- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh trong mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
- Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy 1 vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5mL MT canh thang, ủ ở 37˚C trong 18-24 giờ (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/mL.
+ Cấy hỗn dịch vi khuẩn vào MT thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45- 55˚C với tỷ lệ 2,5:100, lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20mL/đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50˚C. Sau đó đặt lên bề mặt MT kiểm định.
Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT kiểm định.
Phương pháp giếng thạch: Đục giếng thạch (Φ= 6,0mm) trên MT kiểm định, nhỏ 0,05mL dịch thử vào mỗi giếng thạch.
+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37˚C trong 18-24 giờ (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer (có độ chính xác 0,02mm). Kết quả được đánh giá trên đường kính vòng vô khuẩn, xử lý theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n = = - = = - å å Trong đó:
D (mm): đường kính trung bình vòng vô khuẩn
Di (mm): đường kính vòng vô khuẩn thứ i s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n: số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3)