BÁO cáo THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM dược LIỆU và CHẾ PHẨM dược LIỆU kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây và cao đặc cần tây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Bộ Môn Dược Liệu BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM DƯỢC LIỆU Nhóm tổ lớp Q1K72 Thành viên: - Nguyễn Khắc Nhàn – MSV: 1701430 - Nguyễn Quyết Thắng – MSV: 1701504 - Nguyễn Thị Tuyết – MSV: 1701653 - Hà Thị Uyên – MSV: 1701657 - Nguyễn Anh Tuấn - MSV: 1701639 - tổ Hà Nội, 2021 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ I TỔNG QUAN A HẠT CẦN TÂY Tên gọi .4 Thành phần hóa học Công dụng 19 Các tiêu phương pháp kiểm nghiệm dược liệu quy định dược điển VN V .19 B CAO ĐẶC CẦN TÂY 25 Thành phần: Flavonoid (apigenin) 25 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm (theo dự thảo tiêu chuẩn) 25 II THỰC HÀNH 28 A HẠT CẦN TÂY 28 Kiểm nghiệm phương pháp cảm quan (mô tả) 28 Vi học (Bột) 29 Chất chiết 30 Tạp chất: 31 Tỷ lệ vụn nát .33 Tro toàn phần 34 Độ ẩm 34 Định tính 36 Định lượng 39 B KIỂM NGHIỆM CAO CẦN TÂY 40 Mô tả: 40 Mất khối lượng làm khô: .41 Định tính 42 Định lượng: .45 Phương pháp xây dựng đường chuẩn 45 pH 46 Độ đồng .47 III KẾT LUẬN .47 Danh mục tài liệu tham khảo 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây cần tây có tên khoa học Apium graveolens L., thuộc họ Cần (Apiaceae), có nguồn gốc từ châu Âu di thực vào Việt Nam Ngồi cơng dụng làm rau ăn, cần tây biết đến thảo dược sử dụng nhiều quốc gia để chữa bệnh Đặc biệt, hạt cần tây sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh gút bệnh khớp cho hiệu tốt Gần đây, hạt cần tây quan tâm với số tác dụng sinh học chứng minh thực nghiệm hạ huyết áp, chống ung thư, ức chế ngưng tập tiểu cầu, ức chế q trình đơng máu, bảo vệ gan đáng ý tác dụng liên quan đến bệnh gút hạ acid uric huyết thanh, tác dụng ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase enzym chìa khóa bệnh gút, chống viêm giảm đau Do hạt cần tây dược liệu tiềm sử dụng để phịng điều trị nhiều loại bệnh đặc biệt bệnh gút bệnh khớp Để nâng cao giá trị sử dụng đảm bảo chất lượng hạt cần tây, trình kiểm nghiệm chất lượng hạt cần tây chế phẩm chiết xuất từ hạt cần tây cần thiết Vì vậy, đề tài “Kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây cao đặc cần tây” thực dựa tiêu chuẩn, tiêu Dược điển Việt Nam V dự thảo tiêu chuẩn sở nhằm mục đích đảm bảo chất lượng nâng cao giá trị sử dụng dược liệu hạt cần tây cao đặc cần tây I TỔNG QUAN A HẠT CẦN TÂY Tên gọi Là chín phơi hay sấy khô cần tây (Apium graveolens L.), họ Cần (Apiaceae) Thành phần hóa học Có 90 chất phát có hạt cần tây (Apium graveolens L.) Các hợp chất phân nhóm dựa theo cấu trúc hóa học sau: - Flavonoid: 10 chất - Tinh dầu: 28 chất - Coumarin: 22 chất - Glycosid khác: 17 chất - Các nhóm hợp chất khác: 13 chất 2.1 Flavonoid Các flavonoid có hạt cần tây gồm 10 chất có khung cấu trúc trình bày hình 2.1 tổng kết bảng 2.1 Hình 2.1 Khung cấu trúc hợp chất flavonoid có hạt cần tây Bảng 2.1 Các hợp chất flavonoid có hạt cần tây Tên chất R1 R2 R3 Apigenin -H -H -H Apiin -H -H -H -H -OCH3 -H Luteolin -OCH3 -H -OCH3 -H -OH -H -H -OH -OCH3 -OH -H -OH -H Nhận xét: Các flavonoid có hạt cần tây chủ yếu có khung flavon, dẫn xuất apigenin luteolin Apigenin dẫn chất có tác dụng chống viêm, chống ngưng tập tiểu cầu, chống ung thư Luteolin có tác dụng sinh học chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng, chống ung thư, phòng bệnh thận đái tháo đường 2.2 Tinh dầu Hạt cần tây chứa 2-3% tinh dầu gồm: Bảng 2.2 Các hợp chất phthalid có tinh dầu hạt cần tây Tên chất Cấu trúc hóa học Hàm lượng (%) (Nếu có) 3-n-buthyl phthalid 6,9 Sedanolid 18,0 Sedanenolid 17,0 Anhydrid sedanonic Ligustilid Senkiunolid-N Senkiunolid-J Bảng 2.3 Các hợp chất monoterpenoid có tinh dầu hạt cần tây Tên chất Cấu trúc hóa học Hàm lượng (%) (Nếu có) Linalol 0,2 Limonen 60,0 Cis-limonenoxid 1,1 Độ ẩm ❖ Tiêu chuẩn sở: Phương pháp xác định khối lượng làm khô ● Yêu cầu: Không 12% ● Cách tiến hành: tiến hành làm khô tủ sấy nhiệt độ 105 oC, áp suất thường Thao tác Kết Xử lý nguyên liệu: Nghiền nhỏ hạt cần tây thành bột Cần thực nhanh, nghiền xong đem đựng hộp kín Dùng dụng cụ dùng để sấy thủy tinh, rộng miệng, đáy Mbì  = 30,1207g bằng, có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; sấy bì thời gian 30 105oC cân để xác định khối lượng bì Cân vào bì lượng xác khoảng 1g mẫu thử M1=31,1207g (với sai số Kết luận: ĐẠT Định tính Cân xác khoảng 10g bột hạt cần tây cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 30ml ethanol 90% (TT), đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm phản ứng định tính sau: Phản ứng Tiến hành Kết Phản Cho ml dịch lọc vào ống ứng nghiệm, thêm bột magnesi A (TT) Nhỏ từ từ 3-5 giọt acid hydrocloric (TT) Để yên vài phút, dung dịch chuyển từ màu 1: Sau nhỏ HCl vàng sang màu đỏ Kết luận Phản ứng dương tính 36 2: Để yên vài phút dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ Phản Nhỏ 2-3 giọt dịch lọc lên tờ ứng giấy lọc Hơ khô để lên miệng lọ amoniac đặc (TT) mở nút B thấy màu vàng vết dịch chiết tăng lên Phản ứng dương tính Trước hơ NH3 Sau hơ NH3 => Màu vàng vết dịch chiết tăng lên Phản Cho vào ống nghiệm, ống ứng ml dịch lọc C Ống thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), ống để nguyên Đun ống đến sôi, để nguội, thấy ống xuất tủa vàng, ống [1] 1 Phép thử dương tính Thêm vào ống nghiệm ống 2ml nước cất Lắc thấy ống suốt, ống có tủa đục.[2] 37 Acid hóa ống vài giọt acid [1] Ống xuất hydrocloric (TT), ống trở lại tủa vàng, ống tủa đục ống 2.[3] [2] Ống trong, ống có tủa [3] Ống trở lại tủa đục ống Sắc kí lớp mỏn g Bản mỏng: Silicagel F254 Dung môi khai triển: Toluen Ethyl acetat - Acid fomic Methanol (4:4:0,5:1) Dung dịch thử: Lấy khoảng 3g bột dược liệu, thêm 15ml ethanol, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Bốc dịch lọc cịn khoảng 2ml, dung dịch thử dùng để chấm sắc ký Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết tương đương với vết apigenin chuẩn sắc ký đồ dung dịch đối chiếu với Rf = 0,58 Phép thử dương tính Dung dịch chuẩn: Hịa tan mg apigenin chuẩn 10 ml methanol, khuấy thu dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng 10 µl dung dịch thử 10 µl dung dịch chuẩn Sau khai triển xong, lấy mỏng để khô nhiệt độ phòng, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sau phun thuốc thử NP, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết (giá trị Rf khoảng 38 0,53) tương đương với vết apigenin chuẩn sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Định lượng Tiến hành Kết Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 1,5 mg m chuẩn =1,7mg apigenin chuẩn, cho vào bình định mức 100ml, thêm 60 ml methanol (TT), siêu âm C chuẩn = 1,7mg/100ml apigenin tan hết Bổ sung methanol (TT) đến vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 15µg apigenin khan) Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy xác 1, 2, 3, 4, ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 10ml, thêm vào bình 5ml triethylamin 1% methanol Bổ sung methanol (TT) tới vạch, trộn kỹ Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) bước sóng 380,5nm Vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ trục tung, nồng độ trục hoành Nồng độ (mg/100ml) C1 = 0,17 C2 = 0,34 C3 = 0,51 C4 = 0,68 C5 = 0,85 Độ hấp thụ quang 0,131 0,259 0,396 0,538 0,651 Đường chuẩn: A = 0,776 x C + 7.10-4 39 R2 = 0,999 Độ hấp thụ 0.5 0.45 f(x) = 0.06 x + R² = 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Dung dịch thử: Cân xác khoảng g bột hạt cần tây, thêm 100 ml ether dầu hỏa (TT) Chiết bình Soxhlet đến hết chất béo (khoảng giờ), lấy bã bay hết ether, chiết tiếp 100 ml methanol (TT) dịch chiết methanol âm tính với phản ứng Cyanidin (khoảng giờ) Lấy dịch chiết methanol cho vào bình định mức 100ml, bổ sung methanol (TT) vừa đủ tới vạch, thu dung dịch thử gốc Lấy xác ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 25ml, bổ sung methanol tới vạch, lắc thu dung dịch thử Lấy xác ml dung dịch thử vào bình định mức 10ml, thêm ml triethylamin 1% methanol, bổ sung methanol (TT) tới vạch Đo độ hấp thụ bước sóng 380,5 nm (Phụ lục 4.1) Tính khối lượng flavonoid tồn phần (µg) dung dịch thử từ nồng độ đọc đường cong chuẩn hàm lượng phần trăm flavonoid toàn phần hạt cần tây theo apigenin m bột = 5,0038 g Dt = 6250 At = 0,107 => C= 0,137 (mg/100ml) => Hàm lượng %HL = C 100 Dt mbột (1−% hàm ẩm) 1000 100 = 0,19%  Không đạt 40 B KIỂM NGHIỆM CAO CẦN TÂY Mô tả: Cao đặc cần tây chất mềm, đồng nhất, màu nâu sẫm, mùi thơm đặc trưng, vị đắng, cay Kết quả: Mất khối lượng làm khô: Tiến hành Làm khô bì (105oC/30 phút) ↓ Cân bì Kết mbì=30,1223g m1=30,6310g (bì+chế phẩm) =>khối lượng chế phẩm: 41 ↓ m= m1- mbì=0,5087 Cho 0,5g chế phẩm vào bì Sau sấy: ↓ m2=30,5917 Sấy 105oC đến khối lượng không đổi =>% khối lượng làm khô: (sự chênh lệch khối lượng sau sấy thêm tủ sấy so với lần sấy trước khơng q 0,5mg) m1−m2 x100% = m 30,6310−30,5917 x100% 0,5087 %Δm= ↓ =7,7% Làm nguội bình hút ẩm có chứa silica gel đem cân =>ĐẠT ❖ Yêu cầu: Sau làm khô khối lượng chế phẩm giảm không 20% Định tính Cân xác khoảng 0,1 g cao chiết từ hạt cần tây cho vào cốc có mỏ, thêm 20ml ethanol 96% (TT) Chiết siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc Phần dịch lọc dùng để làm phản ứng sau: Phản ứng Phản ứng A Tiến hành Kết Kết luận Lấy ml dịch lọc cho vào Phép thử ống nghiệm, thêm 0,1g bột dương magnesi (TT) ml acid tính hydrocloric (TT), lắc đều, để yên vài phút, dung dịch chuyển dần từ vàng sang Dung dịch chuyển dần từ đỏ 42 vàng sang đỏ Phản ứng B Nhỏ hai đến ba giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, sấy cho bay hết dung môi Hơ tờ giấy lọc miệng bình amoniac đậm đặc (TT) thấy màu vàng vết dịch chiết tăng lên Phép thử dương tính Màu vàng vết dịch chiết tăng lên Phản ứng C Lấy ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt natri hydroxyd 10% (TT) thấy xuất tủa vàng, thêm ml nước cất thấy tủa tan màu vàng dung dịch ống nghiệm tăng lên Phép thử dương tính Thêm vài giọt NaOH 10%: xuất tủa vàng 43 Thêm 1ml H2O: Tủa tan màu vàng dung dịch tăng lên Phản ứng D Lấy ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vào 1-2 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT) thấy xuất tủa màu xanh đen Phép thử dương tính Xuất tủa màu xanh đen Sắc Bản mỏng: Silica gel F254 (UV 254nm) (UV kí Dung mơi khai triển: Toluen lớp mỏng - Ethyl acetat - Acid formic (5 : : 1) Phép thử dương tính Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,1 g cao chiết từ hạt cần tây cho vào cốc có mỏ, thêm 20 ml methanol (TT), chiết siêu âm 10 phút, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Phần dịch lọc đem cô cách thủy 60oC đến thu 44 khoảng ml dịch chiết đặc dùng làm dịch chấm sắc ký Dung dịch chuẩn: Hòa tan mg apigenin chuẩn 10 ml methanol (TT), khuấy thu dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng 10 μl dung dịch thử 10 μl dung dịch chuẩn Sau khai triển xong, lấy mỏng để khô nhiệt độ phòng, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sau phun thuốc thử NP, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết (giá trị Rf khoảng 0,58) tương đương với vết apigenin chuẩn sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (UV 254nm) (UV 366nm) => Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết tương đương với vết apigenin chuẩn sắc ký đồ dung dịch đối chiếu với Rf = 0,66 Định lượng: Phương pháp xây dựng đường chuẩn Tiến hành ❖ Dung dịch chuẩn: Kết m chuẩn =1,5mg 45 1,5mg apigenin chuẩn sấy khô + 60ml methanol ↓ BDM 100ml ↓ Siêu âm đến apigenin tan hết ↓ C chuẩn = 15µg/ml Nồng Độ hấp độ thụ (µg/ml) 1,5 0,095 0,193 4,5 0,287 0,383 7,5 0,476 Thêm methanol đến vạch, lắc kỹ ↓ Dd chuẩn nồng độ 15 µg/ml Đường chuẩn: A = 0,063.C + 1,2.10-3 R2 = 1,000 ❖ Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy xác 1, 2, 3, 4, ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 10 ml riêng biệt ↓ Thêm vào bình ml triethylamin 1% methanol Bổ sung methanol đến vạch, trộn kỹ ↓ Đo độ hấp thụ bước sóng 380,5 nm ↓ Vẽ đường cong chuẩn: trục tung độ hấp thụ, trục hoành nồng độ 46 pH Tiến hành Kết - Vận hành hiệu chỉnh máy đo pH tùy theo pH=5,97 hướng dẫn nhà sản xuất => Kết luận: ĐẠT - Chuẩn bị mẫu đo: Cân xác khoảng 0,2g hịa tan vừa đủ 20ml nước cất để tạo dung dịch cao chiết từ hạt cần tây 1% nước * Yêu cầu: Dung dịch cao chiết từ hạt cần tây 1% nước (kl/tt) phải có pH từ 5,0 đến 7,0 Độ đồng Tiến hành Kết 47 Lấy cao cần tây lên bề mặt phiến kính, dàn mỏng quan sát kính hiển vi * u cầu: Đồng nhất, khơng có váng mốc, bã dược liệu vật lạ Quan sát thấy mẫu cao chưa đồng =>Kết luận: KHÔNG ĐẠT 48 Danh mục tài liệu tham khảo - Dược điển Việt Nam V - Tiêu chuẩn sở “Hạt cần tây” “Cao cần tây” Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội - Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn dược liệu hạt cần tây” – Hoàng Phương Thảo 49 ... nghiệm chất lượng hạt cần tây chế phẩm chiết xuất từ hạt cần tây cần thiết Vì vậy, đề tài ? ?Kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây cao đặc cần tây? ?? thực dựa tiêu chuẩn, tiêu Dược điển Việt Nam V dự thảo... chất lượng nâng cao giá trị sử dụng dược liệu hạt cần tây cao đặc cần tây I TỔNG QUAN A HẠT CẦN TÂY Tên gọi Là chín phơi hay sấy khơ cần tây (Apium graveolens L.), họ Cần (Apiaceae) Thành phần hóa... chiết nước theo dược liệu khô B CAO ĐẶC CẦN TÂY - Nguồn gốc: Cao đặc cần tây bào chế từ hạt cần tây (Apium graveolens L.), họ Cần (Apiaceae) theo phương pháp thích hợp để chế phẩm có hàm lượng