- Dịch chấm sắc ký: Cắn mẫu nghiên cứu hòa tan hoàn toàn trong methanol.
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn được hoạt hóa 1h ở 1100C. Để nguội.
- Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khai triển sau: Hệ I: Chloroform - Methanol (9:1)
Hệ II: Ethylacetat - Methanol - H2O (10:1,35:1) Hệ III: Toluen - Ethylacetat - Acid formic (5:4:1) Hệ IV: Toluen - Ethylacetat - Acid formic (6:2:1) Hệ V: Ethylacetat - Chloroform - Acid formic (3:3:1)
- Hiện màu với thuốc thử vanillin trong H2SO4 10%, quan sát dưới ánh sáng thường.
- Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol lên trên bản mỏng, sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi khai triển xong lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm. Sau đó phun thuốc thử là dung dịch vanillin trong H2SO4 10% lên bản mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 1100C rồi quan sát dưới ánh sáng thường.
Sau nhiều lần triển khai sắc ký thấy hệ IV cho kết quả tách tốt nhất. Hệ IV tiếp tục được triển khai SKLM cho cắn chloroform. Kết quả thể hiện ở hình 3.2 và bảng 3.3.
Nhận xét:
Khi chưa phun TT: Ánh sáng thường: 9 vết Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm: 11 vết Ánh sáng tử ngoại bước sóng 365nm: 15 vết Khi phun TT: Ánh sáng thường: 12 vết a) b) c) d)
Hình 3.2. Sắc ký đồ của cắn C với hệ dung môi IV ở các điều kiện quan sát.
a) Không phun TT, AST b) Không phun TT, UV254nm
Bảng 3.3. Kết quả định tính cắn phân đoạn chloroform bằng SKLM.
STT
Không có thuốc thử Có thuốc thử
Rf x 100 AST UV254 UV365 AST 1 Đen + Đỏ hồng ++ 3,81 2 Vàng + Đỏ hồng ++ Tím + 9,52 3 Đen +++ Hồng + Tím +++ 13,33 4 Vàng + 16,19 5 Xanh lá +++ Tím ++ 20,95 6 Vàng xanh ++ Đen ++ Hồng ++ 22,85 7 Đen ++ 26,67 8 Hồng sáng +++ Tím +++ 29,52 9 Vàng ++ Đen ++ Hồng ++ 32,38 10 Nâu ++ 34,29 11 Vàng + Đen + Hồng ++ 37,14
12 Nâu ++ 40,00 13 Đỏ hồng +++ Nâu ++ 48,57 14 Đen +++ 50,00 15 Vàng xanh +++ Đen ++ Hồng ++ Nâu ++ 61,43 16 Vàng xanh ++ Đen ++ Xanh sáng ++++ Tím ++++ 63,33 17 Vàng +++ Đen +++ Đỏ hồng ++++ Nâu + 69,05 18 Vàng +++ Đen ++ Tím hồng +++ 72,86 19 Hồng ++ Tím + 79,25 20 XDT ++++ 84,91 21 Xanh tím +++ 91,51 3.2. PHÂN LẬP 3.2.1. Chuẩn bị cột
Cột thủy tinh có nút mài và khóa, chiều dài cột 40cm, đường kính 30mm. Rửa sạch, làm khô, lắp cố định cột vào giá theo chiều thẳng đứng.
Dùng đũa thủy tinh dài để lót một lớp bông (loại bông thấm nước) lên trên ống thoát dịch của cột.
Cân một lượng silicagel cần dùng vào cốc có mỏ. Thêm dung môi rửa giải vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tới khi hết bọt khí.
Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống đáy cột. Khi dung môi chảy gần hết trong cột, tiếp tục rót hỗn dịch trên vào cột. Chú ý không để khô dung môi ở cột. Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục 1 thời gian. Ổn định cột trong 12 giờ.
3.2.2. Tiến hành
Cắn chloroform được hòa tan bằng lượng dung môi chloroform/ methanol tối thiểu. Cắn chloroform được tiến hành phân tách bằng sắc kí cột nhồi silicagel pha thường (cỡ hạt 240 - 430 mesh, 0,040 - 0,063 mm), rửa giải bằng hệ dung môi gradient n-hexan/ aceton với độ phân cực tăng dần (từ 10/1 - 0/1, v/v), cuối cùng là methanol. Chấm kiểm tra, gộp các phần giống nhau thu được 5 phân đoạn chính là F4 (1g), F5 (0,34g), F6 (0,67g), F7 (1,34g), F8 (2,34g).
Phân đoạn F8 (2,34 g) tiếp tục được tiến hành phân tách trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/aceton: 2,5/1 thu được 4 phần là:
F8A → D.
Phần F8B tiến hành chạy trên cột silicagel pha thường, hệ dung môi dicloromethan/aceton: 2/1, thu được chất 3 (10 mg).
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ cỏ Seo gà Cắn chloroform 30g F8C F8D Chất 3 (PM12) CC, Silicagel,
gradient n-hexan - aceton
Methanol CC, Silicagel, n-hexan/aceton: 2,5/1 CC, Silicagel, dicloromethan/aceton: 2/1 F4 F5 F6 F7 F8 10/1 5/1 2/1 Aceton F8B F8A
3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hợp chất PM12
PM12 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi: Hệ I: Toluen: Ethylacetat: Acid formic (5:4:1)
Hệ II: Toluen: Ethylacetat: Acid formic (6:2:1) Hệ III: Ethylacetat: Methanol (6:1)
Kết quả : Quan sát ở ánh sáng thường PM12 chỉ xuất hiện một vết màu vàng nâu nhạt, ở ánh sáng UV254 PM12 chỉ xuất hiện một vết màu đen. Sau khi phun TT H2SO4 10% và quan sát ở ánh sáng thường PM12 chỉ xuất hiện một vết màu vàng nâu. Vì vậy, sơ bộ kết luận PM12 là một chất tinh khiết (hình 3.4, 3.5 và bảng 3.4).
Hệ I Hệ II Hệ III
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.5. Hình ảnh SKLM của PM12 với 3 hệ dung môi ở ánh sáng thường.
Bảng 3.4. Kết quả SKLM của PM12 với 3 hệ dung môi ở AST và ở UV254.
Hệ dung môi I II III
AST
Rf x 100 45,59 26,47 50,00 Màu sắc Vàng nâu Vàng nâu Vàng nâu
UV254
Rf x 100 45,59 26,47 50,00
Ngoài ra còn tiến hành sắc ký so sánh PM12 với cắn chloroform trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển là chloroform: ethylacetat: acid formic (5:4:1). Kết quả thể hiện ở hình 3.6.
1 2
Hình 3.6.Sắc ký so sánh PM12 với cắn chloroform
1. Cắn phân đoạn chloroform 2. PM12
3.3. NHẬN DẠNG CÁC CHẤT PHÂN LẬP
- Tính chất: PM12 dạng tinh thể hình khối. Nhiệt độ nóng chảy là: 150 - 1570C. Tan trong chloroform và methanol.
Hình 3.7. Ảnh chụp tinh thể PM12 dưới KHV vật kính 20
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 3 proton thơm δH 7,34 (H-2, d, J = 1,5 Hz), 6,94 (H-5, d, J = 8,0 Hz) và 7,32 (brs) gợi ý một vòng benzen thế kiểu 1, 3, 4. Tín hiệu của đặc trưng của nhóm aldehyd (CHO) quan sát thấy tại vị trí cộng hưởng δH 9,71 (s).
Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 7 carbon, trong đó có 6 tín hiệu carbon vòng thơm tại các vị trí cộng hưởng δC 130,84 (C), 119,46 (CH), 153,74 (C), 147,19 (C), 116,26 (CH) và 126,40 (C); và 1 nhóm carbonyl của nhóm aldehyd tại δC 193,11. Các dữ kiện phổ trên cho phép ta nghĩ đến cấu trúc một vòng benzen thế 1, 3, 4; trong đó có 2 nhóm hydroxy và một nhóm aldehyd. So sánh cấu trúc dự đoán với chất 3 trong tài liệu [45] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng, cho phép khẳng định PM12 chính là 3,4-dihydroxy benzaldehyd.
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của PM12 No. *δC [45] (δH, mult., J in Hz) δCa δHb (mult., J in Hz) 1 130,6 130,84 2 118,4 119,46 7,34 (d, 2,0) 3 152,0 153,74 4 146,4 147,19 5 111,3 116,26 6,94 (d, 8,0) 6 124,3 126,40 7,32 (brs) CHO 190,9 193,11 9,71 (s) Đo trong MEOD: a) 125 MHz, b) 500 MHz 5 O H OH OH 1 2 3 4 6
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất PM12
3.4. BÀN LUẬN
Cỏ Seo gà là một dược liệu được sử dụng khá phổ biến trên thế giới. Tại Trung Quốc, cỏ Seo gà được dùng để điều trị viêm đường tiết niệu, trị trẻ em
kinh phong, ỉa chảy, lỵ amip, lỵ trực khuẩn, viêm gan, trĩ, hoàng đản cấp tính, phong thấp buốt đau, sốt rét, nhọt, bệnh ngoài da …[8], [24]. Riêng Việt Nam, cỏ Seo gà được biết đến với các bài thuốc trị xuất huyết, lỵ trực trùng, bệnh ngoài da… [7], [12], [15]. Vì vậy, đề tài nghiên cứu được tiến hành là cần thiết để góp phần nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu này.
Hiện nay, có nhiều phương pháp chiết xuất được áp dụng trong nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm. Phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng là một trong những phương pháp tối ưu được lựa chọn trong phân lập các chất có trong dược liệu với những ưu điểm: là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền. Mẫu nghiên cứu được chia nhỏ để làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dược liệu và dung môi, làm tăng hệ số khuếch tán từ đó làm tăng hiệu suất chiết. Các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được một số hợp chất khác nhau: β-sitosterol-β-glucosid [15], multifidosid A, B, C và pterokauran M1, M2, M3… [47]. Từ phân đoạn chloroform của cỏ Seo gà, đề tài đã phân lập được hợp chất PM12 được xác định cấu trúc là: 3,4-dihydroxy benzaldehyd dựa vào dữ liệu phổ NMR. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới. 3,4-dihydroxy benzaldehyd hay protocatechu aldehyd đã được các nhóm nhà khoa học khác nhau trên thế giới phân lập và chứng minh tác dụng dược lí. Năm 2007, một số nhà khoa học đã phân lập và tinh chế được 3,4-dihydroxy benzaldehyd từ quả Xanthium strumarium bằng phương pháp sắc kí cột với chất nhồi cột là silicagel và chứng minh được nó có tác dụng ức chế hoạt động CKII với IC50 khoảng 783 μM. Ở nồng độ 300 μM, 3,4-dihydroxy benzaldehyd có khả năng ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào ung thư U937 ở người [29]. Tương tự, bằng phương pháp sắc kí cột silicagel kết hợp sắc kí lỏng hiệu năng cao, Jin Boo Jeong và cộng sự đã phân lập được chất 3,4-dihydroxy benzaldehyd từ hạt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lúa mạch Hordeum vulgare và chứng minh nó có tác dụng thu dọn gốc DPPH, gốc hydroxyl, ROS nội bào, tạo phức chelat với Fe2+, ức chế sự oxy hóa phá hủy DNA và cơ chế gây chết tế bào gây ra bởi H2O2 [23]. Theo [18], protocatechu aldehyd (PCA) là một hợp chất polyphenol tự nhiên được phân lập từ gốc rễ của các loại thảo dược S. miltiorrhiza và cây trà lúa mạch. PCA làm giảm tác dụng của β-catenin và cyclin D1 (tiền gen gây bệnh ung thư vú) nên có tác dụng ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư vú ở người. Thêm vào đó, protocatechu aldehyd được cho là hợp chất phenolic chính của Phellinus gilvus có tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH và ức chế sự sản xuất NO được hoạt hoá bằng LPS trong đại thực bào RAW264 [17]. Ngoài ra, 3,4-dihydroxy benzaldehyd còn có tác dụng chống viêm, bảo vệ và phục hồi tế bào cơ tim sau chấn thương do thiếu máu cục bộ [44], chống nhiễm trùng huyết [51], hỗ trợ tác dụng của aspirin trên tiểu cầu [35]. Nhận thấy vai trò ngày càng quan trọng của 3,4-dihydroxy benzaldehyd, con người đang tích cực đầu tư cho nghiên cứu phân lập hợp chất này từ các nguồn dược liệu khác nhau. Vì vậy, việc phân lập ra 3,4-dihydroxy benzaldehyd từ cỏ Seo gà là định hướng cho việc nghiên cứu các hợp chất có khả năng điều trị các bệnh ung thư, bệnh liên quan đến gốc tự do… Tóm lại, đây là một đóng góp mới của khóa luận, góp phần nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoá học của cỏ Seo gà, nghiên cứu được phần nào mối quan hệ giữa các thành phần hoá học với các tác dụng sinh học, mở ra hướng mới để nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học cỏ Seo gà.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả sau đây:
1. Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol, sau đó chiết lỏng - lỏng với lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, chloroform thu được 10,00g cắn phân đoạn chloroform. Hàm lượng % cắn phân đoạn so với khối lượng bột dược liệu là 1,25%. Định tính cắn chloroform bằng SKLM cho thấy: cắn chloroform cho 15 vết có màu sắc, độ đậm nhạt, Rf khác nhau, khi quan sát ở các điều kiện AST, UV365nm, UV254nm, trước và sau khi phun thuốc thử.
