1,2: Băng AFLP xuất nhóm cá với tần số khác Tổng cộng có 204 băng AFLP ñược tạo từ 43 tổ hợp mồi, trung bình 4,74 băng AFLP/mồi Tần suất xuất băng AFLP hai nhóm cá tra khác nên chúng tơi tính tần số khác biệt hai nhóm Kết thể bảng Bảng 2: Tần số khác biệt băng AFLP hai nhóm cá tra Kỹ thuật DNA Marker 14 Những băng AFLP có tần số khác biệt 50% ñược thể bảng Bảng 3: Các băng AFLP có tần số khác biệt 50 % Kết cho thấy, có băng AFLP có tần số khác biệt 50%, chiếm 3,92% tổng số băng AFLP ðể kiểm tra mức ñộ ổn ñịnh tin cậy băng AFLP, chúng tơi tiến hành phân tích băng AFLP với số lượng mẫu lớn (18 mẫu) Kết cho thấy, băng AF 6-1 tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT băng AF 7-4 tổ hợp mồi E- ACC/M-CAA ñạt ñộ chênh lệch nhóm cá thí nghiệm 56% 50% Do có tính ổn định tương đối, rõ nét ưu cho nhóm cá có trọng lượng nhỏ, hai băng AFLP tách dịng đọc trình tự nhằm mục đích xây dựng thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng trưởng cá tra KẾT LUẬN Phân tích đa hình AFLP cá tra 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ đa hình lồi tương đối thấp, trung bình 1,35% Tuy nhiên, tỷ lệ ñủ tin cậy việc xác định thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế So sánh đa hình AFLP nhóm cá tra có trọng lượng cực cho thấy băng AFLP có tần số khác biệt 50% Tuy nhiên có băng: AF 7-4 tổ hợp mồi E-ACC/M- CAA AF 6-1 tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn định, giữ ñược tỷ lệ kiểm tra số lượng mẫu lớn Hai băng ñược sử dụng ñể tuyển chọn lại quần ñàn Ưu nhược điểm - Ưu điểm AFLP nhanh, đơn giản khơng phức tạp RFLP khảo sát tồn gen (kỹ thuật kỹ thuật địi hỏi lượng DNA ban đầu, khơng cần biết trước trình tự đích độ lặp lại phản ứng cao, mồi sử dụng khơng cần đặc hiệu lồi (các mồi thương mại dùng cho hầu hết lồi) Kỹ thuật DNA Marker 15 - Nhược điểm • AFLP marker trội, ñiều làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp • C G primer nhiều, DNA fragment khuếch đại • Khích thước genome nhỏ, số fragment khuếch đại Random Amplification Polymorphic DNA (RAPD) Khái niệm: RAPD (ñọc "rapid") chữ viết tắt Random Amplification of Polymorphic DNA nghĩa đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên William (1990), Welsh cộng (1991) phát minh Là phương pháp dựa kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá tính đa hình ñoạn DNA ñược nhân ngẫu nhiên Nguyên tắc Nguyên tắc phản ứng RAPD nguyên tắc phản ứng PCR thơng thường Tuy nhiên, sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt ñộ bắt cặp mồi thấp ñể tạo điều kiện bắt cặp khơng nghiêm ngặt o o Nhiệt ñộ bắt cặp phản ứng 30 C-36 C RAPD sử dụng mồi oligonucleotide ñược tổng hợp ngẫu nhiên từ 9-12 base nên dễ dàng tìm ñược ñoạn tương ñồng mạch ñơn DNA gen Các ñoạn mồi bắt cặp ngẫu nhiên với hai mạch đối diện mạch khn DNA khoảng cách khuếch đại (dưới 3000bp) cho đoạn DNA có kích thước khác sau khuếch đại Tính đa dạng thu nhờ RAPD đáng tin cậy, có thay đổi base nitơ ngăn cản việc tiếp hợp mồi DNA mạch khn Sự đoạn nhiễm sắc thể thêm bớt ñiểm gắn mồi xen vào gen làm thay đổi kích thước đoạn DNA khuếch đại Tuỳ vào nhóm lồi thực vật hay vi sinh vật mà ñoạn mồi ngẫu nhiên ñược thiết kế ñặc dụng Sản phẩm PCR gồm nhiều đoạn DNA có kích thước từ 2-100 bp Kết sau ñiện di sản phẩm RAPD phát ñược khác phổ ñoạn DNA ñược nhân Sự khác ñược gọi tính đa hình Tính đa hình ñoạn DNA ñược phát ñiện di sản phẩm PCR gel agarose hay polyacrilamid, sau nhuộm ethidium soi đèn tử ngoại Tính đa hình mẫu RAPD-PCR thay ñổi hai vùng gắn primer (ví dụ đột biến điểm) thay ñổi (thêm ñoạn, ñoạn, ñảo ñoạn) ñoạn DNA ñược nhân lên, gây thay đổi kích thước hay cản trở q trình nhân lên DNA Tính đa hình thể thơng qua có hay vắng mặt vạch điện di tương ứng Tính đa hình nhận do: phân tích đa hình di truyền kỹ thuật RAPD, cá thể có genome hồn tồn giống làm phản ứng PCR-RAPD với mồi cho băng giống ðoạn mồi ngẫu nhiên bám vào vị trí có trình tự nucleotide bổ sung phân tử DNA genome Với ñặc ñiểm ngắn nên xác suất đoạn mồi có điểm gắn phân tử DNA khn lớn Theo tính tốn, mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide xác suất bắt cặp 1x410 = 1.048.576 Ở lúa, DNA nhân đơn bội có khoảng 550.000kb =550.000.000 bp Kỹ thuật DNA Marker 16 Như vậy, với mồi ngẫu nhiên có 524 vị trí bắt cặp với mồi nghĩa có 262 đoạn DNA nhân bội Do kỹ thuật RAPD sử dụng loại mồi ñồng cho ñầu ñoạn DNA cần nhân bản, ngồi hai đoạn mồi phải kết cặp sợi ñơn khác chuỗi DNA phải “ñi” theo chiều hướng vào nên xác suất phải nhỏ ñi nhiều Xác suất cịn nhỏ điều kiện thơng thường kỹ thuật PCR tổng hợp ñoạn DNA không dài 5000 nucleotide dẫn ñến việc phản ứng PCR hiệu hai ñoạn mồi kết cặp với DNA genome vị trí khơng xa 5000 bp Trong thực tế, số lượng nhỏ nhiều cịn phụ thuộc vào độ dài ñoạn ñược nhân bội xếp trình tự bắt cặp với mồi DNA genome lúa Quy trình thực - Kỹ thuật RAPD thực theo bước sau: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA máy PCR ðiện di gel agarose gel polyacrylamid Xác định tính đa dạng di truyền phần mềm thông dụng (NTSYS-PC, GELCOMPAR, …) Các số liệu cho thấy gần gũi cách biệt di truyền mẫu nghiên cứu Ưu nhược điểm • RAPD phương pháp phân tích nhanh, rẻ tiền RFLP sử dụng lượng mẫu DNA nhỏ (25ng) Phương pháp không địi hỏi việc phân lập đọc trình tự, cho phép phát nhiều locus lúc Kỹ thuật DNA Marker • • • • • • • • • • • • • 17 RAPD marker tỏ hiệu việc thiết lập ñồ gen họ tùng bách RFLP marker khơng thể dùng cho mục đích hàm lượng DNA mô giao tử lớn thấp địi hỏi thời gian dài ñể thu ñược quần thể F2 Mỗi primer cung cấp số liệu từ nhiều vị trí genom sai khác có tần xuất xuất thấp mẫu có quan hệ gần gũi ñược phát nhanh so với việc phân tích locus ñơn Phương pháp nhạy cảm với ñiều kiện phản ứng chất lượng DNA, nồng ñộ muối ví dụ Mg2+ tỷ lệ mồi đoạn mẫu (template) kết khơng phải ln trước sau Các RAPD marker ñược sử dụng việc lập ñồ gen so sánh nhân dịng tính đặc thù thấp khơng ổn định chúng Việc so sánh genom lồi có quan hệ gần gũi