- Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600 cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học Việt Nam, chế độ đo LC-MS, dung môi methanol.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS).
2.3.2.Thử tác dụng sinh học
2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá bằng 2 phương pháp:
- Đánh giá theo phương pháp Western blot:
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây[35].
- Định lượng nồng độ enzyme HDAC2 bị ức chế:
Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Phân tích dựa trên phương pháp huỳnh quang trên đĩa 96 lỗ, sử dụng bộ kit định lượng enzym HDAC2 (Flour de Lys®-Green - ENZO LIFE SCIENCES). Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT thử nghiệm.
Tóm tắt các bước như sau: Enzym HDAC2 được ủ với cơ chất tripeptid có gắn flourescence ở nồng độ 30 ng/µL và hòa tan trong 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), 138 mM NaCl, 10% glycerol, pH 8,0. Phản ứng deacetyl hóa được tiến hành trong dung dịch đệm chứa 50 mM TRIS/Cl, pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1mM MgCl2. Enzym HDAC2 và cơ chất hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) được trộn lẫn trong giếng và ủ ấm. Phần huỳnh quang sẽ được tách ra sau deacetyl hóa. Cường độ huỳnh quang được đo bằng thiết bị đọc đĩa huỳnh quang (flourometric plate reader). Dữ liệu được phân tích và tính toán để xác định nồng độ mẫu thử tối thiểu có thể ức chế được 50% hoạt động của enzym HDAC2, từ đó tính được giá trị IC50. Dữ liệu được phân tích và tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism. Trong phép thử này, sự sai lệch mật độ huỳnh quang giữa các lần đo không quá 10%.
2.3.2.2. Thử độc tính tế bào
* Nguyên tắc thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tính trên phương pháp probit.
Dòng tế bào thử nghiệm: SW 620 (ung thư đại tràng), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), AsPc-1 (ung thư tuyến tụy).
Thiết bị, huyết thanh và các thuốc thử được sử dụng cho việc nuôi cấy tế bào được cung cấp từ công ty GIBCO (Grand Island, New York, USA).
Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:
Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 9.103 µL. Các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 µL môi trường RPMI bổ sung
10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µL mẫu thử vào các giếng có nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu thử được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%. Đem cố định với TCA (tricloroacetic acid).
Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µL thuốc nhuộm SRB (sulforhodamineB) với nồng độ SRB là 5 mg/mL trong dung dịch đệm Tri(hydroxymethyl)aminomethane. Các đĩa được ủ thêm 30 phút ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 µL dung dịch DMSO, để 5 phút để hòa tan. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm.
* Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp probits. Trong phương pháp thử này,
IC50 ≤ 20 µg/mL được coi là có hoạt tính.
2.3.3.Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp được bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environment Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinski [26]:
- Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500g/mol.
- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10.
- Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1. HÓA HỌC
3.1.1.Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ chung như sau (sơ đồ 3.1):
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung
Tác nhân và điều kiện: i) O-methylhydroxylamine hydroclorid, triethylamin, ethanol, đun hồi lưu 70oC, 12h; ii) methyl 3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylate, K2CO3, DMF, tiến hành ở 30oC/24h; iii)Methanol, NH2OH.HCl, NaOH, -5oC, 30 phút.
3.1.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (2a-d)
a. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2a):
Quy trình tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2a) được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất 2a
Tiến hành:
-Cân 0,29 g (2 mmol) isatin, hòa tan trong 5ml ethanol khan trong bình cầu. -Thêm lần lượt 0,20 g (2,4 mmol) methylhydroxylamin. HCl và 2,4 ml
triethylamin 1M vào bình cầu trên (bình cầu đặt trong nước lạnh). -Khuấy hỗn hợp phản ứng ở 70oC trong 12h.
Xử lý:
-Chuyển từ từ hỗn hợp phản ứng vào 20ml nước lạnh để tạo tủa.
- Lọc, rửa tủa bằng nước cất, sấy ở 60oC. Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 93,96 %. - Rf = 0,58 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 126,2 – 127,0oC. b. Tổng hợp 5-floro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2b):
Quy trình tổng hợp 5-floro- 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2b) được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất 2b
Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 2a với chất ban đầu là 5- floroisatin 0,39 g (2 mmol). Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 90,33 %. - Rf = 0,53 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 127,5 – 127,8oC. c. Tổng hợp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2c):
Quy trình tổng hợp 5-cloro- 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2c) được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất 2c
Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 2a với chất ban đầu là 5- cloroisatin 0,43 g (2 mmol). Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 90,70 %. - Rf = 0,55 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 145,1 – 142,6oC. d. Tổng hợp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2d):
Quy trình tổng hợp 7-cloro- 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2d) được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất 2d
Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 2a với chất ban đầu là 7- cloroisatin 0,43 g (2 mmol). Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 88,09 %. - Rf = 0,51 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 145,5- 146,8oC
Bảng 3.1: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các chất 2a-d Chất R CTPT KLPT Màu H (%) 2a H C9H8N2O2 176,0 Vàng 93,96 2b 5-F C9H7N2O2F 194,0 Vàng 90,33 2c 5-Cl C9H7N2O2Cl 210,5 Vàng 90,70 2d 7-Cl C9H7N2O2Cl 210,5 Vàng 88,09 3.1.1.2. Tổng hợp methyl 3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl) prop-2-enoat và các dẫn chất (3a-d) a. Tổng hợp methyl 3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl) prop-2-enoat(3a)
Quy trình tổng hợp methyl 3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1- yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3a) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất 3a
Tiến hành:
- Cân 0,26 g (1,5 mmol) chất 2a hòa tan với 1ml DMF (dimethylformamid) trong bình cầu, thêm 0,27 g K2CO3, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30-45 phút. - Hòa tan 0,38 g (1,5 mmol) methyl 3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylat trong 1ml DMF, sau đó nhỏ từ từ vào bình phản ứng.
- Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 24h. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xử lý:
- Làm lạnh bình phản ứng, thêm 5ml nước cất.
- Trung hòa bằng dung dịch acid HCl 5% đến pH trung tính để tạo tủa. - Lọc và rủa tủa bằng nước cất.
- Sấy tủa ở 60oC, thu được chất 3a. Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 82,05 %. - Rf = 0,65 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 211,2 – 212,3oC. b. Tổng hợp methyl 3-(4-((5-floro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl) prop-2-enoat (3b)
Quy trình tổng hợp methyl 3-(4-((5-floro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1- yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3b) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất 3b
Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 3a với chất ban đầu là 5- floro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin 0,55 g (1,5 mmol). Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 80,15 %. - Rf = 0,55 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 209,9 – 210,5oC. c. Tổng hợp methyl 3-(4-((5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl) prop-2-enoat(3c)
Quy trình tổng hợp methyl 3-(4-((5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1- yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3c) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.8: Quy trình tổng hợp chất 3c
Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 3a với chất ban đầu là 5- cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin 0,58 g (1,5 mmol). Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 75,18%. - Rf = 0,58 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 219,9 – 221,1oC. d. Tổng hợp methyl 3-(4-((7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl) prop-2-enoat (3d)
Quy trình tổng hợp methyl 3-(4-((7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1- yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3d) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.9: Quy trình tổng hợp chất 3d
Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 3a với chất ban đầu là 7- cloro- 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin 0,58g (1,5 mmol).
Kết quả:
- Cảm quan: bột màu vàng đậm. - Hiệu suất: 78,15%.
- Rf = 0,63 (DCM : MeOH = 9:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 218,6 – 219,9oC .
Bảng 3.2: Các chỉ số hóa lý của các chất 3a-d
Chất R CTPT KLPT Màu 3a H C20H18O4N2 350,0 Vàng 3b 5-F C20H17O4N2F 368,0 Vàng 3c 5-Cl C20H17O4N2Cl 384,5 Vàng 3d 7-Cl C20H17O4N2Cl 384,5 Vàng đậm 3.1.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl) phenyl)prop-2-enamide và dẫn chất (4a-d) a. Tổng hợp N-hydroxy-3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl) prop-2-enamid(4a) Quy trình tổng hợp N-hydroxy-3-(4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid (4a) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.10: Quy trình tổng hợp chất 4a
Tiến hành:
- Hòa tan 0,35 g (5 mmol) NH2OH. HCl trong 5ml dung môi MeOH ở một bình cầu.
- Hòa tan 0,4 g (10 mmol) NaOH trong 2 ml nước cất ở trong một ống nghiệm, làm lạnh rồi nhỏ vào bình cầu trên.
- Cân 0,35 g (1 mmol) chất 3a rồi hòa tan trong 3 ml MeOH. Sau đó, nhỏ từng giọt vào bình phản ứng. Khuấy hỗn hợp phản ứng trong 2h, ở nhiệt độ -5oC . - Tiến hành phản ứng cho đến khi hết ester 3a.
- Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách thử với dung dịch FeCl3 5% và chạy TLC, cụ thể làm như sau:
+ Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%. Nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra.
+ Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng. Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH : AcOH (90:10:1). Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản ứng hết lượng ester 3a ban đầu. Xử lý:
- Cất quay loại bớt dung môi.
- Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dd HCl 10% đến pH khoảng 6, tạo tủa, lọc rửa tủa bằng nước cất.
- Sấy khô ở 60oC, thu sản phẩm.
- Kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi MeOH : H2O , thu sản phẩm. Kết quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ gạch. - Hiệu suất: 56%. - Rf = 0,61 (DCM : MeOH : AcOH = 90:10:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 262,7 - 263,5. b. Tổng hợp 3-(4-((5-Fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyprop-2-enamid (4b) Quy trình tổng hợp 3-(4-((5-Fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyprop-2-enamid (4b) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.11: Quy trình tổng hợp chất 4b
Tiến hành:
- Tương tự quy trình tổng hợp của chất 4a với chất ban đầu là 3-(4-((5-floro-3- (methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat 0,37g (1 mmol). Kết quả:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 50,52%. - Rf = 0,52 (DCM : MeOH : AcOH = 90:10:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 261,5 - 263,1. c. Tổng hợp 3-(4-((5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyprop-2-enamid (4c) Quy trình tổng hợp 3-(4-((5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyprop-2-enamid (4c) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.12: Quy trình tổng hợp chất 4c
Tiến hành:
- Tương tự quy trình tổng hợp của chất 4a với chất ban đầu là 3-(4-((5-cloro-3- (methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat 0,39 g (1 mmol). Kết quả:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ đậm. - Hiệu suất: 49,90%.
- Rf = 0,55 (DCM : MeOH : AcOH = 90:10:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 271,2 - 272,0.
d. Tổng hợp 3-(4-((7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyprop-2-enamid(4d)
Quy trình tổng hợp 3-(4-((7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyprop-2-enamid (4d) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.13: Quy trình tổng hợp chất 4d
Tiến hành:
- Tương tự quy trình tổng hợp của chất 4a với chất ban đầu là 3-(4-((7-cloro-3- (methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat 0,39 g (1mmol). Kết quả:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ đậm. - Hiệu suất: 55,12%.
- Rf = 0,58 (DCM : MeOH : AcOH = 90:10:1). - Nhiệt độ nóng chảy: 272,4 - 273,2.
Bảng 3.3: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các chất 4a-d
Chất R KLPT CTPT Màu Hiệu suất (%)
4a H 351,0 C19H17O4N3 Đỏ gạch 56,00
4b 5-F 369,0 C19H16O4N3F Đỏ cam 50,52
4c 5-Cl 385,5 C19H16O4N3Cl Đỏ đậm 49,90
3.1.2.Kiểm tra độ tinh khiết.
* Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70- 230 mesh, với 3 hệ dung môi khác nhau là DCM : MeOH (9:1), DCM : MeOH (5:1), DCM : MeOH : AcOH (90:10:1), quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.