Hình 1.1.Các bộ phận của máy phân tích khối phổ.
Bộ phận phân tích khối Hệ thống bơm chân không Bộ phận phát hiện Xử lý số liệu Bộ nguồn ion Bộ phận nạp mẫu
1.3.2.1. Bộ phận nạp mẫu (inlet)
Có vai trò nạp mẫu vào máy, ở đây mẫu được nạp gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu ra của bộ phận sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ.
1.3.2.2. Bộ nguồn ion ( Ion source) Vai trò là ion hóa các phân tử, nguyên tử
của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.
Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau, hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI).
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI :
Các phân tử chất phân tích cùng dòng pha động sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được đưa vào một ống mao quản cao thế 2-5 KV và phun vào nguồn ion hóa dưới dạng sương mù. Do tác động của điện thế cao mà bề mặt các hạt sương mù được tạo thành bị nhiễm điện, đồng thời dưới tác động của luồng khí nitơ nóng, xảy ra hiện tượng bay hơi dung môi làm cho các hạt sương mù bé dần cho đến khi bị phân tách và giải phóng các ion mang điện. Phần lớn các tiểu phân dung môi, tiểu phân không mang điện hoặc mang điện trái dấu với ion chất phân tích sẽ bị bơm hút ra ngoài. Ion chất phân tích và một phần các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ đi vào bộ phận vận chuyển ion nhờ chênh lệch áp suất.
1.3.2.3. Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube)
Bộ phận vận chuyển ion có cấu tạo như một ống thép chịu nhiệt, tại đây các ion dung môi còn sót lại sẽ tiếp tục bị bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao.
1.3.2.4. Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense)
Cấu tạo gồm hai thanh kim loại ghép với nhau thành một cặp điện cực. Khi áp điện thế vào, các ion phân tích và các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ được tập trung lại thành dòng ion di chuyển với tốc độ cao vào trong bộ phận phân tích khối.
Có nhiệm vụ tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của điện t trường để đi tới detector.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng bộ phân tích tứ cực chập ba (Triplequadrupoles analyser).
Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau, các tứ cực được cấu tạo bởi bốn thanh kim loại ghép với nhau tạo thành hai cặp điện cực, trong đó Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích.
- Tại Q1: Tách các ion, lựa chọn ion chất phân tích ( ion mẹ - parent ion) để đi vào Q2
- Tại Q2: Với áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm với các phân tử khí trơ có mặt như nitơ, heli, argon đã được cung cấp động năng. Nhờ va chạm này, năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng của chúng, phân mảnh tạo ra các ion con. Các mảnh ion con được tạo thành có số khối khác nhau sẽ tiếp tục đi vào Q3.
- Tại Q3: Hệ thống điều chỉnh để ưu tiên cho loại ion con đặc trưng của chất phân tích đi qua và di chuyển đến detector
Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần – MS/MS (nhận diện chất phân tích thông qua số khối của ion mẹ và mảnh ion con)
1.3.2.6. Bộ phận phát hiện (detector).
Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến t bộ phận phân tích khối thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
1.3.2.7. Hệ thống bơm chân không (high vacuum system).
Hệ thống bơm chân không hoạt động nhằm duy trì môi trường chân không ở nguồn ion hóa và toàn bộ hệ thống phân tích khối. Áp suất bên trong hệ thống duy trì trong khoảng 10-8
– 10-6 Pa.
- Ưu điểm:
Kỹ thuật LC- MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, có thể dùng để phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp. Do đó kỹ thuật này ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch sinh học cho các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học.
- Nhƣợc điểm:
Đòi hỏi hóa chất có độ tinh khiết cao, dụng cụ đảm bảo sạch. Thiết bị có cấu tạo phức tạp, giá thành cao. Người sử dụng máy có trình độ chuyên môn cao.
1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) [21], [28], [30].
UPLC là phương pháp được phát triển t HPLC, nguyên tắc hoạt động và các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký của UPLC hoàn toàn tương tự với HPLC, tuy nhiên UPLC có cải tiến về phần cứng c ng như về phần hóa học để tăng về hiệu năng thiết bị. Máy UPLC thực chất là một máy sắc ký lỏng chạy tại áp suất siêu cao (t 9000 psi đến 15000 psi), sử dụng cột sắc ký đường kính nhỏ (thông thường < 2,1 mm); kích thước tiểu phân pha tĩnh nhỏ (< 2,2 µm), số đĩa lý thuyết lớn, chiều cao đĩa lý thuyết nhỏ. Ngoài ra phần cứng liên quan như phần bơm mẫu, phần thu nhận dữ liệu (detector) và xử lý số liệu c ng được cải tiến để đồng bộ trong toàn hệ thống. UPLC có khả năng đồng thời tăng tốc độ phân tích (lên khoảng 9 lần), tăng độ nhạy (lên khoảng 2 lần) và độ phân giải (lên khoảng 3 lần) so với khi phân tích trên HPLC. Hiện nay trên thế giới đang coi UPLC là đỉnh cao của thiết bị LC và là đầu vào tiêu chuẩn của hệ thống khối phổ.
So với HPLC, UPLC có một số ưu điểm sau: - Tốc độ phân tích nhanh;
- Kết quả phân tích đáng tin cậy hơn do độ nhạy và độ phân giải tốt hơn; - Tiêu tốn ít dung môi hơn;
- Chi phí nhân công ít hơn;
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƢỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ.
Chất chuẩn
Loratadin – ống chuẩn, hàm lượng 99,24 , độ ẩm 0,02 , số kiểm soát QT040080712.
Pseudoephedrin – chuẩn làm việc, hàm lượng 100 , độ ẩm 0,01 .
Chất chuẩn nội:
Diazepam – chuẩn làm việc, hàm lượng 98,09 , độ ẩm 0,01 . Domperidol – chuẩn làm việc, hàm lượng 99,44 , độ ẩm 0,01%.
Dung môi, hóa chất:
Methanol (MeOH), Acetonitril (MeCN ) – Merck (Đức), nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC/MS.
Các dung môi hóa chất khác như: Cloroform, Diethylether, Dicloromethan, Amoni acetat, Acid acetic, Acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích (p.a) – Merck (Đức).
Huyết tương trắng : được lấy t chó khỏe mạnh chưa dùng thuốc.
Thiết bị dụng cụ:
Tất cả các thiết bị dụng cụ đều được chuẩn hóa theo quy định ISO/IEC 17025 -2005
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters Xevo TQD – Waters (Mỹ); - Cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1mg) – Sartorious (Đức); - Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K – Sartorious (Đức);
- Thiết bị bay hơi dung môi Reatic – Thermo III – Thermo scientific (Mỹ);
- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP-236 – Velp (Ý);
- Micropipet Eppendorf loại 10- 100, 100- 1000 L – Eppendorf (Đức); Bình định mức, pipet thủy tinh class A , Prolabo – Pháp.
- Buret tự động 725 Dosimat (d=0,001ml), Metrohm- Thụy Sỹ; - Tủ lạnh sâu -40± 50C, Sanyo MDF – 236 – Nhật
2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.
Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương trắng của chó không có LOR và PSE.
Mẫu tự tạo: Cho một lượng LOR và PSE chuẩn vào huyết tương trắng, lắc xoáy 30 giây để được các mẫu có nồng độ thích hợp.
Viên thử: Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough), số lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014, hàm lượng ghi nhãn Pseudoephedrin sulfat 120 mg và Loratadin 5 mg
Mẫu thử: là các mẫu huyết tương chó sau khi cho uống thuốc.