địi hỏi mẫu dị (probe) nhận dạng vùng đồng dạng nhóm phân loại Tuy nhiên thiếu tính đồng dạng genom lại cho phép RAPD marker dùng cho việc lập đồ gen lồi đa bội, các mẫu copy ñơn RFLP lại ñược lai với nhiều trình tự tạo band phức tạp khó xác ñịnh allele thay Việc sử dụng marker rõ ràng để xác định loci có copy cần thiết việc nhân dòng Rất nhiều trình tự nhân lên nhờ PCR có chứa đoạn lặp lại rải rác khơng thể dùng làm mẫu lai Các ñoạn mồi ngắn dùng ñể xác ñịnh RAPD marker nhân lên vài trình tự từ vùng khơng liên kết Vì marker khơng thể sử dụng để ñánh giá dòng từ nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men hay thư viện mẫu chí có liên kết gần gũi chúng với gen biết Hiện tượng phát sinh tính đa hình giả đơi thấy phân tích RAPD khơng chắn đạon kích thước từ hai mẫu DNA khác có thực tạo từ vị trí DNA genome hay khơng Sự di truyền tính trội số lượng allele thấp hạn chế RAPD marker Các marker trội mang ½ thơng tin di truyền quần thể F2 tính trạng đồng trội Một marker có ích cho chương chọn tạo giống chúng phân ly số tổ hợp lai RFLP loci có vài allele dễ nhận biết Số allele cao (5-8) ñã ñược quan sát rau diếp cá lồi có quan hệ gần Ngược lại locus RAPD thường có allele thể qua có hay vắng mặt vạch tương ứng Sự ñồng trội RAPD marker thường gặp Tính đa ñộ dài ñoạn cắt ñược nhân lên PCR kết việc ñoạn hay chèn ñoạn xảy vùng gắn mồi Gần ñây, phương pháp trộn ñoạn mẫu (template mixing) cho phép RAPD marker đồng trội ñược xác ñịnh ñã ñược giới thiệu Phương pháp dựa xuất band nhân đơi khác bố mẹ thể dị hợp tử, phân ly chậm bố mẹ vốn ñặc trưng RAPD marker ñồng trội Các band khơng phải bố mẹ thu ñược việc trộn ñoạn mẫu DNA bố mẹ trước chạy PCR Việc cho phép chọn lọc ñược RAPD marker ñồng trội trứoc phân tích phân ly Khi có nghi ngờ việc phân biệt band phân ly chậm nhanh, ñoạn mẫu bố mẹ ñược trộn lẫn ñể xác ñịnh band kép dị hình số band thể dị hợp tử F2 để khẳng định kiểu hình marker Mặc dầu có hạn chế, nhiều nghiên cứu ñã khẳng ñịnh RAPD phương pháp hữu hiệu để xác định kiểu gen, phân tích quần thể phả hệ, nghiên cứư phát sinh loài lập ñồ di Kỹ thuật DNA Marker 18 truyền nhiều lồi khác lúa, đậu tương, lúa mạch ñen, ñại mạch, ñậu hà lan, hoa hồng, v.v Ứng dụng Sử dụng phương pháp ñể nhận dạng mức ñộ phân tử, khảo sát ña dạng sinh học, phân lập gen đột biến, xác định tính trạng liên kết hay di truyền, chẩn đốn bệnh Ứng dụng cụ thể: nghiên cứu đa hình số giống dâu tằm NGHIÊN CỨU ðA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPD Nguyễn Thị Thanh Bình, Hồng Thị Hằng, Nông Văn Hải Viện Công nghệ Sinh học I MỞ ðẦU Ngày nay, việc sử dụng thị phân tử DNA đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình độ dài ñoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), lặp lại chuỗi ñơn giản-SSR (Simple Sequence Repeats) hay cịn gọi tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu ña dạng sinh học ñộng vật, thực vật vi sinh vật ngày phổ biến giới Việt Nam [4, 5, 7, 8] So sánh với phương