KỸ THUẬT NHUỘM MÔ CHẨN ĐOÁN BỆNH THỦY sản 290321

KỸ THUẬT NHUỘM MƠ CHẨN ĐỐN BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN VĂN GIÁP CÁC BIỂU HIỆN LÂM SÀNG • Đục • Xuất huyết • Lở loét • Lồi mắt • Đốm trắng thể • Màu sắc nhợt nhạt tối xẩm • Dị hình • Cơ quan nội tạng sưng to, biến màu • Có dịch tích xoang bụng SƠ ĐỒ CHẨN ĐỐN BỆNH TƠM, CÁ Đánh giá kết tôm, cá bệnh cho người nuôi Ghi nhận thông tin quản lý ao, dịch bệnh Quan sát trạng động vật thủy sản ao nuôi Thu mẫu động vật thủy sản môi trường nước ao Kiểm tra lâm sang: ký sinh trùng, nấm… Kiểm tra vi khuẩn, mơ bệnh học phịng thí nghiệm Kết phân tích phịng thí nghiệm vi khuẩn, mô bệnh học, thức ăn,… CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tác nhân gây bệnh ký sinh trùng cá Phân lập, nuôi cấy làm vi khuẩn Kiểm tra số lượng vi khuẩn nước tôm, cá Thực kháng sinh đồ Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nghiên cứu mô bệnh học Gây bệnh thực nghiệm Nghiên cứu nấm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MƠ BỆNH HỌC I Phương pháp chẩn đốn nhanh kỹ thuật phết kính huyết tương, quan sát tiêu tươi, phương pháp nhuộm mẫu nhanh Phương pháp phết kính huyết tương - Quan sát tế bào máu cách nhuộm dung dịch Giemsa, nhuộm Gram, nhuộm Haematoxylin Eosin (phát bệnh đầu vàng YHV) Phương pháp thực mẫu mô chấm - Cắt khối mô nhỏ chấm lên lame Hong khô, cố định cồn 70% 5phút nhuộm Giemsa Xem kết (phát bệnh HPV từ gan tôm) Phương pháp thực mẫu mô phết - Dùng dao mổ cạo nhẹ vào mô phết lên lame Hong khô, cố định cồn 70% 5phút nhuộm Giemsa Xem kết PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC Phương pháp thực mẫu mô ép - Cắt mẫu mô nhỏ, dùng lamelle ép mẫu trải rộng ra, nhỏ vài giọt nước muối quan sát kính hiển vi Phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định bệnh MBV tôm sú Quan sát mẫu trực tiếp: Tôm ấu trùng tơm giống: - Thu 30-50 tơm/ao Dùng kính giải phẫu quan sát để lấy gan tụy tôm Tán mỏng đặt lên lame quan sát kính hiển vi Đối với tơm ấu trùng: - Thu 5-10 con/ao Thu mẫu phân tôm đặt lên lame, tán mỏng quan sát kính hiển vi Đọc kết quả: Các thể ẩn MBV có dạng cầu đơn lẻ dính lại chùm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MƠ BỆNH HỌC Phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định bệnh MBV tôm sú Quan sát mẫu nhuộm xanh Malachite: Tôm ấu trùng tôm giống: - Thu 30-50 tơm/ao Dùng kính giải phẫu quan sát để lấy gan tụy tôm, đặt lên lame, tán mỏng, nhỏ giọt xanh Malachite 0.05-0.1% Quan sát kính hiển vi phút Đối với tôm thịt: - Thu 5-10 con/ao Lấy phần gan tụy đặt lên lame, ép mỏng, nhỏ giọt xanh Malachite 0.05-0.1% Quan sát kính hiển vi phút Đọc kết quả: Các tế bào bị nhiễm MBV có nhân trương to, bên nhân ẩn đơn lẻ chum Các thể ẩn MBV bắt màu xanh, nhân hạt lipid khơng bắt màu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MƠ BỆNH HỌC Phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định bệnh đầu vàng tôm sú Kiểm tra huyết tương để tìm thể vùi nguyên sinh chất tế bào nhân máu bị co cụm phá hủy - Chuẩn bị