THỰC tập môn hóa SINH

Trường ĐHKH-Huế Khoa Sinh Học Báo cáo THỰC TẬP MÔN HÓA SINH Huế, 11/2010 Bài ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ I Theo phương pháp Bertrand Tất nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự điều kiện xác định có 2+ khả nămg khử Cu thành kết tủa Cu2O Vì vậy, phương pháp dùng để định lượng loại aldose, cetose, disaccharide có tính khử Khi dùng phương pháp này, muốn có kết tốt, cần phải đảm bảo điều kiện sau: Loại Protein chất khác khỏi dung dị ch cần nghiên cứu cách dùng dung môi thủy ngân, base acetate, hỗn hợp CuSO4 NaOH (1VCuSO4 8% 1V NaOH 1.25% ) THời gian đun phút kể từ có bọt khí xuất Hàm lượng đường trọng dịch nghiên cứu lấy ước tính khoảng khơng q 160mg tốt 10-90mg pha loãng mẫu đặc Phải bảo vệ kết tủa Cu2O khơng bị oxyl hóa lớp khơng khí bề mặt - Ngun tắc: Khi đun sôi dịch kiềm Cu2+ vớ i dung dịch đường t ạo thành k ết tủa Cu2O, sau r ửa nước, hòa tan kết tủa Cu2O Fe2(SO4)3, Cu2+ chuyển thành Cu+ Fe3+ chuyển thành Fe2+ 2+ Chuẩn độ Fe dd KMnO4 0.1N biết l ượ ng KMnO4 dùng để tích lượng đồng Tử lượng đồng ấy, đối chiếu bảng cho sẵn tính lượng đường mẫu Các phản ứng sau: Cu2+ Cu+ Phản ứng Fehling Phản ứng kết tủa Cu2O: Cu2O + Fe2(SO4 )3 + H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Phản ứng chuẩn độ dd KMnO4 0.1N 10 FeSO4 + 2KMnO4 + H2SO4 5Fe2(SO4)3 Đối tượng, hóa chất, thiết bị 2.1 Đối tượng Quả Hồng 2.2 Hóa chất Dung dịch Fehling Fe 2(SO4)3: 5g Fe 2(SO4) + 20ml H2SO4 đậm đặc cho nước cất đến 90ml kiểm tra dd KMnO4 0.1N có màu hịng nhạt bền 30 giây Thêm nước cất đủ 100ml 2.3 Thiết bị Hệ thống hút lọc chân khơng Bình tam giác, phễu, chày cối sứ Giấy lọc, cân (chính xác 0.001g) II Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mẫu Cân 2gram cho vào cối sứ, thêm nước cất ngiền thành dạng chất đồn thể Cho 20ml nước cất vào, tiếp tục ngiền để lắng, lấy phần nước rửa cối khoảng lần Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng Sau định mức lên 100ml Phản ứng Fehling: Cho vào bình tam giác 5ml dịch lọc 20ml fehling, đậy bình phễu nhỏ đun sơi Khi thấy bọt khí xuất có kết tủa đỏ gạch tính thời gian phút, để nguội cho kết tủa lắng Rửa kết tủa Cu2O Tiến hành rửa phễu lọc Bunce Dồn tủa phia Chiết từ từ dịch Fehling qua phễu lọc Quá trình rửa cần cho nước cất ấ m vào dần dần, để ngẵn tủa tiếp xúc với khơng khí Mở máy cho dị ch Fehling hút nhanh xuống bình, thử pH tủa bình tam giác khơng cịn tính kiềm kết thúc q trình rửa Hịa tan kết tủa Cu2O: Đặt phễu lọc lên bình nón, cho vào bình kết tủa 15ml Fe 2(SO4 )3 chả y từ từ lắc để tủa tan hoàn toàn kết t chưa tan hết cho thêm Dùng nước cất nóng rửa bình chứa tủa phễu lọc khơng cịn phản ứng acid kết thúc gian đoạn Chuẩn độ dd KMnO4 0.1N Cho dd KMnO4 0.1N lên buret chuẩn độ dịch hoàn thành xong, đến xuất màu hồng nhạt bền 20-30 giây, kết thúc trình chuẩn độ Ghi lại số ml dd KMnO4 0.1N dùng Tính kết 1ml KMnO4 0.1N tương đương 1mg Cu mCu có dịch là: g1 = Vc x6.36 Vc số ml KMnO4 0.1N dùng chuẩn độ Tra bảng ta có kết quả: BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG LIPID THƠ BẰNG MÁY SOXHLET 1.1 Mục đích yêu cầu Mục đích: giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hàm lượng lipid thô phương pháp dùng máy so màu Yêu cầu: phải nắm vững kiến thức lý thuyết phương pháp xác định hàm lượng lipid thô, thao tác tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận 1.2 Nguyên tắc Trong tế bào, lipid dạng tự liên kết Lipid tự tập trung chủ yếu quan dự trữ hạt, (ở thực vật) mơ mỡ (ở động vật) Chính để xác định hàm lượng lipid, ta chiết rút lipid khỏi nguyên liệu dung môi hữu Ở ta dùng petrol ether để trích lipid khỏi lượng mẫu biết trước (mẫu sấy khơ) máy soxhlet Khi trích li hết lipid khỏi mẫu, ta tiến hành sấy mẫu khô lại đến khơi lượng khơng đổi Từ xác định hàm lượng lipid thơ có 100g mẫu theo cơng thức: m − m X%= x100 m Trong đó: X hàm lượng lipid tính theo % m: trọng lượng mẫu đem chiết rút lipid m1: trọng lượng gói mẫu trước chiết rút lipid (kể khối lượng giấy lọc) m2: trọng lượng gói mẫu sấy khô tuyết đối sau chiết rút lipid 1.3 Hóa chất dụng cụ - Hóa chất: ethylic - Dụng cụ: cối chày sứ, giấy lọc, bếp điện, tủ sấy, soxlet 1.4 Tiến hành thí nghiệm - Bước 1: chuẩn bị mẫu Đối tượng thí nghiệm: đậu lạc + Đem mẫu cho vào cối chầy sứ nghiền mịn Sau đem sấy khơ nhiệt độ 100 – 105 C đến khối lượng không đổi + Mẫu sau sấy khô ta cân 5g cho vào giấy lọc (đã sấy khô tuyệt đối) gói lại ba gói, trọng lượng m1 - Bước 2: chiết rút lipid + Rửa làm khơ soxlet sau cho mẫu vào ống hình trụ cho mẫu chiếm khoảng 1/3 thể tích ống + Đổ ethylic vào ngập mẫu phía ống hình trụ cịn bình cầu ta đổ ethylic khoảng 2/3 bình Lắp kính bình cầu với ống hình trụ + Cho nước chảy vào vịi chảy vòi ống sinh hàn đồng thời bật bếp điện đun bình cầu chứa ethylic, ethylic bốc lên gặp lạnh ống sinh hàn ngưng tụ lại rơi vào ống hình trụ để hịa tan lipid tự có mẫu Ta điều chỉnh nhiệt độ bếp điện khoảng 40 – 500C cho khoảng 10 phút dung mơi ethylic chảy qua eo ống hình trụ tràn xuống bình hình cầu Ta đun vòng 10 -12 tách chiết hết lipid khỏi mẫu Cần ý trình đun nghĩ chừng phải cho dung môi ngập mẫu tắt bếp + Để thử lipid chiết hết hay chưa, ta lấy vài giọt dung mơi từ ống hình trụ nhỏ vào miếng giấy lọc, để khô mà thấy vết loang dung mơi khơng phân biệt với giấy trắng xem chiết hết lipid ta kết thúc trình chiết rút + Sau chiết rút xong ta lấy gói mẫu cho bay hết dung môi, đem sấy khô nhiệt độ 100 – 1050C vịng – 1,5h, sau tiếp tục sấy khô nhiệt độ thấp khối lượng không đổi Đem mẫu sấy khô đến khối lượng không đổi cân ta thu lượng m2 1.5 Kết nhận xét: - Kết quả: Qua trình chiết rút lipid từ mẫu ta thu kết sau: Mẫu (m=5g) Đậu lạc Nhận xét: Qua bảng kết cho ta thấy hàm lượng lipid đậu lạc cao Hàm lượng lipid chiếm gần lượng chất có củ Qua thí nghiệm giúp cho sinh viên nắm bước phương pháp chiết rút lipid máy soxlet, rèn luyện kỹ làm thí nghiệm BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 4.1.Mục đích yêu cầu Mục đích: Giúp sinh viên nắm phương pháp xây dưng đồ thị chuẩn protein phương pháp xác định hàm lượng potein mẫu Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, q trình tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận 4.2 Nguyên tắc Dựa vào phản ứng màu protein với thuốc thử Folin Do môi trường kiềm 2+ vớ i có mặt lượng nhỏ Cu protein tạo thành phức chất màu xanh Cường độ màu dung dị ch tỷ lệ thuậ n với hàm lượ ng protein có mẫu (có ngh ĩa hàm lượng protein mẫ u cao thi phức chất bắt màu đậm) Sau dùng máy so màu để xây dựng đồ thị chuẩn, thông qua đồ thị chuẩn ta tính hàm lượng protein có mẫu 4.3 Dụng cụ hóa chất - Dụng cụ: Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức - Hóa chất: Albumin + Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = + Dung dịch Na2CO3 2% tan NaOH 0.1N (dung dịch A) + Dung dịch CuSO4 1% (dung dịch B1) + Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B2) + Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B1, 0.5ml dung dịch B2 50ml dung dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước dùng 30 phút) + Thuốc thử Folin 0.5N Chú ý thuốc thử Folin đựng chai màu bảo quản lạnh, thuốc thử có màu vàng, dùng thấy có màu xanh cho vài giọt brom đun 15 phút có màu vàng trở lại dùng 4.4 Tiến hành thí nghiệm 4.4.1 Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein - Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân xác 1g albumin hịa tan nước cất định mức đến 100ml - Chuẩn bị dãy gồm ống nghiệm khơ sạch, sau cho vào ống nghiệm chất bảng sau: TT Hóa chất Nước cất (ml) 0.99 Albumin (ml) Dung dịch C (ml) Folin (ml) Hàm lượng albumin (µg/ml) 0.0 0.5 0.1 0.02 0.5 0.2 Khi cho dung dịch C vào ống nghi ệm ta l ắc để 10 phút, sau cho vào ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên 30 phút Sau đem so màu bước sóng 620nm ta thu kết sau: 0.4 Hàm lượng Albumin(µg/ml) OD 0.623 Sử dụng phần mềm oringin 7.5 xây dựng đồ thị chuẩn protein: Linear Regression for Data1_B: Y=A+B*X=0.0643+1.121X Parameter Value Error -A B -RSD N P -0.99995 0.00209