vuông
- Tối ưu hóa điều kiện phân tích
- Chọn khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và giá trị cường độ dòng điện tương ứng
- Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp - Kiểm tra độ đúng của phương pháp
2.2.2. Ứng dụng phương pháp cực phổ sóng vuông để định lượng cefoperazon trong một số chế phẩm trên thị trường
Định lượng cefoperazon trong một số chế phẩm bằng hai phương pháp: - Cực phố sóng vuông (SWP)
- Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo quy định của Dược Điển Mỹ
2.2.3. Xử lý kết quả thực nghiệm
Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với cường độ dòng điện được thiết lập bằng phương pháp bình phương tối thiểu với hệ số tương quan của đường chuẩn R2 0,990. So sánh kết quả của SWP với HPLC bằng kiểm định t-cặp với mức tin cậy 95%.
Giá trị trung bình: n X X n i i 1 Độ lệch chuẩn: SD = ) 1 ( ) ( 1 2 n X X n i i
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD= 100
X SD
CHƯƠNG III
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
3.1.1. Chuẩn bị hóa chất
1) Pha đệm vạn năng (Đệm Britton – Robinson)
Hỗn hợp gồm 3 acid: CH3COOH 0,04 M + H3BO3 0,04 M + H3PO4 0,04 M. - Lấy 0,24 ml dung dịch CH3COOH đặc hòa tan vào khoảng 100 ml được dung dịch CH3COOH 0,04 M.
- Lấy 0,25 ml dung dịch H3PO4 đặc hòa tan vào khoảng 100 ml được dung dịch H3PO4 0,04 M.
- Cân 0,27 g H3BO3 hòa tan vào khoảng 100 ml được dung dịch H3BO3 0,04 M.
Dung dịch NaOH 0,2 M: Cân 0,8 g NaOH hòa tan vào khoảng 100 ml.
Trộn hỗn hợp 3 acid với dung dịch NaOH 0,2 M theo các tỉ lệ thích hợp để được các pH khác nhau.
2) Pha đệm acetat pH 4
- Pha dung dịch CH3COOH: Lấy khoảng 1,15 ml dung dịch CH3COOH đặc hòa tan vào khoảng 100 ml.
- Pha dung dịch CH3COONa: Cân 2,72 g CH3COONa.3H2O hòa tan vào khoảng 100 ml.
- Trộn các dung dich CH3COOH và CH3COONa theo một tỉ lệ thích hợp để được dung dịch đệm pH 4
3) Pha đệm phosphat pH 4
- Cân 2,78 g NaH2PO4 hòa tan vào khoảng 100 ml - Cân 5,3 g Na2HPO4 hòa tan vào khoảng 100 ml
- Trộn các dung dịch NaH2PO4 và dung dịch Na2HPO4 theo tỉ lệ thích hợp để được dung dịch đệm phosphat pH 4.
3.1.2. Chuẩn bị mẫu
Pha mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn gốc cefoperazon 500 ppm:
- Cân chính xác khoảng 0,0560 g chất chuẩn cefoperazon định mức với nước thành 100 ml. Bảo quản dung dịch này trong lọ tối màu trong tủ lạnh khoảng một tuần.
- Các dung dịch cefoperazon làm việc được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc trong bình định mức 100 ml.
3.1.3. Nghiên cứu cơ chế khử cực của cefoperazon với điện cực giọt thủy ngân treo ngân treo
- Tiến hành đo đường cong vôn-ampe vòng với điện cực giọt thủy ngân treo dung dịch cefoperazon 0,03 ppm trong nền đệm vạn năng (Britton – Robinson) với pH 2 ÷ 10, với các thông số máy như sau:
Thế tích góp – 0,3 V Thời gian tích góp 100 s Thời gian cân bằng 10 s Thời gian sục khí 100 s Khoảng thế – 0,3 ÷ – 1,2 V Bước thế 0,005 V Tốc độ quét 0,3 V/s Kích thước giọt 4 Tốc độ khuấy 2000 vòng/phút
- Kết quả cho thấy khi pH tăng, píc ngày càng tù hơn và dịch chuyển dần theo chiều âm của thế. Với pH ≥ 7, không có píc xuất hiện
trên đường cong vôn-ampe của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm (hình 3.1a). Sự phụ thuộc của vị trí xuất hiện píc vào pH được biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính E = – 0,0537 pH – 0,792, với R2 = 0,9994 (hình 3.1b)
Hình 3.1a. Đường cong vôn-ampe vòng của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm trong nền đệm vạn năng pH 3,05 (a), 4,04 (b), 5,1 (c), 6,02 (d)
Hình 3.1b. Đồ thị sự phụ thuộc vị trí xuất hiện píc trên đường cong vôn-ampe vòng cefoperazon 0,03 ppm vào pH của B-R
3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng cefoperazon bằng cực phổ sóng vuông vuông
3.1.4.1. Tối ưu hóa điều kiện phân tích
Khảo sát sơ bộ
- Khảo sát các loại đệm
Tiến hành khảo sát sự xuất hiện píc của cefoperazon 0,03 ppm trong các nền đệm khác nhau pH 4 (hình 3.2a, b, c) bằng phương pháp cực phố sóng vuông với cùng thông số máy như sau:
Thế tích góp – 0,3 V Thời gian tích góp 100 s Thời gian cân bằng 10 s Thời gian sục khí 100 s Khoảng thế – 0,3 ÷ – 1,2 V Bước thế 0,005 V Tốc độ quét 0,3 V/s Tốc độ khuấy 2000 vòng/phút Kích cỡ giọt 4
Hình 3.2a. Cực phổ đồ sóng vuông của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm trong nền đệm phosphat pH 4
Hình 3.2b. Cực phổ đồ sóng vuông của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm trong nền đệm acetat pH 4
Hình 3.2c. Cực phổ đồ sóng vuông của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm trong nền đệm B-R pH 4
100 nA 100 nA
Hình 3.2c cho thấy sóng khử của cefoperazon có hình nhọn đều, cường độ dòng cao nhất trong nền đệm B-R và thấp hơn trong nền đệm acetat và phosphat. Do vậy, đệm B-R pH 4 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Tối ưu hóa điều kiện phân tích
Qua khảo sát sơ bộ 4 yếu tố ảnh hưởng nhất được chọn ra là tần số (60 ÷ 80 Hz), thời gian tích góp (100 ÷ 120 s), biên độ xung (0,05 ÷ 0,1) và bước thế (0,005 ÷ 0,007 V), mô hình thí nghiệm được bố trí như trong bảng 3.1 và 3.2. Bảng 3.1. Kết quả đo cực phổ sóng vuông cefoperazon 0,03 ppm theo mô hình
thiết kế mặt phức hợp trung tâm (Central Composite Face - CCF)
Stt Thời gian tích góp (s) Tần số (Hz) Biên độ xung (V) Bước thế (V) Cường độ dòng (nA) 1 120 70 0,075 0,006 –166 2 110 70 0,075 0,006 (*) 3 120 60 0,1 0,005 –110 4 120 80 0,05 0,007 –188 5 120 80 0,1 0,005 –164 6 100 70 0,075 0,006 –142 7 120 60 0,1 0,007 –161 8 100 60 0,05 0,005 –101 9 100 80 0,1 0,005 –144 10 110 70 0,075 0,005 –132 11 100 80 0,05 0,007 –173
12 110 70 0,075 0,006 –155 13 110 70 0,1 0,006 –157 14 100 60 0,05 0,007 –132 15 100 60 0,1 0,005 –110 16 110 70 0,075 0,006 –152 17 120 80 0,1 0,007 –215 18 120 60 0,05 0,005 –114 19 110 60 0,075 0,006 –133 20 120 60 0,05 0,007 –149 21 100 80 0,05 0,005 –131 22 110 70 0,075 0,007 –176 23 120 80 0,05 0,005 –154 24 100 60 0,1 0,007 –142 25 110 80 0,075 0,006 –173 26 110 70 0,05 0,006 –143 27 100 80 0,1 0,007 –187
Chú thích: (*) số liệu không được sử dụng cho tối ưu
Kết quả tối ưu được xác định cho các yếu tố sau khi sử dụng phần mềm Modde 9.1 là: thời gian tích góp 120 s, biên độ xung 0,1 V, bước thế 0,007 V, tần số 80 Hz. Hình 3.3a và b biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát với cường độ dòng đo được bằng phương pháp cực phổ sóng vuông.
Hình 3.3a. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của biên độ xung và bước thế đến cường độ dòng (tần số 80 Hz, thời gian tích góp 120 s)
Hình 3.3b. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tích góp và tần số đến
cường độ dòng (biên độ xung 0,1 V, bước thế 0,007 V)
Mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng với giá trị cường độ dòng điện được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ dòng điện và các thông số thời gian tích góp, tần số, biên độ xung, bước thế
Phương trình I = – 8,83 U1 – 20,94 U2 – 5,83 U3 – 20,17 U4 – 2,31 U1. U2 – 2,31 U2. U3 – 2,19 U3. U4
R2 = 0,991 Q2 = 0,932 U1: Thời gian tích góp U2: Tần số U3: Biên độ xung U4: Bước thế Chú thích
R2: Tính phù hợp Q2: Khả năng dự đoán
3.1.4.2. Khảo sát khoảng tuyến tính
- Mối quan hệ giữa nồng độ cefoperazon (0,01 ÷ 0,06 ppm) với cường độ dòng điện được đo bằng phương pháp cực phổ sóng vuông trong nền đệm B-R 4 biểu diễn trong bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính cefoperazon trong nền đệm B-R pH 4 C (ppm) Vị trí píc E (V) I (nA) 0,01 – 0,749 – 112 0,02 – 0,763 – 172 0,03 – 0,756 – 230 0,04 – 0,756 – 288 0,05 – 0,749 – 348 0,06 – 0,742 – 393
Hình 3.4. Cực phổ đồ sóng vuông sự phụ thuộc cường độ dòng vào nồng độ cefoperazon (0,01 → 0,06 ppm) trong nền đệm B-R pH 4
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn cefoperazon trong nền đệm B-R pH 4
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của cefoperazon (0,01 → 0,07 ppm) trong nền đệm B-R pH 4 khi có mặt của sulbactam 0,03 ppm
C (ppm) Vị trí píc E (V) I (nA) 0,01 – 0,819 – 83,4 0,02 – 0,819 – 143 0,03 – 0,819 – 205 0,04 – 0,819 – 267 0,05 – 0,819 – 329 0,06 – 0,819 – 385 0,07 – 0,819 – 448
Hình 3.6. Cực phổ đồ sóng vuông biểu diễn sự tương quan cường độ dòng điện với nồng độ cefoperazon (0,01 → 0,07 ppm) trong đệm B-R pH 4 khi có
mặt sulbactam 0,03 ppm
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn cefoperazon trong nền đệm B-R pH 4 khi có mặt sulbactam 0,03 ppm
3.1.4.3. Độ lặp và độ đúng
Độ lặp và độ đúng của phương pháp được xác định dựa trên kết quả của phép đo 6 dung dịch chuẩn cefoperazon 0,03 ppm pha từ chuẩn gốc 500 ppm trong cùng điều kiện. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 và bảng 3.6
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp và độ đúng của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm Lần I (nA) Vị trí píc E (V) % Tìm lại 1 – 233 – 0,749 101,2 2 – 225 – 0,749 97,9 3 – 232 – 0,749 100,8 4 – 230 – 0,742 99,9 5 – 231 – 0,742 100,4 6 – 242 – 0,742 98,3 SD 1,4 TBC 99,75 RSD 1,4%
Bảng 3.6 .Kết quả khảo sát độ lặp và độ đúng của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm khi có sulbactam 0,03 ppm Lần I (nA) Vị trí píc E (V) % Tìm lại 1 – 200 – 0,819 97,3 2 – 202 – 0,833 98,4 3 – 203 – 0,819 98,9 4 – 205 – 0,826 100,0 5 – 206 – 0,826 100,6 6 – 208 – 0,819 101,6 TBC 99,45 SD 1,5 RSD 1,5%
3.2. Ứng dụng phương pháp cực phổ sóng vuông để định lượng cefoperazon trong các chế phẩm trên thị trường cefoperazon trong các chế phẩm trên thị trường
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch thử
- Thuốc bột pha tiêm đơn thành phần: Cefoperazon 1 g
Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng khoảng 0,0500 g cefoperazon định mức với nước thành 100 ml. Lấy 0,5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước vừa đủ được dung dịch thử.
- Thuốc bột pha tiêm hai thành phần: Cefoperazon kết hợp với sulbactam tỉ lệ 1:1.
Cân chính xác một lượng thuốc tương ứng khoảng 0,0500 g cefoperazon định mức với nước thành 100 ml. Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước vừa đủ được dung dịch thử.
3.2.2. Kết quả định lượng
Tiến hành định lượng bằng phương pháp đường chuẩn, lấy 0,3 ml dung dịch thử định mức thành 25 ml với dung dịch đệm B-RpH. Đo dòng cực phổ sóng vuông với các thông số sau:
Thế tích góp – 0,3 V Thời gian tích góp 120 s Thời gian cân bằng 10 s Biên độ xung 0,1 V Tần số 80 Hz Bước thế 0,007 V Tốc độ khuấy 2000 vòng/ phút Khoảng thế – 0,3 ÷ – 1,2 V Thời gian sục khí 100 s Kích cỡ giọt 4
Kết quả định lượng được trình bày ở (hình 3.6a và b) và (bảng 3.7) (ví dụ với chế phẩm Cefobid và Sulperazon). Kiểm định t ghép cặp với độ tin cậy 95% cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh kết quả định lượng các chế phẩm đã khảo sát bằng cực phổ sóng vuông và HPLC.
Hình 3.8a. Cực phổ đồ sóng vuông của cefoperazon trong chế phẩm Cefobid
Hình 3.8b. Cực phổ đồ sóng vuông của cefoperazon trong chế phẩm Sulperazon
Bảng 3.7. Kết quả định lượng các chế phẩm có chứa cefoperazon trên thị trường
Chế phẩm Hàm lượng % so với nhãn (TBC± SD, n = 6) Cực phổ sóng vuông HPLC Cefobid 101,2 ± 1,2 100,8 ± 1,3 Neoaxon 100,2 ± 0,5 100,7 ± 0,7 Sulperazon 101,1 ± 1,2 100,4 ± 0,9 Jincetam 100,8 ± 1,1 99,8 ± 0,7 Bacamp 99,9 ± 1,3 100,9 ± 1,1 Cefactam 102,3 ± 0,4 100,1 ± 1,1
Trong nghiên cứu này, phương pháp HPLC được sử dụng làm phương pháp đối chiếu.
Điều kiện sắc ký:
- Cột: Apollo C18 150 mm x 4,6 mm, 5 µm - Detector UV: 210 nm
- Tốc dộ dòng: 0,8 ml/phút
- Pha động: Hỗn hợp acetonitril : acid photphoric pH 3,2 (60 : 40, tt/tt)
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Hình 3.9 biểu diễn sắc ký đồ của chuẩn cefoperazon 20 ppm. Các thông số của quá trình sắc ký được trình bày trong bảng
Số tt Thông số Cefoperazon 1 Độ lặp RSD < 2% 2 Độ đúng 99 – 101% 3 Khoảng tuyến tính 10 – 35 mg/l R2 > 0,990 4 Hệ số bất đối AF = 0,8 5 Số đĩa lý thuyết /m 44000 6 Thời gian lưu (phút) 4,4
Hình 3.9. Sắc kí đồ của dung dịch chuẩn cefoperazon 20 ppm
Bàn luận:
Cực phổ đồ vôn-ampe vòng của dung dịch cefoperazon 0,03 ppm trong nền đệm vạn năng (Britton – Robinson) với pH 3 ÷ 6 cho thấy có duy nhất một píc không thuận nghịch tương ứng với quá trình khử catod trong khoảng thế – 0,3 ÷ – 1,2 V (hình 3.1a).
Hình 3.10. Công thức cấu tạo của cefoperazon
Theo lý thuyết, sự xuất hiện của píc này có thể là do sự khử liên kết đôi ở vị trí C3 – C4 hoặc nguyên tử nitơ ở vị trí liên kết với C7 (hình 3.10) [18]. Đây là hai vị trí nghèo điện tử có khả năng nhận điện tử trong điều kiện pH < 6.Với 2 vị trí này, khi tiến hành khử cực phải xuất hiện hai píc trên cực phổ đồ. Tuy nhiên do hiệu ứng liên hợp e vào vòng (C3 – C4) và sự án ngữ không gian làm cho vị trí C3 khó nhận điện tử hơn so với nitơ ở vị trí C7. Do vậy píc khảo sát được có thể do sự khử nitơ ở vị trí C7 theo phương trình sau:
Thế của píc có khuynh hướng dịch chuyển về giá trị âm hơn khi tăng pH chứng tỏ có sự tham gia của proton trong phản ứng điện cực. Mối quan hệ tuyến tính giữa píc và pH của đệm được biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính E = – 0,0537 pH – 0,792, với R2 = 0,9994 (hình 3.1b). Giá trị độ
dốc của phương trình này 53,7 mV = 59/α.(m/na). Trong đó m và na là số proton và số electron tham gia phản ứng khử cực; α là hệ số chuyển đối xứng. Với cơ chế phản ứng như đã đề xuất ở trên, m = 1 và na = 2 → α = 0,55 chứng tỏ cefoperazon tham gia phản ứng không thuận nghịch trên điện cực giọt thủy ngân.
Trong khóa luận này, việc tối ưu hóa điều kiện phân tích được bắt đầu bằng lựa chọn loại dung dịch đệm. Sự xuất píc trên cực phổ đồ sóng vuông của cefoperazon 0,03 ppm trong các nền đệm phosphat, acetat, B-R pH 4 cho thấy đệm B-R phù hợp nhất cho phép định lượng (hình 3.2c). Qui hoạch hóa thực nghiệm theo thiết kế mặt phức hợp trung tâm sử dụng phần mềm Modde 9.1 (bảng 3.1) đã xác định điều kiện tối ưu của phép định lượng bằng cực phố sóng vuông trên điện cực giọt thủy ngân như sau:
Thế tích góp – 0,3 V Thời gian tích góp 120 s Thời gian cân bằng 10 s Biên độ xung 0,1 V Tần số 80 Hz Bước thế 0,007 V Tốc độ khuấy 2000 vòng/phút Khoảng thế – 0,3 → – 1,2 V Thời gian sục khí 100 s Kích cỡ giọt 4
Trên cơ sở các điều kiện phân tích được lựa chọn ở trên, phép định lượng cefoperazon trong chế phẩm được thẩm định theo các tiêu chí khoảng tuyến tính độ lặp và độ đúng.
Kết quả cho thấy các thông số được lựa chọn trên máy cực phổ Computrate