mẫu máu: Cho 0.5 mL formalin 10%(pha với nước biển) 0.5 mL dịch máu từ tim động mạch bụng tôm, lắc - Phương pháp làm mẫu nhuộm: Nhỏ giọt mẫu lên lame, để khơ, sau cố định mẫu methanol 100% phút, để khô tự nhiên - Nhuộm với thuốc nhuộm Wright 3-5 phút, ngâm nước cất (pH 6.2-6.8) 5-6 phút Sau nhuộm Giemsa 20-30 phút, rửa ngâm nước cất (pH 6.2) từ 15-30 phút Để tiêu khô tự nhiên quan sát kính hiển vi Đọc kết quả: Tơm bị bệnh đầu vàng có tế bào máu bị co cụm lại vỡ vụn PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC Phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định bệnh WSSV tôm xú cách nhuộm HE - Chuẩn bị tiêu bản: Cắt phiến mang lớp biểu bì vỏ giáp cho vào dung dịch Davidson cố định từ 1-2 Sau đó, cắt mẫu thành miếng thật nhỏ để lên lame - Phương pháp nhuộm HE:  Rửa hút nước cất phút (lặp lại lần) • Nhuộm Haematoxyline 10 phút, rửa nước cất phút (lặp lại lần) • Nhuộm Eosin phút, ngâm cồn 50% giây, ngâm cồn 70% giây • Ngâm cồn 90% phút (lặp lại lần), cồn 100% phút (lặp lại lần) • Ngâm xylen phút, rửa nước cất • Đậy lamelle quan sát kính hiển vi - Đọc kết quả: Nhân bị nhiễm bệnh to bình thường, xuất thể vùi bắt màu hồng Eosin nhân tế bào Những tế bào bị nhiễm có nhiễm sắc thể tập trung bên rìa PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC II Phương pháp làm tiêu cố định nhuộm màu Cách lấy mẫu: Bệnh phẩm lấy máu tôm hùm Dùng xi lanh (4.2.1) lấy từ 0,1 ml đến 0,2 ml máu từ tim tôm cách chọc mũi kim qua gốc chân ngực số Chuẩn bị bảo quản mẫu • - Mẫu tơm cịn sống tiến hành giải phẫu để thu mơ đích: gan tụy, mang, dày; • - Cắt phần mơ đích (< cm3), cố định mẫu dung dịch Davidson với tỷ lệ thể tích : 10; • - Đối với mơ lớn cần tiêm dung dịch Davidson vào mơ đích trước ngâm dung dịch Davidson; • - Mẫu cố định dung dịch Davidson từ 36 h đến 48 h bảo quản etanol 70 % (thể tích) khoảng thời gian từ 24h đến 72h tùy thuộc vào kích thước mẫu Phải dùng dụng cụ vô trùng lấy mô mẫu khác để tránh lây nhiễm; • - Lấy miếng mẫu cố định etanol 70% ra, cắt miếng nhỏ dày khoảng mm, dài khoảng cm cho vào khuôn nhựa CHÚ THÍCH: Khơng dùng tơm chết tơm bảo quản đơng lạnh để cắt mơ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MƠ BỆNH HỌC II Phương pháp làm tiêu cố định nhuộm màu Cách tiến hành Đúc khuôn Đặt khn nhựa (4.4.1) rửa vịi nước chảy, thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích), thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích), thời gian từ đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối lần thứ 1, thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối thứ 2, thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen lần thứ 1, thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen lần thứ 2, thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin lần thứ 1, thời gian từ h đến h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin lần thứ 2, thời gian từ h đến h; CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mơ tự động tiến hành từ bước ngâm etanol - Đúc khuôn: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin vào khay sắt, gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt, đặt khuôn nhựa lên Để nguội, tách lấy khối paratin PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC II Phương pháp làm tiêu cố định nhuộm màu Cắt tiêu - Cắt gọt khối parafin cho phẳng, đặt mặt máy làm lạnh - Đặt khối paraffin lên máy cắt tiêu cho mặt khối paraffin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ lát đầu đến lát cắt có đủ tổ chức; - Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ μm đến μm; - Chọn lát cắt tiêu phẳng lấy hết mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu có nhiệt độ nước từ 35 oC đến 40 oC; - Dùng phiến kính vớt lát cắt cho lát cắt nằm gọn phiến kính, dựng nghiêng phiến kính để khơ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC II Phương pháp làm tiêu cố định nhuộm màu Nhuộm tiêu - Ngâm tiêu vào cốc xylen lần, thời gian lần từ đến min; - Ngâm tiêu vào cốc etanol tuyệt đối lần, thời gian lần từ đến min; - Ngâm tiêu vào cốc etanol 90 % (thể tích), thời gian từ đến min; - Ngâm tiêu vào cốc etanol 70 % (thể tích), thời gian từ đến min; - Rửa tiêu vòi nước chảy, thời gian từ đến min; - Ngâm tiêu vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin, thời gian từ đến min; - Rửa tiêu vòi nước chảy, thời gian từ đến min; - Ngâm tiêu vào cốc thuốc nhuộm eosin, thời gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa vòi nước chảy, thời gian từ đến min; - Loại bỏ nước bám tiêu cách ngâm tiêu vào cốc etanol 90 % (thể tích) thời gian từ s đến s, sau ngâm tiêu vào cốc etanol tuyệt đối lần, thời gian lần từ s đến s; chuyển tiêu ngâm cốc xylen lần, thời gian lần từ đến min; gắn lamen vào tiêu keo dán lamen Để khơ, soi tiêu kính hiển vi quang học Đọc kết Mẫu dương tính thấy diện Rickettsia- like bacteria ký sinh nội bào mô liên kết gan tụy mang tạo nên đám bắt màu tím hematoxylin Sự biến đổi mô học đặc thù tổ chức gan tụy thể việc Rickettsia- like bacteria bao vây xung quanh mạch máu nhỏ giai đoạn sớm bệnh, sau chúng cơng vào mạch máu, tồn tự làm máu chuyển đục DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT Dụng cụ - Dụng cụ quan sát: kính hiển vi, kính lúp cầm tay - Dụng cụ thu mẫu: pipet Pasteur, lame, lamelle - Dụng cụ giải phẫu: kéo lớn, kéo nhỏ, dao, kẹp, dùi khay nhôm - Các dụng cụ khác: đĩa petri, cốc đong, khăn lau, thau nhỏ, giấy thấm, bút chì mỡ, cần thước đo Hóa chất - Ferique sulphat ammonium 3% - Cồn 70%, cồn 90%, cồn 96% cồn tuyệt đối 99% - Acid acetic, glycerin - Xylen, Baumen,… 2.2 Hóa chất nhuộm màu ký sinh trùng -Dung dịch Hematoxylen -Dung dịch Giemsa -Dung dịch Carmin -Dung dịch AgNO3 2% 2.3 Các hóa chất PHA HÓA CHẤT Pha chế dung dịch làm lame, lamelle: Dung dịch Sulform: Hóa chất: K2Cr2O7 50g H2SO4 đđ 150g Nước cất 1000mL Cách pha: Cho 500mL nước cất hòa với K2Cr2O7 cho tan, thêm H2SO4 đđ từ từ, sau thêm 500 mL nước cất cịn lại Để 24 ngâm lame Phương pháp pha chế dung dịch cố định ký sinh trùng Dung dịch Bouin: Hóa chất: Acid picric bão hịa 75mL Formol 40% THÀNH PHẦN THUỐC THỬ Dung dịch Giemsa đậm đặc (TCVN 8710-17:2016) Thành phần Giemsa (dạng bột) 1,0 g Glyxerin 66 ml Cồn metanol nguyên chất 66 ml Chuẩn bị Làm nóng glyxerin bể ủ nhiệt Thêm thuốc nhuộm Giemsa trộn ủ h Sau để nguội thêm cồn metanol giữ khoảng tuần trước sử dụng Khi sử dụng pha lỗng theo tỷ lệ : 10 (thể tích) dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH = 7,0) giữ 30 THÀNH PHẦN THUỐC THỬ Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer) (TCVN 8710-17:2016) Thành phần Hematoxylin dạng tinh thể Natri iodat Amoni alum sulfat (hoặc kali alum sulfat) Axit citric Chloral hydrat Nước cất 1g 0,2 g 50 g 1g 50 g 000 ml Chuẩn bị Hòa tan hematoxylin nước, sau cho natri iodat amoni alum sulfat kali nhơm sulfat, hồ tan, tiếp tục cho axit citric chloral hydrat lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch pha chai tối màu THÀNH PHẦN THUỐC THỬ Thuốc nhuộm Eosin (TCVN 8710-17:2016) Thành phần Eosin Y Etanol 70 % (thể tích) Axit axetic 1g lít ml Chuẩn bị Thêm từ giọt đến giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích) Hồ tan eosin cồn, sau thêm axit axetic lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch chuẩn bị chai tối màu THÀNH PHẦN DUNG DỊCH CỐ ĐỊNH MẪU Dung dịch Davidson cố định mẫu tôm (TCVN 8710-17:2016) Thành phần Etanol tuyệt đối (3.1.1) 330 ml Formalin (dung dịch nước bão hòa khí formaldehyd, từ 36 % đến 38 %) 220 ml Axit acetic 115 ml Nước cất 355 ml Chuẩn bị Hòa tan axit acetic, formalin etanol 355 ml nước cất, khuấy lắc Bảo quản nhiệt độ phòng THÀNH PHẦN DUNG DỊCH CỐ ĐỊNH MẪU Dung dịch Davidson cố định mẫu nhuyễn thể (TCVN 8710-17:2016) Thành phần Formalin 40%: 200mL Glycerol: 100mL Acid acetic: 100mL Cồn 96%: 300mL Nước biển: 300mL THÀNH PHẦN DUNG DỊCH CỐ ĐỊNH MẪU Dung dịch đệm Formalin 10%: Thành phần Formalin 100mL Sodium phosphate, monobasic: 4g Sodium phosphate dibasic, anhydrous: 6g Nước cất: 900mL (Mẫu cố định Formalin dùng nghiên cứu trực tiếp bệnh virus vi khuẩn) THÀNH PHẦN DUNG DỊCH CỐ ĐỊNH MẪU Dung dịch Bouin’s (cố định mẫu cá, tuyến sinh dục tôm cá): Thành phần Acid piric 700mL Formalin 37-40%: 250mL Acid acetic: 50mL (Là dung dịch cố định tốt, ngấm sâu, cố định miếng mơ lớn, thời gian cố định lâu) Acid piric chất dễ cháy nổ trạng thái khơ cần giữ điều kiện ẩm ướt, tố bảo quản nước cất https://luattrongtay.vn/ViewFullText/Id/caeaa99c-6349-4c42b79e-0b82e36f700d ... Nghiên cứu mô bệnh học Gây bệnh thực nghiệm Nghiên cứu nấm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC I Phương pháp chẩn đoán nhanh kỹ thuật phết kính huyết tương, quan sát tiêu tươi, phương pháp nhuộm mẫu... bụng SƠ ĐỒ CHẨN ĐỐN BỆNH TƠM, CÁ Đánh giá kết tôm, cá bệnh cho người nuôi Ghi nhận thông tin quản lý ao, dịch bệnh Quan sát trạng động vật thủy sản ao nuôi Thu mẫu động vật thủy sản môi trường... máu cách nhuộm dung dịch Giemsa, nhuộm Gram, nhuộm Haematoxylin Eosin (phát bệnh đầu vàng YHV) Phương pháp thực mẫu mô chấm - Cắt khối mô nhỏ chấm lên lame Hong khô, cố định cồn 70% 5phút nhuộm