2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu
Chuẩn bị các mẫu chuẩn.
- Các dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn Loratadin và Pseudoephedrin (tính t Pseudoephedrin.HCl chuẩn) hòa tan trong 50 ml methanol để được dung dịch chuẩn gốc LOR, PSE có nồng độ
chính xác khoảng 250 µg/ml. Các dung dịch gốc được pha riêng biệt. T dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc chứa đồng thời LOR và PSE có nồng độ LOR và PSE chính xác khoảng 2,5 ng/ml và 125,5 ng/ml huyết tương (WS2) và 50 ng (LOR) và 2500 ng/ml (PSE) huyết tương (WS1). - Dung dịch chuẩn nội: Cân một lượng chính xác khoảng 25 mg Domperidol maleat chuẩn hòa tan trong 100 ml methanol. Hút 1ml pha loãng trong 20ml nước cất. Hút 1ml pha loãng trong 100ml nước cất để được dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 125 µg/ml.
Chuẩn bị các mẫu chuẩn LOR, PSE và IS trong MeOH cụ thể theo bảng sau:
Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR, PSE và IS trong MeOH
Dung dịch Thành phần( pha loãng
theo tỷ lệ thích hợp)
Nồng độ chính xác khoảng
Chuẩn gốc LOR(dd A) LOR cân+ MeOH 250 µg/ml
Chuẩn gốc PSE(dd B) PSE cân + MeOH 250 µg/ml Chuẩn gốc IS (dd C) DOM cân+ MeOH 250 µg/ml
Chuẩn trung gian (ddA1) dd A+ MeOH 1 µg/ml
Chuẩn trung gian (dd B1) dd B+MeOH 50 µg/ml
Chuẩn IS làm việc dd C + H2O 125 ng/ml
Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa LOR và PSE chuẩn theo bảng sau:
Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR và PSE.
Dung dịch Thành phần Nồng độ chính xác khoảng LOR PSE Chuẩn làm việc WS1 0,5 mL dd A1+0,5 ml dd B1, bốc hơi bằng khí nitơ + huyết tương trắng v a đủ 10 ml
50 ng/ml 2500 ng/ml Chuẩn làm việc WS2 0,5 mL dd WS1+ huyết tương trắng v a đủ 10 ml 2,5 ng/ml 125,5 ng/ml
Bảng 2.3.Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn. Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ LOR (ng/ml) 0,2 0,4 1 2 5 15 30 50 Nồng độ PSE (ng/ml) 10 20 50 100 250 750 1500 2500 Thể tích dd WS1 (µl) 0 0 0 0 400 300 600 1000 Thể tích dd WS2 (µl) 80 160 400 800 0 0 0 0 Thể tích huyết tƣơng trắng (µl) 920 840 600 200 900 700 400 0
Chuẩn bị các mẫu kiểm tra (QC)
Chuẩn bị các mẫu QC tự tạo trong huyết tương tương tự như các mẫu chuẩn trên để có được dd WSQC1 nồng độ LOR chính xác khoảng 50 ng/ml, PES khoảng 2500 ng/ml và dd WSQC2 nồng độ LOR 2,5 ng/ml, PSE 125,5 ng/ml. T đây chuẩn bị các mẫu QC như bảng sau:
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC. Mẫu QC Nồng độ LOR (ng/ml) Nồng độ PSE (ng/ml) Thể tích dd WSQC1(µl) Thể tích dd WSQC2(µl) Thể tích huyết tƣơng trắng (µl) LQC 0,6 ng/mL 30 ng/mL 0 240 760 MQC 25 ng/mL 1250 ng/mL 500 0 500 HQC 40 ng/mL 2000 ng/mL 800 0 200
2.4.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích
Sử dụng hệ thống LC-MS/MS loại Triple Quandrupole với nguồn ion hóa kiểu HESI, tiến hành thực nghiệm theo các nội dung sau:
2.4.2.1. Xây dựng điều kiện khối phổ và chuẩn nội.
Tối ưu hóa điều kiện khối phổ: - Kiểu khối phổ: nguồn ion hóa HESI
- Xác định ion mẹ đặc trưng đối với LOR và PSE.
- Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa và bộ phận thấu kính hội tụ ion để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất;
- Xác định mảnh ion con của LOR và PSE có cường độ tín hiệu cao và ổn định;
- Tối ưu điều kiện phân mảnh ion mẹ thành ion con để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất.
Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của chất phân tích tiến hành khảo sát trên Diazepam và Domperidol để lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp. Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia vào quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn, đồng thời tạo được mảnh phổ phù hợp khi phân tích cùng LOR và PSE và có hiệu suất chiết gần tương đương với chất phân tích.
Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ phân tích chuẩn nội để thu được cường độ tín hiệu cao và ổn định.
2.4.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký.
Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của LOR, PSE, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký
- Trên cột Acquity UPLC ® BEH C18 (50mm x 2,1 mm; 1,7 µm); cột Themo hypersil GOLD C18 (50mm x 2,1 mm; 1,9 µm) và cột Shimpark C18 (50mm x 3,0 mm; 2,1 µm).
- Trên các pha động gồm MeCN phối hợp dd amoni acetat hoặc dd acid acetic, MeCN phối hợp dd acid formic theo các tỷ lệ với nồng độ dd acid formic khác nhau.
- Khảo sát với các giá trị tốc độ dòng thay đổi t 100 - 500 µL/phút.
T kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng đồng thời LOR và PSE trong huyết tương trên hệ thống UPLC- MS/MS.
2.4.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.
Dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương, tính chất lý hóa của chất chuẩn và chuẩn nội cùng với điều kiện thực tế, tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu:
Tủa protein với tác nhân gây tủa có thể là acid (acid percloric, acid tricloacetic, acid trifluoroacetic) hoặc các dung môi hữu cơ MeOH và MeCN.
Chiết lỏng – lỏng sử dụng các dung môi Dicloromethan, Diethyl ether, Cloroform và hỗn hợp dung môi Diethyl ether – Cloroform, mẫu được kiềm hóa và không kiềm hóa bằng dd Amoniac 0,1 M.
T kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, tiến hành nhanh, kinh tế và vẫn đảm bảo chiết tách được LOR, PSE và IS với tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu và ổn định.
2.4.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.
2.4.3.1. Độ chọn lọc – đặc hiệu.
Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa LOR và PSE ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu của LOR, PSE và IS.
2.4.3.2. Xác định giới hạn định lượng dưới
Tiến hành phân tích 06 mẫu trắng, 06 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ LOR: 0,2ng/ml, PSE: 10ng/ml). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn, tính nồng độ LOR và PSE có trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày.
Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính t đường chuẩn) với nồng độ thực.
2.4.3.3. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính.
Tiến hành chuẩn bị và phân tích 8 mẫu chuẩn của LOR và PSE trong huyết tương có nồng độ bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính dự kiến (các mẫu S1- S8). Ghi lại sắc đồ và tỷ lệ đáp ứng pic LOR/IS, PSE/IS tại các nồng độ tương ứng, xác định tương quan giữa tỷ lệ đáp ứng pic và nồng độ LOR, PSE có trong mẫu; xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. T phương trình hồi quy đã xây dựng tính lại nồng độ của t ng mẫu, xác định độ đúng của mỗi nồng độ.
2.4.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày.
Độ đúng, độ chính xác trong ngày.
Tiến hành phân tích trong cùng một ngày trên 03 lô mẫu LQC, MQC, HQC. Mỗi lô mẫu gồm 06 mẫu độc lập, tính toán nồng độ tìm lại của các mẫu QC theo đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện. Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ giữa nồng độ định lượng được so với nồng độ thực trong mẫu. Độ chính xác được biểu thị bằng giá trị RSD giữa nồng độ định lượng được của các lần phân tích trên cùng lô mẫu.
Độ đúng, độ chính xác khác ngày
Tiến hành tương tự độ đúng độ chính xác trong ngày, tính RSD của các kết quả định lượng được của mỗi nồng độ trong ít nhất 02 ngày khác nhau .
2.4.3.5.Tỷ lệ thu hồi của chuẩn và chuẩn nội
Tiến hành phân tích các lô mẫu LQC, MQC, HQC. Mỗi lô mẫu gồm ít nhất 05 mẫu độc lập cùng nồng độ. Song song tiến hành định lượng các mẫu chuẩn pha trong pha động, không qua xử lý chiết tách, có nồng độ tương ứng với các mẫu QC đã qua xử lý chiết tách.
Xác định tỷ lệ thu hồi của LOR, PSE và IS bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu QC đã qua chiết tách với các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua chiết tách.
2.4.3.6. Nghiên cứu độ ổn định. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng. Tiến hành phân tích các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô mẫu gồm 06 mẫu độc lập. So sánh nồng độ tìm lại của mẫu được xử lý và phân tích ngay sau khi rã đông với mẫu tương ứng được xử lý và phân tích sau khoảng thời gian nhất định (6h) ở nhiệt độ phòng.
- Độ ổn định của mẫu sau xử lý (độ ổn định trong autosampler – nhiệt độ 200C).
Chuẩn bị các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô mẫu gồm 06 mẫu độc lập, tiến hành chiết tách và bảo quản các mẫu sau khi chuẩn bị trong auto sampler trong khoảng thời gian nhất định. Tiến hành phân tích và so sánh nồng độ LOR, PSE trong các mẫu được phân tích ngay sau khi chiết tách với nồng độ của cùng các mẫu đó sau khi bảo quản trong auto sampler.
- Độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã đông: bảo quản các mẫu sau khi chuẩn bị ở điều kiện -400C trong 24 giờ, để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi mẫu đã tan chảy hoàn toàn, đưa mẫu trở lại tủ đông lạnh trong 12-24 giờ. Sau ba chu kỳ đông rã như vậy, tiến hành phân tích và xác định nồng độ LOR, PSE trong các mẫu được phân tích ngay sau khi chuẩn bị.
- Độ ổn định dài ngày: Sau khi chuẩn bị, tiến hành bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 400
C. Sau t ng khoảng thời gian nhất định, tiến hành phân tích và xác định nồng độ LOR, PSE của các mẫu dựa trên đường chuẩn được phân tích cùng ngày. So sánh nồng độ hai hoạt chất trên trong các mẫu sau khi bảo quản ở các thời điểm với nồng độ LOR, PSE trong các mẫu được phân tích ngay sau khi chuẩn bị.
2.4.4. Ứng dụng định lƣợng Loratadin và Pseudoephedrin trên mẫu thực.
Phương pháp định lượng được áp dụng với các mẫu huyết tương thu được t chó uống chế phẩm viên Clarinase Repetabs chứa 5mg LOR và 120mg PSE sulfat phóng thích có kiểm soát.
Tiến hành nghiên cứu trên 2 chó. Lựa chọn chó thí nghiệm, nuôi ổn định trong vòng 4 ngày.
Chương trình dự kiến lấy mẫu như sau:
0,5h; 1,0h; 1,5h; 2,0h; 2,5h; 3,0h; 4,0h; 5,0h; 7,0h; 9,0h; 11h; 24h; 30h; 35h; 48h.
Mỗi điểm lấy 3ml máu ở tĩnh mạch cổ vào ống chống đông chứa heparin, lắc nhẹ, ly tâm 3000 vòng/phút x 10 phút, lấy huyết tương và bảo quản ở - 40ºC đến khi phân tích. Thêm chuẩn nội và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng, xác định nồng độ LOR và PSE trong các mẫu thử, dựa vào đường chuẩn xây dựng cùng ngày phân tích với hệ số r ≥ 0,99 tính nồng độ hoạt chất trong huyết tương. T đó xây dựng đường cong biến thiên nồng độ hoạt chất theo thời gian và xác định các thông số DĐH.
2.4.5. Xử lý và biểu thị các kết quả nghiên cứu
- Các tính toán: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, khoảng tin cậy được thực hiện bằng chương trình phần mềm Excel 5.0.
- Phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy giữa các đáp ứng phân tích và nồng độ loratadin, pseudoephedrin được tính dựa vào phần mềm Excel 5.0.
- Cmax, Tmax: Xác định trực tiếp t dữ liệu thực nghiệm thu được; - AUC, T1/2: Tính dựa vào chương trình phần mềm WinNonlin 5.2 xử lý kết quả thực nghiệm và xây dựng đường cong dược động học.
- So sánh số liệu thống kê: sử dụng phương pháp so sánh hai mẫu bằng test t (Two sample t Test) bằng phần mềm S-PLUS với mức ý nghĩa α = 0,05.
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 .XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƢƠNG
3.1.1. Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ
Tối ưu hóa điều kiện khối phổ.
Pha dung dịch chuẩn LOR và PSE với nồng độ 1µg/mL trong MeOH. Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa cùng với dòng pha động sắc ký qua bộ trộn hình chữ T (Mixing tee). Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ một lần và quét toàn phổ để tìm ion có cường độ tín hiệu cao nhất, tương ứng chính là ion mẹ của chất phân tích, t đó xác định được mảnh ion mẹ của LOR: 383,17; PSE: 166,04.
Sau khi xác định được ion mẹ, tiến hành điều chỉnh để tối ưu điều kiện nguồn ion hóa mà quan trọng nhất là hai thông số hiệu điện thế mao quản (capillary voltage) và hiệu điện thế cone (cone voltage ) để cường độ ion mẹ lớn và ổn định nhất.
Hình 3.1. Tối ưu hóa điện thế Cone cho mảnh ion mẹ loratadin (m/z 383.17)
Dựa vào hai giản đồ này, chúng tôi lựa chọn thế của bộ phận hội tụ ion để lượng ion mẹ đi vào detector lớn nhất: Hiệu điện thế mao quản: 4,0KV; Hiệu điện thế cone: 46V (với LOR), 20V (với PSE). Để tăng độ đặc hiệu và độ nhạy của thiết bị, khai thác hết hiệu năng của thiết bị, chúng tôi lựa chọn kiểu khối phổ hai lần (MS/MS). Để chọn được mảnh ion con phù hợp cho chất phân tích, chúng tôi đã thay đổi các mức thế phân mảnh khác nhau t 2- 80V xác định mảnh ion con tạo thành khi cung cấp năng lượng để phân mảnh ion mẹ và năng lượng tối ưu để phân mảnh ion mẹ để tạo ra mảnh ion con bền vững với số lượng ion tạo thành lớn nhất, cường độ tín hiệu cao và ổn định nhất. Kết quả với LOR, ở mức thế phân mảnh 28V cho mảnh ion con m/z = 259,17 với cường độ tín hiệu lớn và ổn định nhất, với PSE giá trị này là 18 V tương ứng ion con m/z = 117,06.
Hình 3.3. Tối ưu hóa năng lượng phân mảnh ion mẹ (m/z=383) tạo ion con (m/z=259)(loratadin)
Sau khi đã xác định được các điều kiện ở bộ phận nạp mẫu và ion hóa để có được dòng ion phân mảnh lớn và ổn định, sử dụng tiếp chế độ Automatic Tune để máy tự điều chỉnh các thông số còn lại trong thiết bị.
Lựa chọn chuẩn nội.
Tuy cấu trúc, tính chất và nồng độ trong chế phẩm của hai chất phân tích (LOR và PSE) khác nhau khá nhiều nhưng để quá trình phân tích đơn giản hơn, chúng tôi quyết định sẽ lựa chọn một chất làm chuẩn nội chung cho cả LOR và PSE. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát hai chất chuẩn nội là Diazepam (DP) và Domperidol (DOM).
Khi sử dụng các mức thế phân mảnh khác nhau, cả DP và DOM đều tạo ra các mảnh phổ con bền vững, ổn định. Tuy nhiên ở cùng nồng độ 500 ng/ml, cường độ tín hiệu mảnh ion đặc trưng cho DOM lớn và ổn định hơn so với cường độ tín hiệu của mảnh ion đặc trưng cho DP, với cùng điều kiện sắc ký, pic trên SKĐ của DOM so với DP cân đối và sắc nét hơn. Hơn nữa khi khảo sát hiệu suất chiết, DOM cho hiệu suất chiết cao và tương đương với hiệu suất chiết của LOR và PSE. Sau đây là các điều kiện đã tối ưu hóa và xác định được mảnh ion con tạo thành với cường độ tín hiệu cao và ổn định nhất: mảnh
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});