• Nhiệt độ nóng chảy (KS1): 186,4ºC.
• Phổ tử ngoại (KS1): cho các đỉnh hấp thụ ở: 207nm, 341nm, 443nm. Từ đó, dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc điểm trên.
• Phổ khối MS (KS1): phân tử lượng của KS thu được dự đoán là 1268 đvC.
• Phổ hồng ngoại IR (KS1): Dựa vào các đỉnh hấp thụ trên phổ IR (hình P15) có thể dự đoán trong cấu trúc phân tử kháng sinh có các nhóm chức :
+ 3432 cm-1 đặc trưng cho liên kết N - H (amid, amin bậc 1 hoặc bậc 2). + 2928; 2962 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – H (alkan).
+ 2582 cm-1 đặc trưng cho liên kết O – H (acid).
+ 1743 cm-1 đặc trưng cho liên kết C = O (ester, ceton, aldehyd).
+ 1650 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức amid (R-CO-NR’R”) hoặc imin (C = N).
+ 1473 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức C=C(aromatics). + 1298 cm-1 đặc trưng cho liên kết S = O hoặc liên kết C = F. + 1263 cm-1 đặc trưng cho liên kết C- O- C( alcol).
+ 870; 798 cm-1 đặc trưng cho liên kết C = C (alken). + 723 cm-1 đặc trưng cho CH2 (alkan).
+ 705 cm-1 đặc trưng cho nhóm alkyl clorid. + 634 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – Br.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu, về cơ bản đã hoàn thành các mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp và kết quả thu được như sau:
Chủng Streptomyces 168.27 đã được chọn lọc ngẫu nhiên và gây đột biến 2 lần bằng ánh sáng UV, đột biến hóa học. Biến chủng sau đột biến hóa học có hoạt tính kháng sinh tăng lên nhiều, đặc biệt trên vi khuẩn Gram(-) so với chủng gốc.
Lựa chọn được môi trường nuôi cấy, lên men tối thích là MT2, MT2dt. Kháng sinh do Streptomyces 168.27 sinh tổng hợp được chiết từ dịch lên men bằng Ethylacetat ở pH 5, tinh chế bằng phương pháp sắc ký rửa giải trên cột.
Kháng sinh do Streptomyces 168.27 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:
Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn Gram(-)
Kém bền với nhiệt độ.
Bền với pH acid, vùng trung tính, không bền với pH base mạnh.
Có ít nhất 4 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được
Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng KS1: 21,23%; KS2: 15,73%
Kháng sinh sau tinh chế có nhiệt độ nóng chảy 186,40C, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại, với khối lượng phân tử dự đoán 1268 đvC. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố. Các nhóm chức có trong kháng sinh là: Alkan, Alken, Sulfon, Alkyl clorid , Imin, Nitro, Amid, Ester, Amin...
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:
Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống bằng nhiều phương pháp khác nhau (đột biến bậc thang, đột biến hóa chất...), khảo sát điều kiện lên men tối ưu để tạo ra các biến chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh với sản lượng và hoạt tính cao.
Giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces 168.27.
Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn.
Tiếp tục đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh, tiến hành nghiên cứu thêm về các tính chất vật lý, hóa học, dược lý…của kháng sinh thu được để tiến tới sản xuất công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2.
2. Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến và ứng dụng trong định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật.
3. Bộ Y tế (2007), Dược lý học 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr. 130-142. 4. Bộ Y tế (2006), Hóa dược, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2.
5. Bộ Y tế (2008), Hóa phân tích, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2.
6. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr.26-40, 81-93.
7. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 22-87. 8. Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật. 9. Nguyễn Lân Dũng(1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXBKHKT Hà Nội, Tập 1, tr. 328 - 345.
10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, tr. 38-40.
11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu-Phân loại xạ khuẩn
12. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, luận văn thạc sỹ sinh học.
13. Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp.
14. Hồ Viết Quý (2002), Chiết, tách, phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ I, Nhà xuất ản Khoa học và kỹ thuât, tr. 9-52.
15. Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 35-57.
17. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr. 40-52.
18. Cao Văn Thu (1998), Bài giảng về kháng sinh và vitamin, Hà Nội, Việt Nam.
Tiếng Anh
19. Crnovčić I, Vater J, Keller U, Occurrence and biosynthesis of C- demethylactinomycins in actinomycin-producing Streptomyces chrysomallus and Streptomyces parvulus, Institut fuer Chemie, Arbeitsgruppe Biochemie und Molekulare Biologie, Technische Universitaet Berlin, Berlin-Charlottenburg, Germany
20. Makoto Takagi (2006), Basic analytical chemistry, the Kagakudojin publisher, Japan.
21. Sudha, S, Masilamani, Selvam M, Characterization of cytotoxic compound from marine sediment derived actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4, Asian Pacific journal of tropical biomedicine (Asian Pac J Trop Biomed) ), vol. 2 (10): 770-3, 2012
22. Vasanthakumar A, Kattusamy K, Prasad R, Regulation of daunorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius - feed forward and feedback transcriptional control, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 1G, Royal Parade, Parkville, Melbourne, Victoria, Australia
PHỤ LỤC
Hình P7: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến 1.
Hình P8: Thử hoạt tính KS các biến chủng sau ĐB1 bằng phương pháp khối thạch (P. mirabilis).
Hình P9: Thử HTKS của các MT lên men.
Hình P11: Kết quả sắc kí lớp mỏng hiện hình bằng VSV
Hình P12: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột bằng phương pháp khoanh giấy lọc (P.mirabilis)
Hình P13: Sắc ký cột.
Hìn h p16: Kế t quả đo phổ hồng ngoại .
Hìn h P17: Kế t qủa đo khối phổ (negat ive )
Hìn h P1 8 : Kế t quả đo khối phổ (positi ve)