- Là kỹ thuật chiết dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các
chất có ảnh hưởng đến chất phân tích, làm giàu chất trước khi phân tích chúng. Kỹ thuật này có thể làm giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ, chiết có chọn lọc các chất cần quan tâm, thời gian chiết nhanh, hiệu quả chiết cao, và độ lặp lại cao.
- Ứng dụng: kỹ thuật SPE được áp dụng rộng rãi để chiết tách, tinh chế,
làm giàu mẫu, đặc biệt hiệu quả cho các mẫu dịch sinh học, phân tích vi lượng, môi trường….
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương tiện nghiên cứu.
2.1.1. Máy móc, thiết bị
Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck (Đức).
Cân Metler Toledo (d=0,01 mg, e= 0,1 mg). (Thụy Sỹ)
Máy siêu âm RK 106 (Đức).
Máy ly tâm Hettich zentrifugen (Đức).
Tủ hốt Fume Hoot Up (Đức).
Tủ sấy Memmert (Đức).
Tủ sấy chân không Shel lab (Đức).
Bếp đun cách thủy.
Buồng soi Vilber Lourmat hai bước sóng 254nm và 366nm (Pháp)
Bộ thiết bị sắc ký: CAMAG Nanomat 4 (Thụy Sỹ)
Bình định mức, pipet, ống đong, cốc có mỏ, ống nghiệm, và các dụng
cụ cần thiết khác.
2.1.2. Hóa chất thuốc thử
Chất chuẩn sildenafil citrate đối chiếu (Viện Kiểm Nghiệm thuốc
Trung Ương): hàm lượng: 98,86 % (khan), hàm ẩm: 2,01%.
Dicloromethan tinh khiết phân tích - Merck.
Diethyl ether tinh khiết phân tích – Merck.
Na2CO3 tinh khiết phân tích - Merck.
Methanol tinh khiết hóa học – Trung Quốc.
Ethylacetat tinh khiết hóa học – Trung Quốc.
Tricloromethan tinh khiết hóa học - Trung Quốc.
2.2.Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nền mẫu:
+ Mục đích: lựa chọn nền mẫu để làm mẫu đối chiếu khi ứng dụng kiểm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tra một số mẫu đông dược.
+ Nền mẫu lựa chọn là viên bao phim Bách Bệnh (Tuệ Linh).
Với thành phần: Cao khô bách bệnh……….. 250mg Cao khô nhân sâm…………50mg Cao khô bạch tật lê………..200mg Tinh bột sắn……….210mg
- Sản phẩm đông dược có tác dụng bổ thận, tráng dương, tăng cường khả
năng sinh lý nam giới:
Bảng 2.1: Một số sản phẩm đông dược ứng dụng kiểm tra.
STT Tên sản phẩm Xuất xứ Đặc điểm Mã hóa
1 Xích Thố Vương 1 Công ty cổ phần dược phẩm Gia Nguyễn
Lô SX : 003/13
NSX : 22/01/2013
HD : 22/01/2015
XGN1
2 Xích Thố Vương 2 Công ty cổ phần dược phẩm Gia Nguyễn Lô SX : 004/13 NSX : 23/03/2013 HD : 23/03/2015 XGN2 3 Xích Thố Vương
Công ty cổ phần đầu tư và sản xuất Âu Cơ.
Lô SX : 010112 NSX : 14/01/2012 HD : 13/01/2014 XAC 4 YANGCHUN-
SAMNOK Korea General Mannyon
Health Corporation Lô SX: 34737:2010 NSX : 10/2012 HD : 10/2015 YCS1 5
ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS
Velours
Uncle Bill Trading Inc. Scarborough, Ontario M1B3V3, Canada. Lô SX : 100119 HD : 10/12/2013 EAV 6 YANGCHUN- SAMROK
Korea General Mannyon Health Corporation
NSX : 05/2012
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích: điều kiện sắc ký, điều kiện phát
hiện, xử lý mẫu.
- Đánh giá phương pháp: độ chọn lọc, độ lặp lại, xác định LOD.
- Ứng dụng: áp dụng quy trình xây dựng được kiểm tra một số mẫu chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết hệ dị thể rắn-lỏng.
Xây dựng các điều kiện của phương pháp SKLM để phát hiện sự có mặt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của sildenafil: trong mẫu tự tạo có gây nhiễm sildenafil, và một số mẫu đông dược trên thị trường.
Sau khi tiến hành thực nghiệm, thu thập dữ liệu, xử lý và đánh giá kết quả.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Chuẩn bị:
+ Pha dung dịch chuẩn gốc: cân 10 mg Sildenafil citrate (SC) hòa tan và
pha loãng trong vừa đủ 10ml MeOH, được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1mg/ml đem chấm sắc ký.
+ Thể tích chấm V= 2µl.
Tiến hành khảo sát các hệ dung môi khai triển sau:
1. Ethyl acetat : cloroform : nước : methanol (40:40:15:11).
2. Ethyl acetat : cloroform (4:1) .
3. Methanol : cloroform (4:1) .
Kết quả thu được khi phát hiện ở bước sóng 254nm:
a: hệ dung môi 1. b: hệ dung môi 2. c: hệ dung môi 3.
Hình 3.1 : SKĐ khảo sát hệ dung môi khai triển
Nhận xét:
Hệ dung môi khai triển 1: Rf của chất phân tích là 0.2, vết gọn, rõ nét.
Tuy nhiên, thành phần hệ phức tạp và các dung môi trong hệ có tốc độ bay hơi khác nhau nhiều do đó cần thời gian bão hòa dung môi lâu và khó đồng đều.
Hệ dung môi khai triển 2: Sildenafil hầu như ở nguyên vị trí chấm sắc
ký.
Hệ dung môi khai triển 3: Rf của chất phân tích là 0.7, vết gọn, rõ nét.
Thành phần hệ đơn giản và thời gian bão hòa dung môi trước khi chạy ngắn hơn hệ 1.
Kết luận: có thể chọn hệ 1 hoặc hệ 3 để tiến hành khai triển sắc ký, tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn hệ 3 vì SKĐ của hệ 3 quan sát được rõ, cân đối, đẹp hơn và thời gian tiến hành ngắn hơn.
Từ kết quả thu được điều kiện sắc ký:
Hệ dung môi khai triển: Methanol : cloroform (4:1)
3.1.2. Khảo sát điều kiện phát hiện
Chuẩn bị:
+ Dung dịch chuẩn gốc: như 3.1.1, nồng độ 1mg/ml đem chấm sắc ký.
+ Thể tích chấm V= 2µl.
+ Hệ DMKT: MeOH : chloroform (4:1). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khảo sát các phương pháp phát hiện vết, gồm:
1.Phun hiện màu bằng thuốc thử :
STT Thuốc thử Màu phát hiện
1 Dragendroff Nâu đỏ
2.Phát hiện bằng đèn tử ngoại các bước sóng: λ= 254nm. λ = 366nm. Kết quả khảo sát: a: phát hiện ở λ= 254nm. b: phát hiện ở λ= 366nm.
c: phát hiện bằng phun TT 10% H2SO4/EtOH, soi λ=366nm.
d: phát hiện bằng phun TT Dragendroff.
Nhận xét:
Khi phát hiện ở λ= 254nm cho hình ảnh sắc ký đồ là vết tối trên nền
sáng do đó ta dễ dàng quan sát được. Tuy nhiên nếu khả năng tách của hệ dung môi khai triển không tốt, 2 vết có Rf tương đương có thể lại là 2 chất khác nhau. Để loại trừ khả năng đó ta tiến hành phát hiện ở λ= 366nm cho vết
a b c d
sắc ký phát huỳnh quang đặc trưng. Kết quả trên SKĐ b cho thấy ở λ= 366nm Sildenafil có phát huỳnh quang.
Kết quả phát hiện bằng thuốc thử hiện màu hình ảnh của vết xuất hiện
rõ trên SKĐ chúng ta có thể quan sát được. Việc phát hiện bằng TT Dragendroff vết cho màu đậm hơn (nhạy hơn), dễ phát hiện hơn vì vết có thể quan sát được dưới ánh sáng trắng (mắt thường).
Tuy nhiên, việc phát hiện ở λ=254nm đơn giản và dễ dàng nhận biết
vết hơn. Vì vậy, chúng tôi chọn soi ở λ= 254nm là điều kiện phát hiện chủ yếu trong các sắc ký đồ thu được phần tiếp theo và dùng dùng kết quả phát hiện ở λ= 366nm kiểm tra song song khi cần thiết.
3.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
Lựa chọn dung môi xử lý mẫu:
Lựa chọn kỹ thuật chiết hệ dị thể rắn-lỏng để chiết xuất Sildenafil ra khỏi nền mẫu. Qua các tài liệu tham khảo, lựa chọn một số dung môi để đem chiết xuất sildenafil citrate từ nền mẫu tự tạo gồm: methanol, ethyl acetat, diethyl ether : dicloromethan (6:4).
Sau quá trình khảo sát, chúng tôi lựa chọn được hệ dung môi chiết xuất phù hợp là diethyl ether: dicloromethan (6:4) để chiết hoạt chất ra khỏi nền mẫu.
Quy trình xử lý mẫu cụ thể như sau:
+ Dung dịch chuẩn gốc: cân 10 mg SC hòa tan và pha loãng vừa đủ trong
10ml MeOH, được dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml.
+ Dung dịch chuẩn: lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc cho vào ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy, thêm 0,5ml Na2CO3 0,1M, để yên trong 5 phút. Thêm 10ml hỗn hợp diethyl ether : dicloromethan (6:4), lắc 2 phút, siêu âm trong 20 phút. Dịch thu được bốc hơi dung môi đến khô trên cách thủy. Hòa tan cắn trong 1ml MeOH. Thu được dung dịch chuẩn để chấm sắc ký.
+ Mẫu lai nhiễm Sildenafil: Lấy 1,0g bột nền mẫu, thêm 1ml dung dịch chuẩn gốc cho vào ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy. Thêm 0,5 ml dd Na2CO3 0,1M, lắc đều, để yên 5 phút. Thêm 10ml hỗn hợp dung môi diethyl ether : dicloromethan ( 6:4 ), lắc trong 2 phút, siêu âm 20 phút, sau đó ly tâm 5000r/p × 5p. Lọc, thu dịch chiết vào cốc có mỏ. Tiến hành chiết tiếp 2 lần nữa tương tự lần 1 với 5ml hỗn hợp dung môi, gộp dịch chiết cả 3 lần lại, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml MeOH, thu được dịch chiết đem chấm sắc ký.
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn và mẫu lai nhiễm Sildenafil với các điều kiện:
+ Vchấm = 2 µl.
+ Hệ DMKT: MeOH : chloroform (4:1).
+ Phát hiện ở λ= 254nm, λ= 366nm.
Kết quả được trình bày ở hình 3.3: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3: SKĐ khảo sát dung môi chiết
Methanol Ethyl acetat Diethyl ether: dicloromethan
(6:4)
- Nhận xét: kết quả ở hình 3.3 cho thấy:
+ MeOH là dung môi chiết không chọn lọc, kết quả cho nhiều tạp, quá trình bay hơi dung môi lâu vết không gọn.
+ Ethyl acetat chiết có chọn lọc hơn, tuy nhiên thời gian bay hơi dung môi
lâu, vết biến dạng.
+ Hỗn hợp dung môi chiết diethyl ether: dicloromethan (6:4) vừa chiết chọn lọc, vết gọn, bay hơi dung môi nhanh.
Kết luận: Lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết diethyl ether: dicloromethan (6:4).
Tóm lại: Xây dựng được các điều kiện tiến hành sắc ký gồm:
+ Thể tích chấm V= 2µl.
+ Hệ DMKT: Methanol : chloroform (4:1).
+ Phát hiện: soi λ= 254nm (chủ yếu), và soi λ= 366nm hoặc phun TT Dragendroff, 10% H2SO4/EtOH kiểm tra song song khi cần thiết.
3.2. Đánh giá phương pháp 3.2.1. Độ chọn lọc
Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch chuẩn: như phần chuẩn bị mục 3.1.3.
Mẫu trắng: Lấy 1,0g bột nền mẫu, cho vào ống nghiệm thủy tinh có nút
xoáy. Thêm 0,5 ml dd Na2CO3 0,1M, lắc đều, để yên 5 phút. Thêm 10ml hỗn hợp dung môi diethyl ether : dicloromethan ( 6:4 ), lắc trong 2 phút, siêu âm 20 phút, sau đó ly tâm 5000r/p × 5p. Lọc, thu dịch chiết vào cốc có mỏ. Tiến hành chiết tiếp 2 lần nữa tương tự lần 1 với 5ml hỗn hợp dung môi, gộp dịch chiết cả 3 lần lại, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml MeOH, thu được dịch chiết đem chấm sắc ký.
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu lai nhiễm Sildenafil với các điều kiện như đã chọn ở phần 3.1.
Kết quả được trình bày ở hình 3.4:
Nhận xét:
Trên SKĐ của mẫu lai nhiễm Sildenafil (3) thấy xuất hiện vết có Rf và màu sắc tương đương vết thu được trên SKĐ của Sildenafil chuẩn kể cả phát hiện ở λ= 254nm và λ= 366nm.
Mẫu trắng không cho vết tương ứng về vị trí với vết Sildenafil chuẩn.
Phương pháp có độ chọn lọc cao.
3.2.2. Độ lặp lại
Xác định độ lặp lại:
Chiết lặp lại 6 mẫu lai nhiễm Sildenafil giống nhau với lượng SC thêm vào các mẫu đều bằng 1ml dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml. Sau đó dịch chiết thu được đem chấm sắc ký. Đánh giá độ lặp lại bằng việc quan sát các vết
1: dung dịch chuẩn. 2: mẫu trắng. 3: mẫu lai nhiễm SD. Hình 3.4: SKĐ đánh giá độ chọn lọc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của 6 mẫu trên SKĐ, đồng thời đánh giá bằng diện tích pic vết của 6 mẫu nhờ
sự trợ giúp của phần mềm Videoscan. Tính RSD của Spic, yêu cầu RSD ≤ 5%.
Song song tiến hành sắc ký mẫu dung dịch chuẩn nồng độ 1 mg/ml.
Tiến hành:
+ Chuẩn bị dung dịch chuẩn 1mg/ml: như 3.1.3. + Chiết mẫu lai nhiễm Sildenafil như mục 3.1.3.
+ Khai triển sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn ở mục 3.1.
+ SKĐ được phát hiện ở bước sóng 254nm và phun thuốc thử Dragendroff hiện màu để quan sát bằng mắt thường
- Kết quả được trình bày ở hình 3.5:
1: dd SD chuẩn.
27: dịch chiết mẫu lai nhiễm SD.
Xử lý kết quả bằng phần mềm Videoscan Kết quả được trình bày ở hình 3.6:
Bảng 3.1: Kết quả đánh giá độ lặp lại STT vết Rf Svết Chuẩn 0.662 121861.4 2 0.628 86926.3 3 0.631 90249.3 4 0.643 90326.0 5 0.648 87284.7 6 0.645 97157.8 7 0.642 88347.6 TB 0.639 90048.6 RSD (%) 1.26 4.18 Nhận xét về độ lặp lại: Độ lặp lại:
+ Bằng quan sát: nhận thấy 6 vết chấm lặp lại của 6 lần chiết có Rf tương
đối bằng nhau, diện tích và cường độ vết cũng tương tự nhau.
+ Bằng tính toán: theo kết quả tính được ở bảng 3.1 ta nhận thấy độ lặp lại
của quy trình chiết xuất là chấp nhận được. RSD của Rf = 1,26%, RSD của Spic= 4,18%, thỏa mãn yêu cầu.
Kết luận: quy trình phân tích cho độ lặp lại phù hợp để tiến hành chiết xuất các mẫu thử đem kiểm tra.
3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD).
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất mà tại đó ta còn nhận biết được vết qua quan sát bằng mắt thường khi đem soi UV hay phun thuốc thử hiện màu, hoặc tỷ số giữa đáp ứng của vết chất phân tích và nhiễu đường nền khoảng 3 lần.
+ Cách tiến hành:
Thêm vào 1,0g bột nền mẫu lần lượt các thể tích chính xác dung dịch chuẩn gốc chứa 1 mg – 0,5 mg – 0,25 mg – 0,125 mg Sildenafil citrate và tiến hành xử lý mẫu như quy trình xử lý mẫu lai nhiễm Sildenafil ở mục 3.1.3. Thu được các dịch chiết lần lượt có nồng độ tính theo lý thuyết là 1 mg/ml – 0,5 mg/ml – 0,25 mg/ml – 0,125 mg/ml.
+ Tiến hành khai triển sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn ở mục 3.1.
+ Kết quả được thể hiện trong hình 3.7:
1: dung dịch Sildenafil chuẩn 1mg/ml.
25: dịch chiết có nồng độ giảm dần lần lượt như trên.
+ Sắc ký đồ analog của các mẫu được trình bày ở hình 3.8:
+ Nhận xét: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quan sát bằng mắt thường khi soi UV hay phun thuốc thử hiện màu ta
nhận thấy vết còn phát hiện được là tại nồng độ 0,25mg/ml ( 250 ng/µl × 2µl=500 ng/vết)
Kết quả pic hóa cho thấy tại nồng độ 0,125 mg/ml chiều cao pic bằng 3
lần nhiễu đường nền chọn giới hạn phát hiện là 0,125mg/ml ( 0,125
ng/µl × 2µl=250ng/vết)
Kết luận: Giới hạn phát hiện xác định được:
Biện pháp phát hiện LOD
Bằng quan sát 500 ng/vết
Bằng máy 250 ng/vết
Nhận xét chung: Sau khi tiến hành xây dựng và đánh giá phương pháp ta đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp để tiến hành kiểm tra một số mẫu thử.
3.3.Áp dụng phương pháp kiểm tra một số mẫu
3.3.1 Quy trình xử lý mẫu thử và điều kiện khai triển sắc ký
- Tiến hành xử lý mẫu:
Lấy lượng bột thuốc tương đương khối lượng 2 viên nang mẫu thử, nghiền thành bột thô, cho vào ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy. Thêm 0,5ml Na2C03 0,1M, lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 10ml hỗn hợp dung môi diethyl ether : dicloromethan (6:4), lắc kỹ trong 2 phút, đem siêu âm trong 20 phút . Ly tâm 5000r/p × 5p. Lọc, thu dịch chiết vào cốc có mỏ. Tiến hành chiết 2 lần tương tự lần 1 với 5ml dịch chiết. Gộp dịch chiết của cả 3 lần, đem cô cách thủy đến cắn, sau đó tùy vào lượng cắn thu được đem hòa tan trong