Súc vật: Chó khỏe mạnh, giống đực, cân nặng 9-10 kg
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR và PSE bằng kỹ thuật LC-MS/MS: Lựa chọn phương pháp chiết tách LOR và PSE t huyết tương chó, lựa chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội và điều kiện khối phổ. - Thẩm định phương pháp phân tích: Thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu - chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng – độ chính xác, độ ổn định.
- Ứng dụng định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương chó sau khi uống viên Clarinase .
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu 2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu
Chuẩn bị các mẫu chuẩn.
- Các dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn Loratadin và Pseudoephedrin (tính t Pseudoephedrin.HCl chuẩn) hòa tan trong 50 ml methanol để được dung dịch chuẩn gốc LOR, PSE có nồng độ
chính xác khoảng 250 µg/ml. Các dung dịch gốc được pha riêng biệt. T dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc chứa đồng thời LOR và PSE có nồng độ LOR và PSE chính xác khoảng 2,5 ng/ml và 125,5 ng/ml huyết tương (WS2) và 50 ng (LOR) và 2500 ng/ml (PSE) huyết tương (WS1). - Dung dịch chuẩn nội: Cân một lượng chính xác khoảng 25 mg Domperidol maleat chuẩn hòa tan trong 100 ml methanol. Hút 1ml pha loãng trong 20ml nước cất. Hút 1ml pha loãng trong 100ml nước cất để được dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 125 µg/ml.
Chuẩn bị các mẫu chuẩn LOR, PSE và IS trong MeOH cụ thể theo bảng sau:
Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR, PSE và IS trong MeOH
Dung dịch Thành phần( pha loãng
theo tỷ lệ thích hợp)
Nồng độ chính xác khoảng
Chuẩn gốc LOR(dd A) LOR cân+ MeOH 250 µg/ml
Chuẩn gốc PSE(dd B) PSE cân + MeOH 250 µg/ml Chuẩn gốc IS (dd C) DOM cân+ MeOH 250 µg/ml
Chuẩn trung gian (ddA1) dd A+ MeOH 1 µg/ml
Chuẩn trung gian (dd B1) dd B+MeOH 50 µg/ml
Chuẩn IS làm việc dd C + H2O 125 ng/ml
Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa LOR và PSE chuẩn theo bảng sau:
Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR và PSE.
Dung dịch Thành phần Nồng độ chính xác khoảng LOR PSE Chuẩn làm việc WS1 0,5 mL dd A1+0,5 ml dd B1, bốc hơi bằng khí nitơ + huyết tương trắng v a đủ 10 ml
50 ng/ml 2500 ng/ml Chuẩn làm việc WS2 0,5 mL dd WS1+ huyết tương trắng v a đủ 10 ml 2,5 ng/ml 125,5 ng/ml
Bảng 2.3.Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn. Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ LOR (ng/ml) 0,2 0,4 1 2 5 15 30 50 Nồng độ PSE (ng/ml) 10 20 50 100 250 750 1500 2500 Thể tích dd WS1 (µl) 0 0 0 0 400 300 600 1000 Thể tích dd WS2 (µl) 80 160 400 800 0 0 0 0 Thể tích huyết tƣơng trắng (µl) 920 840 600 200 900 700 400 0
Chuẩn bị các mẫu kiểm tra (QC)
Chuẩn bị các mẫu QC tự tạo trong huyết tương tương tự như các mẫu chuẩn trên để có được dd WSQC1 nồng độ LOR chính xác khoảng 50 ng/ml, PES khoảng 2500 ng/ml và dd WSQC2 nồng độ LOR 2,5 ng/ml, PSE 125,5 ng/ml. T đây chuẩn bị các mẫu QC như bảng sau:
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC. Mẫu QC Nồng độ LOR (ng/ml) Nồng độ PSE (ng/ml) Thể tích dd WSQC1(µl) Thể tích dd WSQC2(µl) Thể tích huyết tƣơng trắng (µl) LQC 0,6 ng/mL 30 ng/mL 0 240 760 MQC 25 ng/mL 1250 ng/mL 500 0 500 HQC 40 ng/mL 2000 ng/mL 800 0 200
2.4.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích
Sử dụng hệ thống LC-MS/MS loại Triple Quandrupole với nguồn ion hóa kiểu HESI, tiến hành thực nghiệm theo các nội dung sau:
2.4.2.1. Xây dựng điều kiện khối phổ và chuẩn nội.
Tối ưu hóa điều kiện khối phổ: - Kiểu khối phổ: nguồn ion hóa HESI
- Xác định ion mẹ đặc trưng đối với LOR và PSE.
- Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa và bộ phận thấu kính hội tụ ion để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất;
- Xác định mảnh ion con của LOR và PSE có cường độ tín hiệu cao và ổn định;
- Tối ưu điều kiện phân mảnh ion mẹ thành ion con để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất.
Khảo sát lựa chọn chuẩn nội:
Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của chất phân tích tiến hành khảo sát trên Diazepam và Domperidol để lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp. Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia vào quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn, đồng thời tạo được mảnh phổ phù hợp khi phân tích cùng LOR và PSE và có hiệu suất chiết gần tương đương với chất phân tích.
Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ phân tích chuẩn nội để thu được cường độ tín hiệu cao và ổn định.
2.4.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký.
Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của LOR, PSE, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký
- Trên cột Acquity UPLC ® BEH C18 (50mm x 2,1 mm; 1,7 µm); cột Themo hypersil GOLD C18 (50mm x 2,1 mm; 1,9 µm) và cột Shimpark C18 (50mm x 3,0 mm; 2,1 µm).
- Trên các pha động gồm MeCN phối hợp dd amoni acetat hoặc dd acid acetic, MeCN phối hợp dd acid formic theo các tỷ lệ với nồng độ dd acid formic khác nhau.
- Khảo sát với các giá trị tốc độ dòng thay đổi t 100 - 500 µL/phút.
T kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng đồng thời LOR và PSE trong huyết tương trên hệ thống UPLC- MS/MS.
2.4.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.
Dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương, tính chất lý hóa của chất chuẩn và chuẩn nội cùng với điều kiện thực tế, tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu:
Tủa protein với tác nhân gây tủa có thể là acid (acid percloric, acid tricloacetic, acid trifluoroacetic) hoặc các dung môi hữu cơ MeOH và MeCN.
Chiết lỏng – lỏng sử dụng các dung môi Dicloromethan, Diethyl ether, Cloroform và hỗn hợp dung môi Diethyl ether – Cloroform, mẫu được kiềm hóa và không kiềm hóa bằng dd Amoniac 0,1 M.
T kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, tiến hành nhanh, kinh tế và vẫn đảm bảo chiết tách được LOR, PSE và IS với tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu và ổn định.
2.4.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.
2.4.3.1. Độ chọn lọc – đặc hiệu.
Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa LOR và PSE ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu của LOR, PSE và IS.
2.4.3.2. Xác định giới hạn định lượng dưới
Tiến hành phân tích 06 mẫu trắng, 06 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ LOR: 0,2ng/ml, PSE: 10ng/ml). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn, tính nồng độ LOR và PSE có trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày.
Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính t đường chuẩn) với nồng độ thực.
2.4.3.3. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính.
Tiến hành chuẩn bị và phân tích 8 mẫu chuẩn của LOR và PSE trong huyết tương có nồng độ bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính dự kiến (các mẫu S1- S8). Ghi lại sắc đồ và tỷ lệ đáp ứng pic LOR/IS, PSE/IS tại các nồng độ tương ứng, xác định tương quan giữa tỷ lệ đáp ứng pic và nồng độ LOR, PSE có trong mẫu; xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. T phương trình hồi quy đã xây dựng tính lại nồng độ của t ng mẫu, xác định độ đúng của mỗi nồng độ.
2.4.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày.