TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM TRÊN THỊ TRƢỜNG.
Phƣơng pháp chọn mẫu thị trƣờng đƣợc trình bày ở mục 2.3.3.
Tiến hành xử lý các sữa thị trƣờng và chạy sắc ký với điều kiện nhƣ mục 3.1.4. Mỗi mẫu làm 1 lần.
Hàm lƣợng các vitamin trong mẫu đƣợc tính theo công thức sau:
X (mg/100g)=
Trong đó: Ct: nồng độ của các vitamin trong mẫu thử tính theo đƣờng chuẩn (ppm) f: hệ số pha loãng của mẫu thử.
V: thể tích mẫu thử trƣớc khi pha loãng (ml). m: khối lƣợng mẫu thử (g).
Bảng 3.16: Hàm lƣợng vitamin B1 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng. Hàm lƣợng vitamin (mg/100g) Tên sản phẩm
Địa điểm 1 Địa điểm 2 Địa điểm 3 Trên nhãn
Sản phẩm 1 0,761 0,724 0,841 0,580 Sản phẩm 2 0,570 0,582 0,590 0,587 Sản phẩm 3 0,106 0,109 0,121 0,230 Sản phẩm 4 0,110 0,091 0,119 0,204 Sản phẩm 5 0,564 0,566 0,573 0,526 Sản phẩm 6 0,725 0,747 0,713 0,540 Sản phẩm 7 0,651 0,549 0,615 0,450 Sản phẩm 8 0,597 0,578 0,523 0,430 Sản phẩm 9 0,701 0,721 0,718 0,660 Sản phẩm 10 0,531 0,528 0,654 0,390
Bảng 3.17: Hàm lƣợng vitamin B2 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng. Hàm lƣợng vitamin (mg/100g) Tên sản phẩm
Địa điểm 1 Địa điểm 2 Địa điểm 3 Trên nhãn
Sản phẩm 1 0,554 0,613 0,561 1,000 Sản phẩm 2 0,934 0,912 0,956 1,300 Sản phẩm 3 0,837 0,890 0,873 1,130 Sản phẩm 4 0,781 0,817 0,855 1,170 Sản phẩm 5 0,769 0,815 0,788 1,480 Sản phẩm 6 0,797 0,826 0,831 1,000
Sản phẩm 7 0,712 0,570 0,722 0,700
Sản phẩm 8 0,899 0,972 0,960 0,820
Sản phẩm 9 0,928 0,997 1,044 1,100
Sản phẩm 10 0,926 1,022 0,951 0,660
Bảng 3.18: Hàm lƣợng vitamin B6 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng. Hàm lƣợng vitamin (mg/100g) Tên sản phẩm
Địa điểm 1 Địa điểm 2 Địa điểm 3 Trên nhãn
Sản phẩm 1 0,745 0,768 0,608 0,730 Sản phẩm 2 0,532 0,637 0,644 0,625 Sản phẩm 3 0,000 0,000 0,000 0,110 Sản phẩm 4 0,000 0,000 0,000 0,120 Sản phẩm 5 0,425 0,597 0,544 0,526 Sản phẩm 6 0,295 0,305 0,308 0,320 Sản phẩm 7 0,447 0,354 0,369 0,385 Sản phẩm 8 0,238 0,247 0,231 0,310 Sản phẩm 9 0,445 0,381 0,427 0,400 Sản phẩm 10 0,247 0,191 0,293 0,410
Bảng 3.19: Hàm lƣợng vitamin B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng. Hàm lƣợng vitamin (mg/100g) Tên sản phẩm
Địa điểm 1 Địa điểm 2 Địa điểm 3 Trên nhãn
Sản phẩm 2 0,154 0,076 0,109 0,190 Sản phẩm 3 0,105 0,071 0,080 0,140 Sản phẩm 4 0,097 0,067 0,125 0,150 Sản phẩm 5 0,000 0,000 0,000 0,030 Sản phẩm 6 0,065 0,066 0,069 0,065 Sản phẩm 7 0,106 0,097 0,093 0,100 Sản phẩm 8 0,060 0,066 0,053 0,087 Sản phẩm 9 0,066 0,075 0,079 0,076 Sản phẩm 10 0,063 0,073 0,073 0,083 Nhận xét: - Vitamin B1: sản phẩm 2, 5, 9 có hàm lƣợng xấp xỉ trên nhãn (96,15% – 109,3%). Sản phẩm 3, 4 có kết quả hàm lƣợng thấp hơn hàm lƣợng ghi trên nhãn (44,4% - 58,2%). Các sản phẩm 1, 6, 7, 8, 10 đều cho hàm lƣợng B1 cao hơn trên nhãn (121,5% - 167,6%).
- Vitamin B2: sản phẩm 6, 7, 8, 9 có hàm lƣợng xấp xỉ so với trên nhãn (80,0% - 118,6%); các sản phẩm 1, 2, 3, 4, 5 có kết quả hàm lƣợng thấp hơn hàm lƣợng ghi trên nhãn (51.9% - 78,8%); sản phẩm 10 có hàm lƣợng cao hơn trên nhãn (140,3% - 154,9%).
- Vitamin B6: Các sản phẩm 1, 2, 5, 6, 7, 9 đều cho kết quả hàm lƣợng vitamin xấp xỉ hàm lƣợng trên nhãn (80,7% – 116,1%). Sản phẩm 8, 10 có kết quả hàm lƣợng B6 thấp hơn trên nhãn (46,6% - 79,6%). Đặc biệt, sản phẩm 3 và 4 đều không tìm thấy vitamin B6 ở cả 3 địa điểm.
- Vitamin B9: sản phẩm 6, 7, 9 cho hàm lƣợng B9 xấp xỉ lƣợng trên nhãn (87,2% - 105,8%). Các sản phẩm 1, 2, 3, 4, 8, 10 có kết quả hàm lƣợng thấp hơn hàm lƣợng nghi trên nhãn (39,8% - 76,3%). Đặc biệt, sản phẩm 5 không tìm thấy viatmin B9 ở cả 3 địa điểm.
BÀN LUẬN
1. Phương pháp xử lý mẫu.
Mẫu sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em chứa các vitamin B1, B2, B6 và B9 đƣợc hòa tan trong nƣớc 18MΩ, kết tủa loại protein bằng TCA, sau đó siêu âm, lọc thu dịch để bơm chạy sắc ký. Phƣơng pháp xử lý mẫu này có ƣu điểm: đơn giản; phân tích đƣợc đồng thời bốn vitamin, thời gian phân tích hợp lý; thiết bị thông dụng, dễ thực hiện trong phòng thí nghiệm ở Việt Nam, dễ triển khai, tiết kiệm chi phí.
2. Khảo sát điều kiện sắc ký HPLC.
Các điều kiện sắc ký HPLC đƣợc khảo sát dựa trên những nghiên cứu trƣớc đó và tài liệu đã công bố. Nghiên cứu này khảo sát 3 yếu tố: cột sắc ký, gradient pha động và detector cùng bƣớc sóng phát hiện. Kết quả đã chọn đƣợc những điều kiện sắc ký cho hiệu suất cao và thời gian chạy sắc ký phù hợp.
Ƣu điểm: điều kiện sắc ký tƣơng đối đơn giản và cho khả năng tách tốt các vitamin trong mẫu nhiều thành phần, rút ngắn thời gian phân tích. Đồng thời phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp hiện đại đƣợc ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam do có những ƣu điểm nối trội về độ ổn định, độ chính xác cao.
Việc đánh giá phƣơng pháp qua những tiêu chí thẩm định phƣơng pháp cho thấy chƣơng trình HPLC đã xây dựng là đáng tin cậy. Ngoài ra, đa số các trung tâm kiểm nghiệm và cơ sở sản xuất hiện nay đều có hệ thống HPLC, có thể triển khai và ứng dụng phƣơng pháp vào thực tế.
KẾT LUẬN
Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi có kết luận sau:
1. Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương pháp HPLC. Cụ thể là: Quy trình xử lý mẫu: + 4 ml nƣớc 18MΩ + Lắc xoáy khoảng 1 phút + 1ml TCA 20% + Vortex 1 phút. + Siêu âm 5 phút + Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút + Lọc
+ Rửa tủa, định mức bằng pha động A vừa đủ 10 ml
+ Hút 1ml dịch + 1 ml pha động A + Trộn đều, lọc qua màng lọc 0,45µm
Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột: 35oC. - Detector: PAD
- Bƣớc sóng phát hiện: Vitamin B1 tại 246nm, B2 tại 267nm, B6 và B9 tại 290nm - Pha động:
Hỗn hợp
Dịch lọc
Dịch tiêm sắc
ký
Cân 1g mẫu bột sữa vào ống nghiệm thủy tinh 15ml
Pha động A: 0,5g natri heptan sulfonat + 1,14g H3PO4 đặc. Hoàn tan, định mức vừa đủ 1 lít bằng nƣớc 18MΩ. Trộn đều, lọc qua màng lọc đƣờng kính lỗ lọc 0,45µm, rung siêu âm 15 phút.
Pha động B: Methanol.
Chế độ rửa giải: gradient theo thời gian:
- Thể tích tiêm: 20 µl.
2. Thẩm định được phương pháp định lượng đã xây dựng.
Kết quả thẩm định:
- Phƣơng pháp có tính chọn lọc với các vitamin: thời gian lƣu của vitamin B1, B2, B6, B9 lần lƣợt khoảng 21,1 phút; 16,9 phút; 14,6 phút; 16,3 phút. Pic của các vitamin rõ nét, cân đối và tách riêng ra khỏi các pic khác.
- Có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ của các vitamin:
Vitamin B1: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,054 ppm tới 2,430 ppm, hệ số r là 0,9998.
Vitamin B2: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,014 ppm tới 3,752 ppm, hệ số r là 0,9999.
Vitamin B6: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,061 ppm tới 1,217 ppm, hệ số r là 0,9997.
Vitamin B9: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,033 ppm tới 0,266 ppm, hệ số r là 0,9996 Thời gian (phút) Lƣu lƣợng dòng (ml/phút) %A %B Curve 0 1,00 90 10 4 1,00 90 10 6 18 1,00 60 40 6 22 1,00 90 10 11 25 1,00 90 10 11
- Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện của các vitamin B1, B2, B6, B9 lần lƣợt là là 0,012 ppm; 0,004 ppm; 0,014 ppm; 0,009 ppm; giới hạn định lƣợng lần lƣợt là 0,040 ppm; 0,012 ppm; 0,046 ppm; 0,028 ppm.
- Phƣơng pháp có độ thu hồi tốt: B1 (93,4%-95,5%), B2 (91,2%-97,1%), B6 (96,2%-103,3%), B9 (84,2%-91,2%); độ lặp lại và độ chính xác trung gian đảm bảo.
- Độ ổn định: các vitamin trong dịch chạy sắc ký ổn định trong vòng 24h sau khi xử lý mẫu xong (bảo quản -40C, tránh ánh sáng hoặc nhiệt độ phòng (250C), tránh ánh sáng).
3. Đã xác định được đồng thời hàm lượng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong 30 mẫu sữa công thức cho trẻ em trên thị trường.
- Hàm lƣợng bốn vitamin B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm tại các địa điểm khác nhau có sự dao động lớn so với hàm lƣợng đƣợc ghi trên nhãn: B1
(44,4% - 167,6%), B2 (51,9% - 154,9%), B6 (46,6% - 116,1%), B9 (39,8% - 105,8%).
- Sản phẩm 9 cho hàm lƣợng cả 4 vitamin đều xấp xỉ hàm lƣợng trên nhãn (81,7% - 111,3%) (ở cả 3 địa điểm).
- Sản phẩm 3, 4 cho hàm lƣợng cả 4 vitamin đều thấp hơn trên nhãn (0% - 78,8%) (ở cả 3 địa điểm).
- Vitamin B1, B2, B6, B9 là các vitamin tan trong nƣớc, kém bền trong đó vitamin B9 dễ bị phân hủy nhất bởi tác động của: nhiệt độ, ánh sáng, acid, base,… Vì vậy để đảm bảo hàm lƣợng các vitamin trong sản phẩm, các nhà sản xuất cần phải tuân thủ đúng yêu cầu kỹ thuật cũng nhƣ tiêu chuẩn an toàn thực thẩm của nhà nƣớc.
ĐỀ XUẤT
Dựa vào những kết quả đã đạt đƣợc từ khóa luận, chúng tôi xin đƣa ra một vài đề xuất nhƣ sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu phương pháp, mở rộng định lượng đồng thời với nhiều vitamin tan trong nước khác: B3, B5, B12, C.
2. Tiếp tục nhiên cứu phương pháp, mở rộng các đối tượng nghiên cứu khác như: sữa lỏng, gạo, rau, củ quả...là các nhóm đối tượng mẫu giàu vitamin nhóm B nhưng có nền mẫu phức tạp khi thực hiện quá trình xử lý mẫu.
3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong các sản phẩm dinh dưỡng trên thị trường (sữa bột, bột dinh dưỡng).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Dƣơng Thị Tú Anh, Mai Xuân Trƣờng (2006), "Định lƣợng đồng thời các vitamin B1, B2 và B6 trong viên nén Narotex theo phƣơng pháp lọc Kalman", Tạp chí khoa học và công nghệ Đại học tự nhiên, số 2 (38), tập 2, pp. 66-69.
2. Bộ Y tế (2013), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 84-105.
3. Bộ Y tế (2012), Quy chuẩn quốc gia đối với sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ đến 12 tháng tuổi, QCVN 11-1/2012.
4. Bộ Y tế (2012), Quy chuẩn quốc gia đối với sản phẩm dinh dưỡng công thức với mục đích ăn bổ sung cho trẻ từ 6 đến 36 tháng tuổi, QCVN 11-3/2012. 5. Bộ Y tế (2012), Quy chuẩn quốc gia đối với sản phẩm dinh dưỡng công thức
với mục đích y tế đặc biệt cho trẻ đến 12 tháng tuổi, QCVN 11-2/2012. 6. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp.
239, 247, 279.
7. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích, Phụ lục 7 – Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc.
8. Bộ Y tế (2007), Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 333- 338.
9. Bộ Y tế (2007), Hóa dược tập 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 226-242. 10. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 123-
143, 168-200.
11. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mạc, Từ Vọng Nghi (2007), Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, pp. 341-361.
12. Phạm Thị Thanh Hà, Phan Mai Phƣơng, Nguyễn Thị Thanh Nhài (2010), "Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng các vitamin tan trong nƣớc trong thuốc và thực phẩm bổ sung bằng điện di mao quản", Tạp chí Dược học, Số 410, pp. 53-56.
13. Trần Tứ Hiếu và cộng sự (2007), Hóa học phân tích phần 2: Các phương pháp phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, pp. 267-295, 372-376.
14. Trần Tứ Hiếu, Mai Xuân Trƣờng, Đặng Ứng Vận (2007), "Phƣơng pháp trắc quang định lƣợng đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B12 và Vitamin PP trong hỗn hợp theo phƣơng pháp lọc Kalman", Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Số 2, pp. 20-25.
15. Vũ Đặng Hoàng (1999), Kết quả bước đầu định lượng 5 vitamin (B1, B2, B6, Pp, C ) và 2 vi kim loại ( Zn,Fe ) trong 4 chế phẩm Polyvitamin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông, Luận văn thạc sĩ dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
16. Trần Cao Sơn-Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, pp. 10-59.
17. Tiêu chuẩn Việt Nam (2012), TCVN 9513:2012 Thực phẩm - Xác đinh vitamin B6 (bao gồm các dạng glycosyl) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
18. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011), TCVN 8975 : 2011 Thực phẩm - Xác đinh vitamin B2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
19. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011), TCVN 8976:2011 Thực phẩm - Xác đinh vitamin B6 bằng phép thử vi sinh.
20. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011), TCVN 8978:2011 Thực phẩm - Xác định folat bằng phép thử vi sinh.
21. Tiêu chuẩn Việt Nam (2008), TCVN 5162 : 2008 Thực phẩm - Xác đinh vitamin B1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
TIẾNG ANH
22. Soledad Albalá-Hurtado, M. Teresa Veciana-Nogués, María Izquierdo- Pulido, Abel Mariné-Font (1997), "Determination of water-soluble
vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography",
Journal of Chromatography A 778, pp. 247-253.
23. AOAC 942.23 ( 2005), Thiamine (Vitamin B1) in Human and Pet Foods, Fluorometric Method.
24. AOAC 970.65 (2005), Riboflain (Vitamin B2) in Foods and Vitamin Preparations, Fluorometric Method.
25. AOAC 985.32 (2005), Vitamin B6 (Pyridoxine, Pyridoxal, Pyridoxamine) in Ready-To-Feed Milk-Based Infant Formula, Microbiological Method.
26. AOAC 985.34 (2005), Niacin and Niacinamide (Nicotinic Acid and Nicotinamide) in Ready-To-Feed Milk-Based Infant Formula, Microbiological-Turbidimetric Method.
27. AOAC 992.05 (2005), Folic Acid (Pteroylglutamic Acid) in Infant Formalu, Microbiological Methods.
28. AOAC 2012.16 (2012), Pantothenic Acid (Vitamin B5) in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula, Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method.
29. AOAC 986.27 (2005), Thiamine (Vitamin B1) in Milk-Based Infant Formula, Fluorometric Method.
30. AOAC Official Method 2004.07 (2005), Vitamin B6 in reconstitute infant formula, Liquid chromatographic method. First action 2004.
31. AOAC official methods of analysic (2012), Guidelines for standard method performance requirements.
32. Asean (2009), Guidelines for valdatin of analytical procedures.
33. Baiyi Lu, Yiping Ren, Baifen Huang, Wenqun Liao, Zengxuan Cai, and Xiaowei Tie (2008), "Simultaneous Determination of Four Water-Soluble Vitamins in Fortified Infant Foods by Ultra-Performance Liquid Chromatography Coupled with Triple Quadrupole Mass Spectrometry",
34. Byung Kyu Lee, Joon Hyuk Suh, Dong-Hyug Yang, Han Young Eom, Unyong Kim, Junghyun Kim, Hyeyeon Lee, and Sang Beom Han (2011), "Simultaneous Determination of B Group Vitamins inSupplemented Food Products by High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection", Bull. Korean Chemical Society, 32(8), pp. 2648-2656.
35. Gerald F. Combs, Jr. (2008), The vitamins: Fundamental Aspects in Nutrition and Health Third Edition, pp. 52-57.
36. ICH (1996), Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology.
37. Paul Lawrance, LGC, Analytical procedures for the determintion of vitamins B1 and B2 in foods, feeds and supplements. 2007, A report published as part of the Government Chemist Programme Project CB1.4- The determination of B- Vitamins.
38. Pedro L. López-de-Alba, Leticia Lopez-Martinez, Victor Cerdáb and Judith Amador -Hemandez (2006), J.Braz.Chem.Soc., Vol. 17, No. 4, pp. 715-722. 39. Carmela Mennella, Vincenzo Fogliano, Fortuna Riccio (2006), "Effect of
cooking on the concentration of Vitamins B in fortified meat products",
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41(5), pp. 1592–1595.
40. Mahmure Ustun OZGUR, KOYUNCU Ikbal (2002), "Determination of Ternary Mixtures of Vitamins (B1, B6, B12) by Zero-Crossing Derivative Spectrophotometry", Turk J Chem, 26, pp. 385- 391.
PHỤ LỤC 1
MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ KHI XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU