... PCRBước 6:Cho 600 µl hỗn hợp Chlorofom : Isoamylalcohol(24:1),lắc đều va ly tâm 7 phút với tốc độ 13000 vòng/phút rồi hút phần dung dịch ở trên vào ống eppendorf mới đã đánh dấu tương ứng. Bước 7: Cho 800 µl Ethanol(96%)(hoặc 600 µl Isopropanol),trộn đều và ly tâm 7 phút với tốc độ 13000 vòng/phút.Sau đó đổ phần dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa dưới đáy ống nghiệm. Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%,làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm. Bước 9:Hòa tan kết tủa bằng 50 µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ 20oC+Kiểm tra độ tinh sạch ADN bằng cáchđiện di trên gel agarose 1%.+Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi RM11 cho gen tms2. Bằng việc sử dụng ADN marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút ngắn.Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dòng TGMS mới”. ... TE3.2.2. Phương pháp nghiên cứu * Xác định khả năng chứa gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ tms2 bằng phương pháp PCR :+) Chiết tách ADN tổng số của dòng mẹ TGMS,các tổ hợp phân ly F2 theo quy trình cải tiến của Bộ môn Công nghệ sinh học. Bước 1:Thu ngắt mẫu lá khỏe,dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tích 1,5ml,đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh. Bước 2:Cối,chày sứ dùng để nghiền mẫu đã được hấp khử trùng và đặt trong đá lạnh.Các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0,5cm rồi bỏ vào cối. Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịch đệm chiết suất ADN vào cối rồi nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịch chiết suất AND vào pha trộn lẫn sau đó hút 400 µl vào ống eppendorf đã được đánh dấu. Bước 5: Cho 700 µl hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 )3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu +) Theo dõi đặc điểm nông sinh học : Các chỉ tiêu nông sinh học :+ Thời gian từ cấy đến bắt đầu trổ(10% số bông thoát khỏi lá đòng).+ Thời gian trổ từ khi bắt đầu trỗ(10% số bông thoát khỏi lá đòng) đến khi kết thúc trổ (85% thoát khỏi lá đòng) .+ Thời gian tự cấy đến chín(85% số hạt chắc màu vàng)+ Tổng thời gian sinh trưởng từ gieo đến khi thu hoạch .+ Chiều cao cây (cm) cuối cùng : đo từ mặt đất đến mút đầu bông dài nhất không kể râu .+ Chiều dài lá đòng : đo từ gối lá đến đầu mút lá , đo vào giai đoạn chín sáp. + Chiều rộng lá đòng. + Góc độ lá đòng .+ Chiều dài bông : đo từ cổ bông đến hết bông vào thời kì chín chắc .PHầN ... TE3.2.2. Phương pháp nghiên cứu * Xác định khả năng chứa gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ tms2 bằng phương pháp PCR :+) Chiết tách ADN tổng số của dòng mẹ TGMS,các tổ hợp phân ly F2 theo quy trình cải tiến của Bộ môn Công nghệ sinh học. Bước 1:Thu ngắt mẫu lá khỏe,dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tích 1,5ml,đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh. Bước 2:Cối,chày sứ dùng để nghiền mẫu đã được hấp khử trùng và đặt trong đá lạnh.Các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0,5cm rồi bỏ vào cối. Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịch đệm chiết suất ADN vào cối rồi nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịch chiết suất AND vào pha trộn lẫn sau đó hút 400 µl vào ống eppendorf đã được đánh dấu. Bước 5: Cho 700 µl hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 )3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu +) Theo dõi đặc điểm nông sinh học : Các chỉ tiêu nông sinh học :+ Thời gian từ cấy đến bắt đầu trổ(10% số bông thoát khỏi lá đòng).+ Thời gian trổ từ khi bắt đầu trỗ(10% số bông thoát khỏi lá đòng) đến khi kết thúc trổ (85% thoát khỏi lá đòng) .+ Thời gian tự cấy đến chín(85% số hạt chắc màu vàng)+ Tổng thời gian sinh trưởng từ gieo đến khi thu hoạch .+ Chiều cao cây (cm) cuối cùng : đo từ mặt đất đến mút đầu bông dài nhất không kể râu .+ Chiều dài lá đòng : đo từ gối lá đến đầu mút lá , đo vào giai đoạn chín sáp. + Chiều rộng lá đòng. + Góc độ lá đòng .+ Chiều dài bông : đo từ cổ bông đến hết bông vào thời kì chín chắc .PHầN...