CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Phương pháp thu bào tử:
a. Tạo nguyên liệu thô chứa bào tử (cả dạng tự do và dạng còn nằm trong tế bào) [3]:
Chuẩn bị 4 đến 5 bình nón có dung tích 250ml, mỗi bình chứa 100ml môi trường MT1, hấp tiệt trùng ở 1atm trong 20 phút, để nguội. Cấy 10ml dịch nhân giống vào mỗi bình, đem lắc ở 370C, 110 vòng/phút trong máy lắc trong 4 ngày. Tiến hành xử lý nhiệt dịch nuôi cấy bằng cách đun cách thủy ở 100°C trong 1 giờ.
Ly tâm dịch sau xử lý nhiệt 4000 vòng/phút trong 15 phút, thu cắn. Phân tán đều cắn trong nước cất tiệt trùng, vortex kỹ để rửa sạch môi trường nuôi cấy, rồi ly tâm (4000 vòng/phút trong 15 phút) thu được nguyên liệu thô chứa bào tử.
b. Giai đoạn giải phóng nội bào tử:
Nguyên liệu thô thu được sau sử lý nhiệt dịch nuôi cấy gồm có tế bào sinh dưỡng non đã chết, tế bào chứa nội bào tử và bào tử tự do đã được giải phóng [3]. Vì vậy, cần phải sử dụng các tác nhân khác nhau để phá vỡ dạng sinh dưỡng, giải phóng nội bào tử.
Giải phóng nội bào tử bằng phương pháp hóa học:
Lấy khoảng 0,5g nguyên liệu thô đã chuẩn bị ở mục a., phân tán đều trong 30ml dung dịch hóa chất:
- H2SO4 10% ủ ở 2 điều kiện: nhiệt độ phòng (30°C) và 80°C trong 80 phút.
- NaOH 0,4%, 10%, 20% ủ ở 80°C trong 80 phút. - SDS 3% [7] ủ ở 80°C trong 80 phút.
- EDTA pH8 [5] ủ ở 2 điều kiện: nhiệt độ phòng (30°C) và 80°C trong 80 phút.
Sau thời gian ủ, tến hành xử lý loại xác tế bào sinh dưỡng, làm tiêu bản theo Ogieska [8] để đánh giá khả năng giải phóng nội bào tử của các phương pháp hóa học ở các điều kiện khác nhau.
Giải phóng nội bào tử bằng phương pháp vật lý: (phương pháp siêu âm)
Lấy khoảng 0,5g nguyên liệu thô vào bình nón 100ml, phân tán đều trong 30ml nước cất. Đem dịch phân tán siêu âm ở bể 40 KHz [10], sau các khoảng thời gian khác nhau lấy mẫu, làm tiêu bản theo Ogieska [8] để đánh giá khả năng giải phóng nội bào tử của phương pháp siêu âm.
Giải phóng nội bào tử bằng phương pháp sinh học: (sử dụng enzym lysozyme)
Lấy khoảng 0,5g nguyên liệu thô, phân tán trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm dung dịch lysozym(1 mg/ml), ủ ở 37°C [6], sau khoảng thời gian khác nhau, lấy mẫu làm tiêu bản theo Ogieska để xác định thời điểm các tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ hoàn toàn.
c. Thu bào tử:
- Dịch xử lý ở trên được đem ly tâm thu cắn (4000 vòng/phút trong 20 phút).
- Phân tán cắn trong nước cất tiệt trùng, vortex kỹ để rửa sạch hóa chất, rồi ly tâm thu cắn (4000 vòng/phút trong 20 phút).
Chuẩn bị các các dung dịch KCl 1M, NaCl 1M, và nước cất trong các bình nón to, hấp tiệt trùng ở 1 atm trong 20 phút, để nguội.
- Hòa cắn trong 30ml dung dịch KCl 1M để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (4000 vòng/phút trong 10 - 15 phút).
- Tiếp tục hòa cắn trong 30ml dung dịch NaCl 1M để loại hoàn toàn vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (4000 vòng/phút trong 10- 15 phút).
- Thu cắn, rửa bằng nước cất tiệt trùng, làm 3 lần thu được bào tử [3]. - Hiệu quả xử lý được đánh giá bằng cách: làm tiêu bản theo Ogieska [8] rồi soi dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 1000 lần, vật kính dầu), phương pháp đếm số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên tục và phương pháp cân để tính tỷ lệ giữa khối lượng sinh khối sau xử lý so với lượng nguyên liệu thô ban đầu. Công thức tính: