Đang tải... (xem toàn văn)
Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis để sẩn xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học
iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua. Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng. Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua. Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Phi iv TÓM TẮT BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC" Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả chúng tôi có được: Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ enzyme của vi khuẩn tốt nhất. Nhiệt độ 4 - 100C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 370C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm. v ABSTRACT A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase, protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the results had showed: We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis. Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase, protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation. The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7 for 48 hours culture. Enzyme activity conserved better in 4 – 100C than in 30 – 370C. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv ABSTRACT . v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG . ix DANH SÁCH HÌNH . x DANH SÁCH SƠ ĐỒ xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích đề tài . 2 1.3. Yêu cầu đề tài . 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN . 3 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis . 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện . 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái 4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy 4 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá . 5 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 6 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử 6 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử . 6 2.1.7. Tính chất đối kháng 6 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease . 7 2.3.1. Enzyme amylase . 7 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu 7 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase 7 2.3.1.3. Đặc tính của amylase . 8 vii 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 10 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase . 10 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật . 11 2.3.2. Enzyme protease . 11 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease 11 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật . 12 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật . 13 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật . 14 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật 14 2.3. Giới thiệu về probiotic 15 2.4.1. Định nghĩa . 15 2.4.2. Chức năng sinh học . 15 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng 15 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis . 16 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài . 18 3.1.1. Thời gian . 18 3.1.2. Địa điểm 18 3.2. Vật liệu thí nghiệm . 18 3.2.1. Đối tượng khảo sát 18 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm . 18 3.2.2.1. Thiết bị . 18 3.2.2.2. Dụng cụ: 18 3.3. Nội dung nghiên cứu 19 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài . 19 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất . 19 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn . 19 viii 3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 19 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được 20 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis . 22 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis. 23 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis . 25 3.4.3.1. Quy trình thực hiện 25 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản 25 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 26 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 26 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis 26 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 26 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa 27 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. 29 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 31 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis 33 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất . 34 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1. Kết luận 36 5.2. Đề nghị . 36 PHỤ LỤC 40 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 . 21 Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 . 23 Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 . 24 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá 29 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) . 29 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm . 31 Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. 32 Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất 33 Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm 34 x DANH SÁCH HÌNH Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis . 3 Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis . 26 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis . 27 [...]... dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học 1 1.2 Mục đích đề tài Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng... cứu Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản 3.4 Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn. .. tài Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis. .. những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được 20 Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi Thử phản... đất 3.4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp... tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005) 2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis Đặc điểm phân loại: Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 2 1 Vi khuẩn Bacillus subtilis www.microscopyconsulting.com/... Thử phản ứng sinh hóa Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-) Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 3.4.2 Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 3.4.2.1 Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis ... men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2 BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie 15 VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN, UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA 2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis Trong nông nghiệp: Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus. .. tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus 16 Kháng sinh: Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin... tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột 2.4.3 Một số chế phẩm probiotic thông dụng Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau như: ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2 Chế phẩm . NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ. năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học . 2 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus
