Nhận xét :Tất cả các chất đều thỏa mãn được yêu cầu của quy tắc Lipinsky về độ giống thuốc. Cùng với kết quả hoạt tính sinh học in vitro tốt, các chất có nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu tác dụng in vivo.
Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 4a-d theo quy tắc Lipinsky Chất R LogP KLPT Số NH,OH Số N,O 4a H 2,75 351 2 7 4b 5-F 2,95 369 2 7 4c 5-Cl 3,39 385,5 2 7 4d 7-Cl 3,39 385,5 2 7 3.3. BÀN LUẬN 3.3.1.Tổng hợp hóa học
Các acid hydroxamic 4a-d được tổng hợp qua ba bước.
Bước 1 là phản ứng tổng hợp nhóm methoxim của các dẫn chất isatin. Phản ứng được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ cao trong thời gian ngắn (3h), hiệu suất tương đối cao khoảng 90%. Sản phẩm thu được là các chất rắn màu vàng. Methoximisatin có giá trị Rf gần bằng Rf của isatin, vì vậy việc xác định điểm kết thúc phản ứng tương đối khó. Nên khi kiểm tra TLC phải chọn hệ dung môi DCM : MeOH với tỉ lệ thích hợp để phân định được methoximisatin và isatin.
Bước 2 là phản ứng alkyl hóa giữa các methoximisatin với methyl 3-(4- (bromomethyl)phenyl)acrylat trong dung môi dimethylformamid và base sử dụng là K2CO3. Sản phẩm thu được là chất rắn có màu vàng hanh và được sử dụng ngay cho phản ứng tiếp theo.
Bước 3 là phản ứng tạo acid hydroxamic giữa ester trung gian 3a-d và hydroxylamin hydroclorid. NaOH cần được sử dụng để giải phóng hydroxylamin từ dạng muối hydroclorid, lượng NaOH cần dùng dư để đảm bảo chuyển hết hydroxylamin hydroclorid thành hydroxylamin, đồng thời đảm bào acid hydroxamic tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng. Do điều kiện kiềm nên phản ứng phải
được tiến hành ở -5oC để tránh sự thủy phân của nhóm chức ester thành acid cacboxylic, điều kiện này được duy trì suốt thời gian diễn ra phản ứng.
Nên làm lạnh bình phản ứng chứa hỗn hợp NaOH và hydroxylamin hydroclorid trước khi nhỏ ester vào. Phải nhỏ ester vào bình phản ứng một cách rất từ từ, từng giọt một tránh hiện tượng ester bị kết tủa do thay đổi dung môi.
Các chất 4a-d và các chất trung gian được tổng hợp nhìn chung là các chất có cấu tạo phức tạp, có các nhóm chức nhạy cảm với các yếu tố của môi trường phản ứng. Vì vậy khi thực hiện phản ứng cần đảm bảo nghiêm ngặt về điều kiện phản ứng như trên.
3.3.2.Tác dụng sinh học
3.3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC
Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC trong bảng 3.10 cho thấy cả 4 chất tổng hợp được đều có khả năng ức chế HDAC. Cụ thể:
Bảng 3.10: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC Chất R Tác dụng ức chế HDAC2 (IC50,M) 4a H 0,472 4b 5-F 0,267 4c 5-Cl 0,199 4d 7-Cl 1,399 SAHA 1,840
Ghi chú: IC50:Nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hóa của HDAC.
Khung 3-methoxyimino-2-oxo-1-indolin thể hiện khả năng ức chế rất tốt HDAC2. So với SAHA IC50= 1,840, các dẫn chất này đều cho giá trị IC50 vượt trội
(0,267 – 1,399). Kết quả này gợi ý rằng khung 3-methoxyimino-2-oxo-1-indolinlàm cho 4 dẫn chất này tương tác mạnh hơn với trung tâm hoạt động của HDAC2, nên các dẫn chất này có tác dụng ức chế HDAC2 rất tốt.
Việc gắn nhóm thế R hút e hoặc không gắn nhóm thế trên khung 3- methoxyimino-2-oxo-1-indolin làm cho 4 dẫn chất có tác dụng mạnh khi ức chế HDAC2:
+ Dẫn chất 4c với nhóm thế -Cl gắn vào vị trí 5 trên khung 3-methoxyimino- 2-oxo-1-indolin thể hiện tác dụng ức chế HDAC2 mạnh nhất với giá trị IC50= 0,199, mạnh gấp 9,25 lấn so với SAHA.
+ Dẫn chất 4b có giá trị IC50= 0,267 khi nhóm thế -F được gắn vào vị trí 5 trên khung 3-methoxyimino-2-oxo-1-indolin. Với việc thay đổi nhóm thế -Cl bằng –F tại vị trí 5 thì dẫn chất 4b thể hiện tác dụng yếu hơn so với dẫn chất 4c, nhung vẫn rất mạnh, mạnh hơn SAHA 6,89 lần.
+ Dẫn chất 4a mặc dù không gắn nhóm thế nhưng vẫn thể hiện tác dụng mạnh khi ức chế HDAC2 với giá trị IC50 = 0,427 và mạnh gấp 3,90 lần SAHA.
+ Dẫn chất 4d thể hiện tác dụng yếu hơn so với 3 dẫn chất còn lại ( IC50= 1,399) nhưng vẫn mạnh hơn 1,32 lần so với SAHA.
Hình 3.1: Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế HDAC2 của các dẫn chất 4a-d
0 0,5 1 1,5 2 Tác dụng ức chế HDAC (IC50) 4a 4b 4c 4d SAHA M Chú thích
Tác dụng ức chế HDAC có vai trò quan trọng trong việc kháng tế bào ung thư, tuy nhiên để gây ra độc tính với tế bào các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào tiếp cận với HDAC. Do đó, các chất được tiến hành thử độc tính tế bào in vitro nhằm tìm ra những chất có tác dụng sinh học tốt.
3.3.2.2. Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Thử nghiệm được tiến hành trên 3 dòng tế bào: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư tuyến tụy (AsPC-1). Kết quả được trình bày ở trong bảng 3.11.
Qua kết quả bảng 3.11 có thế thấy rằng, các chất tổng hợp được đều có khả năng kháng tế bào ung thư mạnh hơn SAHA. Trong đó:
+ Dẫn chất 4b thể hiện tác dụng mạnh nhất trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với IC50 từ 0,56 – 0,93. Đặc biệt, trên dòng tế bào ung thư AsPC-1, khả năng gây độc của dẫn chất này (IC50= 0,56) gấp 5,70 lần SAHA (IC50= 3,19). Đồng thời, trên dòng tế bào SW620, tác dụng của chất 4b (IC50= 0,71) mạnh gấp 4,60 lần SAHA, còn trên dòng tế bào PC-3 thì mạnh gấp 1,88 lần SAHA.
Bảng 3.11: Kết quả thử độc tính tế bào Chất R Tác dụng gây độc tế bào (IC50,M) SW6201 PC-32 AsPC-13 4a H 1,96 1,14 1,23 4b 5-F 0,71 0,93 0,56 4c 5-Cl 1,10 0,88 0,82 4d 7-Cl 3,15 4,54 3,58 SAHA 3,26 1,75 3,19
Ghi chú: IC50: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư; 1Dòng tế bào ung thư đại tràng; 2Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt; 3Dòng tế bào ung thư tuyến tụy.
+ Dẫn chất 4c có giá trị IC50 từ 0,82 – 1,10 trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm cũng cho tác dụng mạnh hơn SAHA từ 1,98 – 3,89 lần.
+ Dẫn chất 4a có giá trị IC50 từ 1,14 – 1,96 cho thấy dẫn chất 4a cũng có tác dụng tốt hơn SAHA.
+ Dẫn chất 4d là chất có tác dụng yếu nhất so với 3 dẫn chất còn lại. Trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, chất 4d chỉ cho tác dụng tương đương với SAHA trên dòng tế bào SW620 và AsPC-1, còn trên dòng PC-3 thì cho tác dụng yếu hơn SAHA.
Ngoài ra, từ kết quả bảng 3.11 còn thấy, các dẫn chất tổng hợp được đều cho tác dụng tốt trên 2 dòng tế bào SW620 và AsPC-1 hơn trên dòng PC-3 khi so sánh với SAHA. Có thể gợi ý cho ta rằng dòng tế bào SW620 và AsPC-1 nhạy cảm hơn dòng tế bào PC-3 khi thử với các dẫn chất tổng hợp được hơn.
Hình 3.2: Biều đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất4a-d
Từ kết quả tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của 4 dẫn chất 4a-d có thể đưa ra một số lý giải như sau:
0 1 2 3 4 5 SW620 PC-3 AsPC-1
Tác dụng kháng tế bào ung thư (IC50)
4a 4b 4c 4d SAHA
μM
+ Hai chất 4c và 4d có vị trí nhóm thế clo trên khung 3-methoxyimino-2-oxo- 1-indolin khác nhau nhưng cho tác dụng kháng tế bào ung thư và tác dụng ức chế HDAC khác xa nhau. Chất 4c có tác dụng vượt trội hơn hẳn so với chất 4d về cả tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư, điều này có thể được giải thích rằng ví trí 7-Cl là không phù hợp trên khung 3-methoxyimino-2-oxo-1-indolin nên làm giảm lực tương tác van der waals của chất 4d với trung tâm hoạt động của HDAC nên làm giảm hoạt tính sinh học của chất 4d.
+ Đồng thời, khi so sánh 2 chất 4b và 4c có thể thấy rằng, chất 4c có tác dụng ức chế HDAC mạnh hơn so với chất 4c, nhưng trái lại chất 4b lại có khả năng kháng tế bào ung thư mạnh hơn. Sự khác biêt này có thể lý giải như sau: Do chất 4b chứa nhóm thế 5-F hút điện tử mạnh làm giảm mật độ điện tử trên khung 3-methoxim- isatin nên giảm tương tác Van der Waals của chúng với các acid amin thơm dẫn đến giảm hoạt tính ức chế HDAC so với chất 4c. Nhưng chất 4c lại có cấu trúc không gian cồng kềnh hơn nên việc đi qua màng tế bào là khó khăn hơn, vì vậy mặc dù có tác dụng ức chế HDAC mạnh hơn nhưng hoạt tính sinh học thì lại kém hơn. Qua đây có thể thấy khả năng thấm qua màng tế bào để tiếp cận với HDAC là rất quan trọng, ảnh hưởng lớn tới hoạt tính sinh học của thuốc.
+ Ngoài ra, cũng có thể 4c có tác dụng ức chế HDAC2 mạnh hơn 4b nhưng trên các tuýp HDAC khác thì chưa chắc 4c đã có tác dụng ức chế mạnh hơn. Mà tác dụng kháng tế bào ung thư lại phụ thuộc và rất nhiều vào các tuýp HDAC. Do đó, có thể 4b có tác dụng mạnh hơn 4c khi ức chế các tuýp HDAC khác nên tác dụng kháng tế bao ung thư mạnh hơn. Vì vậy, để có đánh giá chính xác cần phải thử trên các dòng HDAC khác nhau hơn là chỉ thử trên HDAC2.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:
1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc
* Đã tổng được 4 chất như dự kiến, cả 4 chất 4a-d chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào, gồm:
1. N-hydroxy-3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)prop- 2-enamid (4a). 2. 3-(4-((5-Fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyprop-2-enamid (4b). 3. 3-(4-((5-Cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyprop-2-enamid (4c). 4. 3-(4-((7-Cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyprop-2-enamid (4d).
* Đã khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp được là đúng như dự kiến nhờ phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR.
1.2. Về hoạt tính sinh học
Đã thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được, kết quả cho thấy:
- Về tác dụng ức chế HDAC: cả 4 chất tổng hợp được đều có khả năng ức chế HDAC.
- Về tác dụng kháng tế bào ung thư: cả 4 chất đều có hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Trong đó, chất 4b có tác dụng mạnh nhất, mạnh gấp 1,88-5,70 lần SAHA khi thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư.
II. KIẾN NGHỊ
- Tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các chất tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác, tìm ra chất có tác dụng mạnh làm cơ sở cho việc thử tác dụng in vivo.
- Nghiên cứu tổng hợp dãy chất thay thế khung 3-methoxim-isatin bằng các nhóm điện tử hoặc các vòng thơm khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Hải Nam, (2010), Liên quan cấu trúc và tác dụng sinh học, NXB Y học, Tài liệu sau đại học.
2. Đào Thị Kim Oanh, (2013), Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase, Luận văn tiến sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội.
3. Nguyễn Đình Triệu, (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật, p.29-100;195-228.
Tiếng Anh
4. Andrianov V. et al., (2009), "Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase: Design, synthesis and SAR", European Journal of Medicinal Chemistry, 44(3), p. 1067-1085.
5. Bereshchenko O.R. et al., (2002), "Acetylation inactivates the transcriptional repressor Bcl6", Nature Genetics, 4, p. 606-613.
6. Bertrand P, (2010), Inside HDAC with HDAC inhibitors, Eur. J. Med. Chem, Volume 45, p.2095–2116.
7. Cross A.D., (1960), An Introduction to Pratical Infrared Spectroscopy, Butter Worths Scientific Pub, London.
8. Chemistry: Association of official Analytical Chemists., Infrared and Ultraviolet spectra of some compounds of Pharmaceutical Interest, Association of official Analytical Chemists, Washington.
9. Chen C.S. et al., (2007), "Histone deacetylase inhibitors sensitize prostate cancer cells to agents that produce DNA double strand breaks by targeting Ku70 acetylation", Cancer Research, 67, p. 5318-5327.
10. Chengqing Ning et al., (2013), "Design, synthesis and biological evaluation of di-substituted cinnamic hydroxamic acids bearing urea/thiourea unit as potent histone deacetylase inhibitors", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 23, p. 6432–6435.
11. Choi Y. et al., (2008), "Histone deacetylase inhibitors KBH-A42 inhibits cytokine production in RAW 264.7 macrophage cells and in vivo endotoxemia model", Experimental and Molecular Medicine, 40, p. 574-581.
12. Deubzer H.E. et al., (2009), "HDAC family: What are the cancer relevant targets?", Cancer Lett, 8;277(1), p. 8-21.
13. Di Marcotullio L. et al., (2011), Protected from the inside : Endogenous histone deacetylase inhibitors and the road to cancer, Biochimica et Biophysia Acta, 1815, p.241-252.
14. Fazi F. et al., (2005), "Retinoic acid targets DNA – methyltransferase and histone deacetylases during APL blast differentiation in vitro and in vivo",
Oncogene, 24, p. 1820-1830.
15. FDA, (2014), FDA approves Beleodaq to treat rare, aggressive form of non- Hodgkin lymphoma.
16. Frey R.R. et al., (2002), "Trifluoromethyl Ketones as Inhibitors of Histone Deacetylase", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12, p. 3443–3447. 17. Gregogetty I.V., (2004), "Molecular evolution of the histone deacetylase
family : functional implications of phylogenetic analysis", J.Mol.Biol., 338, p. 17-31.
18. Halkidou K. et al., (2004), "Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer", Prostate, 59, p. 177-189.
19. Hanessian S. et al., (2007), "ω-Alkoxy analogues of SAHA (vorinostat) as inhibitors of HDAC: A study of chain-length and stereochemicaldependence",
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17(22), p. 6261-6265.
20. Herbert B., (1967), Mass spectrometry of organic compounds, Holden day Inc. 21. Hubbs L. J. et al., (2008), "Amino acid derivatives as histone deacetylase
inhibitors", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 18(1), p. 34-38. 22. Johnstone W.R., (2002), "Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the
23. Jonhstone R.W., (2002), Histone deacetylase inhibitors: Novel drugs for the treatment of cancer, Nature, 1, p.287-299
24. Kim D. et al., (2003), "Synthesis and biological evaluation of 3-(4-substituted- phenyl)-N-hydroxy-2-propenamides, a new chass of histone deacetylse inhibitors", J.Med.Chem., 46, p. 4745-5751.
25. Kim H.J. et al., (2011), Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs, Am J Transl Res, 3(2), p. 166– 179.
26. Lipinski C.A. et al., (1997), "Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings", Advanced Drug Delivery Reviews, 46, p. 3–26.
27. Marks P.A. et al., (2001), Histone deacetylses and cancer: Causes and therapies, 1, p.194-200.
28. Marson C.M. et al., (2007), "Structure-activity relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxyamides as potent inhibitors of histone deacetylase", Bioorg Med Chem Letters, 17(1), p. 136-141.
29. Marzio G. et al., (2000), "E2F family members are differentially regulated by reverisible acetylation", J.Biol.Chem, 275, p. 10887-10892.
30. Monneret Claude, (2005), "Histone deacetylase inhibitors", Eur.J.Med.Chem, 40, p. 1-13.
31. Nam N.H. et al., (2011), "Benzothiazole-containing hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21(24), p. 7509–7512.
32. Ruijter de A.J. et al., (2003), "HDACs: Characterization of classical HDAC family", J.Biol.Chem., 370, p. 737-49.
33. Song J. et al., (2005), " Increased expression of histone deacetylase 2 is found in human gastric cancer", APMIS, 113, p. 264-268.
34. Suresh S. Ramalingam. et al., (2009), "Phase II study of Belinostat (PXD101), a histone deacetylase inhibitor, for second line therapy of advanced malignant pleural mesothelioma", J Thorac Oncol, 4(1), p. 97-101.
35. et al. Wu L., (1992), "Multidrug-resistant phenotype of disease-oriented panels of human tumor cell lines used for anticancer drug screening", Cancer