pháp truyền thống, phân loại nghiên cứu đa hình thị phân tử cho kết có độ tin cậy cao [2] Kỹ thuật RAPD William cs, 1990 [8] phát triển sở PCR sử dụng số ñoạn mồi ngẫu nhiên Kỹ thuật ñã ñược ứng dụng kết hợp với số kỹ thuật khác ñể phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền cá thể tằm dâu [1, 2, 5, 10,11] Ở Việt Nam chưa có cơng trình đề cập tới vấn đề này, nghề nuôi tằm nghề truyền thống ñất nước, ñang ñược ñẩy mạnh phát triển, việc phân loại đánh giá đa hình dựa vào đặc điểm sinh học hình thái, cịn có hạn chế định Trong báo chúng tơi xin trình bày số kết sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa hình số giống tằm dâu ni Việt Nam II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu gồm tám giống tằm ñang ñược dùng tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ðS 1, ðS 2, BM, THT, VYD, có bốn giống sử dụng nhiều vài năm gần đây, hai giống địa phương thuộc tập ñoàn gốc ña hệ: vàng chấm [VC] ðồ Sơn [ðS] hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình [TTB] trắng Mai Lĩnh [TML] Tất giống tằm Trung Tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ Trung Ương, Xí nghiệp Giống Tằm Cấp I Mai Lĩnh Xí nghiệp Giống tằm Thái Bình cung cấp Hố chất : EDTA, Tris-HCl, SDS, Proteaza K, RNaza, chloroform, phenol, NaCl, agaroza hãng Sigma, Merck, Amersham Phamacia Biotech, Fermentas Các loại máy móc chun dụng thuộc phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Gen đặt Viện Cơng nghệ Sinh học Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA theo Wiliam cộng sự, tham khảo thêm tài liệu số tác giả khác [ 8, 9, 10] cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Xác định nồng độ DNA phương pháp ño quang phổ, kiểm tra DNA gel agaroza 0,8% quan sát ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh máy Geldoc Polaroid Nhân gen kỹ thuật PCR với ñoạn mồi hãng Genset Singapore Biotech tổng hợp Tổng thể tích dùng cho mẫu 25 µl Chu trình nhiệt theo tài liệu Zhou Zheyang cộng [6] Sản phẩm PCR 19 Kỹ thuật DNA Marker kiểm tra gel agaroza 0,8% 1,3% -Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí nhiệm vụ thường xun: đề tài cấp Viện Cơng nghệ Sinh học Phân tích kết chương trình phần mềm NTSYS phiên 2.0 Hệ số ñồng dạng di truyền ñược tính theo cơng thức Nei Li năm 1979 [3] III KẾT QUẢ Tách chiết làm DNA từ mẫu tằm Mẫu nghiền mịn hoà tan dung dịch ñệm, thành tế bào màng nhân ñược phá vỡ, giải phóng DNA Tiếp theo bổ sung proteinaza K để phân huỷ hồn tồn protein liên kết Sau đó, dùng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol loại bỏ tạp chất ly tâm thu DNA Loại ARN RNaza 37oC Sản phẩm DNA ñược chạy ñiện di kiểm tra, ñánh giá gel agaroza 0,8% ño OD máy ño quang phổ, bảng hình kết thu Kết cho thấy, sản phẩm nhận ñược cho vạch gọn có trọng lượng phân tử lớn 21,6 kb, tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm dao ñộng từ 1,781 ñến 2,025 cho biết DNA thu có đủ độ ñể làm nguyên liệu cho PCR nghiên cứu DNA ñược bảo quản lạnh dung dịch TE Ảnh ðiện di DNA 1-5 : DNA mẫu M : DNA λ/EcoRI+HindIII Bảng Tỷ số OD260 nm/OD280 nm nồng ñộ DNA PCR với DNA cuả tằm dâu Chúng tơi tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng nhân gen ñối với mồi nghiên cứu [6 ], sàng lọc từ 20 ñoạn mồi ngẫu nhiên ñể chọn ñoạn phù hợp cho tằm Tiếp theo thực PCR với giống tằm, kết nhận trình bày bảng Kỹ thuật DNA Marker 20 Bảng 2: Kết RAPD giống tằm nghiên cứu [ Cột thị RAPD: chữ số ký hiệu ñoạn mồi, kích thước băng Số 1:phân ñoạn DNA ñược nhân Số 0: phân ñoạn DNA không ñược nhân Giống tằm 1: TTB, 2: TML, 3: VC, 4: ðS1, 5:ðS2, 6: BM, 7: THT, 8: VYD] Các băng nhân ñược sử dụng thị RAPD bao gồm hai loại đơn hình đa hình Băng đơn hình có mặt tất giống nghiên cứu, cịn băng đa hình xuất giống lại vắng mặt giống khác Trong tổng số 67 băng nhận có 26 băng đơn hình, chiếm 38,81% 41 băng đa hình, chiếm 66,19%, kích cỡ băng từ 100bp đến 3500bp Trong giống tằm nghiên cứu có giống lưỡng hệ tương đối xa quan hệ di truyền, cịn giống đa hệ địa phương có họ hàng gần gũi với nhau, tỷ lệ băng đơn hình mức trung bình thấp, tỷ lệ băng đa hình đạt mức trung bình cao Các băng đa hình sở phân biệt giống với nhau, có băng đa hình xuất giống mà không xuất 21 Kỹ thuật DNA Marker giống khác băng 0P019-1200bp 0P019-1000bp thấy giống TML, băng 0P019-800bp giống TTB nhóm đa hệ xuất giống BM Với mồi 0P016, băng 300bp quan sát thấy giống TTB, cịn băng 400bp có giống TML VC Hình 2: Sản phẩm PCR mồi OP 13 giống tằm nghiên cứu Giếng M: DNA λ/EcoRI+HindIII Các giếng khác: mẫu giống tương ứng 1-TTB 5-TML 6-VC 8-ðS 9-ðS 10-BM 11- THT 13- VYD Từ số liệu thu ñược, chúng tơi phân tích mối tuơng quan di truyền giống tằm nghiên cứu chương trình phần mềm NTSYS phiên 2.0 trình bày bảng Bảng cho thấy, giống TTB có hệ số đồng dạng di truyền dao ñộng khoảng 0,547 ñến 0,703, thấp giống nghiên cứu, giống TML số cao hơn, biến ñổi từ 0,766 ñến 0,906 Các giống nhóm đa hệ có hệ số ñồng dạng di truyền thay ñổi từ 0,766 ñến 0,984 Giống ðS1 ðS2 có số cao 0,984, có khả giống ni hai ñịa phương khác Bảng Hệ số ñồng dạng di truyền giống tằm nghiên cứu Từ bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tơi xây dựng phân loại giống tằm biểu diễn hình Dựa sơ đồ hình biểu thị đa hình DNA giống tằm nghiên cứu, nhận thấy giống tằm khảo sát chia thành hai nhóm lớn, cụm lại mức độ 0,54, nhóm thứ có giống TTB, cịn nhóm thứ hai giống cịn lại, cụm mức ñộ 0,79 chia thành hai phân nhóm bậc I Phân nhóm bậc I thứ gồm hai giống TML VC, cụm lại mức 0,90 Phân nhóm bậc I thứ hai giống thuộc ña hệ lại chia thành phân nhóm bậc hai Riêng ðS1 ðS2 phân nhóm bậc cao Hình Cây phát sinh chủng loại giống tằm Kỹ thuật DNA Marker 22 IV KẾT LUẬN ðã phân tích tính đa dạng di truyền giống tằm dâu nuôi Việt Nam kỹ thuật RAPD với ñoạn mồi, kết nhận ñược 67 băng DNA nhân có 26 (38,8%) băng ñơn hình 41 (61,2%) băng ña hình ðoạn mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101 có tỷ lệ băng đa hình thấp Kết phân tích NTSYS-SIMUAL cho thấy giống tằm nghiên cứu có mối tương đồng di truyền khoảng 0,547 đến 0,984 (Simple Sequence Repeat - SSR) Kỹ thuật SSR • • • • Các trình tự lặp lại ñơn giản (Simple Sequence Repeat) hay ñược biết ñến microsaterlite (vi vệ tinh) ñoạn ngắn DNA có chứa từ đến cặp base có trình tự lặp lại liên tiếp số trình tự lặp lại dao động từ đến 40 Các trình tự lặp lại đơn giản phổ biến hệ gen ñộng vật thực vật Chúng phân bố hệ gen có tính đực trưng cho loài SSR phổ biến genom lúa SSR kỹ thuật dựa phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu ñầu tiên nhận dạng trình tự lặp lại đơn giản Sau trình tự lặp lại đơn giản nhận dạng, bước xác định trình tự DNA thiết kế primer Các trình tự gần kề trình tự lặp lại tạo nên SSR SSR primer sau sử dụng tương tự RAPD primer Kỹ thuật DNA Marker 23 Ưu điểm: • • • • Kỹ thuật SSR có tiềm lớn có khả phát tính đa hình cao, phân biệt sai khác mà khơng xác định marker khác RAPD RFLP SSR primer có từ đến 12 locus (tuỳ vào lồi) tổ hợp ống phản ứng PCR cho phép ñồng thời ghi nhân kiểu gen có nhiều locus Phản ứng khơng q tốn kém, tiêt kiệm thời gian hố chất Primer sử dụng SSR dài mồi RAPD dựa trình tự đặc trưng tỏ ñáng tin cậy phát locus thích hợp cho việc nghiên cứu đồ gen Marker SSR locus ñặc trưng, ña allele nên cung cấp nhiều thơng tin có ích so viẹc phát thay đổi trình tự SSR loại marker đồng trội nên nhanh chóng thay RFLP RAPD trở thành công cụ hữu hiệu ứng dụng chọn giống thực vật nghiên cứu di truyền Kỹ thuật DNA Marker 24 Nhược điểm: • • • Nhược điểm phương pháp q trình thiết kế mồi đắt, loại mồi đặc trưng cho locus đa hình ðể xây dựng cặp mồi đặc hiệu cần tách dịng đọc trình tự số lượng lớn đoạn ADN genom có chứa SSR Hiện nay, số lượng primer thiết kế cho loại trồng hạn chế, làm giảm hiệu SSR việc lập ñồ gen Một vấn ñề khác thường gặp phải sử dụng SSR việc xác ñịnh quan hệ allele với marker phân tử rât khó SSR phân bố ngẫu nhiên genom có tập trung lại tâm ñộng hay eo thứ cấp nhiễm sắc thể ðiều hạn chế việc sử dụng mẫu dò nhiều locus phân tích liên kết di truyền nghiên cứu quần thể Tài liệu tham khảo • • PGS.TS.Khuất Hữu Thanh-ðại học Bách Khoa Hà Nội – Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen – Trang 151 – NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang – Di truyền phân tử.Những nguyên tắc chọn giống trồng – Trang 93 – NXB Nông nghiệp  ... độ cao genome Kỹ thuật DNA Marker 10 - Xây dựng ñồ DNA marker có hiệu so với marker khác (Vos cộng tác viên 1995) - Khám phá clone genome, vd YAC - Fingerprinting ñoạn DNA ñã ñược cloned cosmid,... biết DNA thu có đủ ñộ ñể làm nguyên liệu cho PCR nghiên cứu DNA ñược bảo quản lạnh dung dịch TE Ảnh ðiện di DNA 1-5 : DNA mẫu M : DNA λ/EcoRI+HindIII Bảng Tỷ số OD260 nm/OD280 nm nồng ñộ DNA PCR... lai với mẫu dị DNA (được ñánh dấu phóng xạ) liên kết với locus ñặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể tạo phân ñoạn cắt khác Kỹ thuật DNA Marker T-RFLP method Kỹ thuật DNA Marker Ưu nhược