2. Từ cắn chloroform đã phân lập được PM12. Sau khi kiểm tra bằng SKLM cho thấy chất phân lập được là tinh khiết. Cấu trúc được xác định dựa trên các dữ liệu phổ NMR. Cấu trúc hóa học được nhận dạng là: 3,4-dihydroxy benzaldehyd.
ĐỀ XUẤT
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên những kết quả nghiên cứu trên của chúng tôi mới chỉ đóng góp phần nào trong công trình nghiên cứu về cỏ Seo gà. Cỏ Seo gà là một dược liệu được sử dụng phổ biến trên thế giới và được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý. Vì vậy chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất:
- Nghiên cứu tác dụng sinh học của cỏ Seo gà (tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng chống viêm …)
- Nghiên cứu dạng bào chế phù hợp, tiện sử dụng, hiệu quả trong điều trị từ cỏ Seo gà.
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Đình Bích - Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học, tr 207-213.
2. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Thực tập dược liệu phần hiển vi.
3. Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội (2006), Thực tập dược liệu phần hóa học.
4. Bộ môn Thực vật - Trường đại học Dược Hà Nội (2004), Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc.
5. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2011), Bài giảng dược liệu, tập 1.
6. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2011), Bài giảng dược liệu, tập 2.
7. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr 275.
8. Võ Văn Chi (1999), Cây cỏ có ích ở Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản Giáo dục, tr 150-156.
9. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr 138, tr 2063-2067.
10. Nguyễn Văn Đàn - Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học.
11. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt nam: trồng hái, chế biến, trị bệnh ban đầu, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr 748-749.
13. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, Nhà xuất bản trẻ, tr 61-68.
14. Nguyễn Thị Thanh Huyền (2013), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ Seo gà, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học. 15. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam, tập
2, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr 729-730.
Tài liệu tiếng Anh
16. B.Qin, D.Y.Zhu, S.H.Jiang, G.Xiang, Y.Leng, Z.P.Gu, Y.Q.Wang, X.F.Shao (2006), “Chemical constituents of Pteris multifida and their inhibitory effects on growth of rat prostatic epithelial cells in vitro”,
Chinese Journall of Natural Medicines, 5(6), 431-438.
17. Chang ZQ1, Gebru E, Lee SP, Rhee MH, Kim JC, Cheng H, Park SC (2011), “In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities of protocatechualdehyde isolated from Phellinus gilvus”, J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 57 (1), 118-122.
18. Choi J1, Jiang X, Jeong JB, Lee SH. (2014), “Anticancer Activity of Protocatechualdehyde in Human Breast Cancer Cells”, Journal of Medicinal Food, (00), 1-7. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19. Feng-Lin Hsu, Chun-Fa Huang, Ya-Wen Chen, Yuan-Peng Yen, Cheng- Tien Wu, Biing-Jiun Uang, Rong-Sen Yang and Shing-Hwa Liu (2012), “Antidiabetic Effects of Pterosin A, a Small Molecular Weight Natural Product, on Diabetic Mouse Models”, Published online October 15, 2012, 628- 638.
21. Gong XL, Chen ZH, Liang NC (2007), “Advances in study on chemical constituents and pharmacological activities of plants of genus Pteris”,
Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 32(14), 1382-1387.
22. Hoang Le Son and Tran Huynh Phuoc Thao (2014), “In vitro Antioxidant and Anticancer Properties of Active Compounds from Methanolic Extract of Pteris multifida Poir. Leaves”, European Journal of Medicinal Plants, 292-302.
23. Jeong JB, Hong SC, Jeong HJ (2009), “3,4-dihydroxy benzaldehyde purified from the barley seeds (Hordeum vulgare) inhibits oxidative DNA damage and apoptosis via its antioxidant activity”, Phytomedicine, 16 (1), 85-94.
24. Jiang Su new college of Medicine (1985), “Dictionary of chinese